Name: Isolierung von Gentherapievektoren der nächsten Generation durch Engineering, Barcoding und Screening von Kapsidvarianten des Adeno-assoziierten Virus (AAV) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung neuer AAV-Kapsidvarianten durch Engineering, Barcoding und Hochdurchsatz-Screening für verbesserte Gentherapie. Diese Methode steigert Effizienz und Spezifität bei der Transgenlieferung.

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D.G. freut sich sehr über die Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) durch die DFG-Sonderforschungsbereiche SFB1129 (Projektnummer 240245660) und TRR179 (Projektnummer 272983813) sowie durch das Deutsche Zentrum für Infektionsforschung (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

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<li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li>
<li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li>
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<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li>
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<li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li>
<li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li>
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<li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li>
<li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li>
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<li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li>
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<li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825(2021).</li>
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D.G. ist Mitbegründer der AaviGen GmbH. D.G. und K.R. sind Erfinder einer anhängigen Patentanmeldung im Zusammenhang mit der Erzeugung von immunumgehenden AAV-Kapsidvarianten. Der Rest der Autoren hat nichts zu offenbaren.

In diesem Protokoll werden die Schritte beschrieben, die für das AAV-Kapsid-Engineering für die Peptidanzeige und für das Screening von AAV-Bibliotheken mit Barcodes sowie für die bioinformatische Analyse der Bibliothekszusammensetzung und der Kapsidleistung erforderlich sind. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Schritte, die die bioinformatische Analyse dieser Art von Bibliotheken erleichtern, da die meisten virologischen Laboratorien in ihren Programmierkenntnissen hinterherhinken, um ihren Kenntnissen in moleku...

Gentransfertherapie ist die Einführung von genetischem Material in Zellen, um das zelluläre genetische Material zu reparieren, zu ersetzen oder zu verändern, um Krankheiten vorzubeugen, zu behandeln, zu heilen oder zu verbessern. Der Gentransfer, sowohl in vivo als auch ex vivo, beruht auf unterschiedlichen Verabreichungssystemen, nicht-viralen und viralen. Viren haben sich auf natürliche Weise entwickelt, um ihre Zielzellen effizient zu transduzieren, und können als Liefervektoren verwendet werden. Unter den verschiedenen Arten von viralen Vektoren, die in der Gentherapie eingesetzt werden, werden zunehmend Adeno-assoziierte Viren verwendet, da sie nicht pathogen sind, Sicherheit, geringe Immunogenität und vor allem ihre Fähigkeit, eine langfristige, nicht integrierende Expression aufrechtzuerhalten 1,2,3. Die AAV-Gentherapie hat in den letzten zehn Jahren beachtliche Erfolge erzielt. drei Therapien wurden von der Europäischen Arzneimittel-Agentur und der US-amerikanischen Food and Drug Administration für die Anwendung beim Menschen zugelassen 3,4. Mehrere klinische Studien sind auch im Gange, um eine Vielzahl von Krankheiten wie Hämophilie, Muskel-, Herz- und neurologische Erkrankungen zu behandeln, wie an anderer Stelle beschrieben3. Trotz jahrzehntelanger Fortschritte hat der Bereich der Gentherapie in den letzten Jahren eine Reihe von Rückschlägen erlitten4, vor allem Todesfälle in klinischen Studien5, die aufgrund dosislimitierender Toxizitäten auf Eis gelegt wurden, insbesondere für Gewebe, die massiv sind, wie z. B. Muskeln, oder schwer zu erreichen, wie z. B. Gehirn6.
Die AAV-Vektoren, die derzeit in klinischen Studien verwendet werden, gehören mit wenigen Ausnahmen zu den natürlichen Serotypen1. AAV-Engineering bietet die Möglichkeit, Vektoren mit überlegener Organ- oder Zellspezifität und Effizienz zu entwickeln. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden verschiedene Ansätze erfolgreich angewendet, wie z. B. Peptid-Display, Loop-Swap, Kapsid-DNA-Shuffling, fehleranfällige PCR und gezieltes Design, um einzelne AAV-Varianten oder Bibliotheken davon mit unterschiedlichen Eigenschaften zu generieren7. Diese werden dann mehreren Runden der gerichteten Evolution unterzogen, um die darin enthaltenen Varianten mit den gewünschten Eigenschaften auszuwählen, wie an anderer Stelle 1,3 beschrieben. Von allen Kapsid-Evolutionsstrategien sind Peptid-Display-AAV-Bibliotheken aufgrund einiger einzigartiger Eigenschaften am weitesten verbreitet: Sie sind relativ einfach zu generieren und können eine hohe Diversität und eine Hochdurchsatz-Sequenzierung erreichen, die es ermöglicht, ihre Evolution zu verfolgen.
Die ersten erfolgreichen Peptidinsertions-AAV-Bibliotheken wurden vor fast 20 Jahren beschrieben. In einem der ersten konstruierten Perabo et al.8 eine Bibliothek modifizierter AAV2-Kapside, in der ein Pool zufällig generierter Oligonukleotide in ein Plasmid an einer Position eingefügt wurde, die der Aminosäure 587 des VP1-Kapsidproteins entspricht, und zwar in der dreifachen Achse, die aus dem Kapsid herausragt. Unter Verwendung einer Adenovirus-Koinfektion wurde die AAV-Bibliothek durch mehrere Selektionsrunden entwickelt, und es wurde gezeigt, dass die endgültigen Re-Targeting-Varianten in der Lage sind, Zelllinien zu transduzieren, die refraktär auf das elterliche AAV28 sind. Kurz darauf führten Müller et al.9 das zweistufige System für die Bibliotheksproduktion ein, eine deutliche Verbesserung des Protokolls. Zunächst wird die Plasmidbibliothek zusammen mit einem adenoviralen Helferplasmid verwendet, um eine AAV-Bibliothek zu erzeugen, die chimäre Kapside enthält. Diese AAV-Shuttle-Bibliothek wird verwendet, um Zellen mit geringer Infektionsvielfalt (MOI) zu infizieren, mit dem Ziel, ein virales Genom pro Zelle einzuführen. Die Koinfektion mit dem Adenovirus gewährleistet die Produktion von AAVs mit einem übereinstimmenden Genom und Kapsid9. Etwa ein Jahrzehnt später nutzte Dalkara10 die in vivo gerichtete Evolution, um die 7m8-Variante zu schaffen. Diese Variante hat eine 10-Aminosäure-Insertion (LALGETTRPA), von denen drei als Linker fungieren, und zielt nach intravitrealer Injektion effizient auf die äußere Netzhautab 10. Dieses technisch hergestellte Kapsid ist eine außergewöhnliche Erfolgsgeschichte, da es eines der wenigen künstlich hergestellten Kapside ist, das es bisher in die Klinik geschafft hat11.
Einen zweiten Schub erlebte das Feld mit der Einführung von Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS). Zwei Veröffentlichungen von Adachi et al.12 aus dem Jahr 2014 und von Marsic et al.13 aus dem Jahr 2015 zeigten die Leistungsfähigkeit von NGS, die Verteilung von barcodierten AAV-Kapsidbibliotheken mit hoher Genauigkeit zu verfolgen. Einige Jahre später wurde das NGS der barcodierten Regionen an die Peptidinsertionsregion angepasst, um die Kapsidentwicklung zu verfolgen. Körbelin et al.14 führten ein NGS-gesteuertes Screening durch, um ein pulmonales AAV2-basiertes Kapsid zu identifizieren. Die NGS-Analyse half bei der Berechnung von drei Bewertungswerten: dem Anreicherungswert zwischen den Selektionsrunden, dem allgemeinen Spezifitätswert zur Bestimmung der Gewebespezifität und schließlich dem kombinierten Wert14. Das Gradinaru-Labor15 veröffentlichte im selben Jahr das Cre-Rekombinations-basierte AAV-Targeted-Evolutionssystem (CREATE), das eine zelltypspezifische Selektion ermöglicht. In diesem System trägt die Kapsidbibliothek einen Cre-invertierbaren Schalter, da das polyA-Signal von zwei loxP-Stellen flankiert wird. Die AAV-Bibliothek wird dann in Cre-Mäuse injiziert, wobei das polyA-Signal nur in Cre+-Zellen invertiert wird, was die Vorlage für die Bindung eines Reverse-PCR-Primers an den Forward-Primer innerhalb des Kapsidgens liefert. Diese hochspezifische PCR-Rettung ermöglichte die Identifizierung des AAV-PHP. B-Variante, die die Blut-Hirn-Schranke überwinden kann15. Dieses System wurde zu M-CREATE (Multiplexed-CREATE) weiterentwickelt, bei dem NGS und die Generierung synthetischer Bibliotheken in die Pipeline16 integriert wurden.
Eine verbesserte RNA-basierte Version dieses Systems aus dem Maguire-Labor17, iTransduce, ermöglicht die Selektion auf DNA-Ebene von Kapsiden, die Zellen funktionell transduzieren und ihre Genome exprimieren. Das virale Genom der Peptid-Display-Bibliothek besteht aus einem Cre-Gen unter der Kontrolle eines ubiquitären Promotors und dem Kapsidgen unter der Kontrolle des p41-Promotors. Die Bibliothek wird Mäusen injiziert, die eine loxP-STOP-loxP-Kassette stromaufwärts von tdTomato haben. Zellen, die mit AAV-Varianten transduziert wurden, die das virale Genom und damit Cre exprimieren, exprimieren tdTomato und können in Kombination mit Zellmarkern sortiert und selektiert werden17. In ähnlicher Weise stellten Nonnenmacher et al.18 und Tabebordbar et al.19 die Kapsidgenbibliothek unter die Kontrolle gewebespezifischer Promotoren. Nach der Injektion in verschiedene Tiermodelle wurde virale RNA verwendet, um die Kapsidvarianten zu isolieren.
Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung von Barcoding zum Markieren von Kapsidbibliotheken. Das Björklund-Labor20 nutzte diesen Ansatz für Barcode-Peptid-Insertionskapsidbibliotheken und entwickelte die barcoded rationale AAV-Vektorevolution (BRAVE). In einem Plasmid wird die Rep2Cap-Kassette neben einem ITR-flankierten, gelb fluoreszierenden Protein (YFP)-exprimierenden, Barcode-markierten Transgen kloniert. Unter Verwendung von loxP-Stellen zwischen dem Ende der Kappe und dem Anfang des Barcodes erzeugt eine in vitro Cre-Rekombination ein Fragment, das klein genug für NGS ist, wodurch die Assoziation der Peptidinsertion mit dem eindeutigen Barcode ermöglicht wird (Look-up-Tabelle, LUT). Die AAV-Produktion wird unter Verwendung der Plasmidbibliothek durchgeführt, und die in der mRNA exprimierten Barcodes werden nach der In-vivo-Anwendung erneut mit NGS20 gescreent. Wenn die Kapsidbibliotheken Varianten des gesamten Kapsidgens enthalten (d. h. gemischte Bibliotheken), muss eine Long-Read-Sequenzierung verwendet werden. Mehrere Gruppen haben Barcodes verwendet, um diese verschiedenen Bibliotheken zu kennzeichnen, was NGS eine höhere Lesetiefe ermöglicht. Das Kay Lab21 markierte sehr unterschiedliche Kapsid-gemischte Bibliotheken mit Barcodes , die dem Cap-PolyA-Signal nachgeschaltet waren. In einem ersten Schritt wurde eine barcodierte Plasmidbibliothek generiert und die gemischte Kapsidgenbibliothek in diese kloniert. Dann wurde eine Kombination aus MiSeq (Short Read, höhere Lesetiefe) und PacBio (Long Read, niedrigere Lesetiefe) NGS sowie Sanger-Sequenzierung verwendet, um ihre LUT21 zu generieren. Im Jahr 2019 beschrieben Ogden und seine Kollegen aus dem Church-Labor22 die AAV2-Kapsideignung für mehrere Funktionen mithilfe von Bibliotheken, die in jeder Position Einzelpunktmutationen, Insertionen und Deletionen aufwiesen, was letztendlich ein maschinengeführtes Design ermöglichte. Für die Generierung der Bibliothek wurden kleinere Fragmente des Kapsidgens synthetisiert, mit einem Barcode markiert, sequenziert und dann in das vollständige Kapsidgen kloniert. Die NGS-Daten wurden verwendet, um eine LUT zu generieren. Die Bibliothek wurde dann nur mit den Barcodes und der Short-Read-Sequenzierung gescreent, was wiederum eine höhere Lesetiefe22 ermöglicht.
Barcode-Bibliotheken wurden überwiegend verwendet, um einen Pool bekannter, natürlicher und technisch entwickelter Varianten nach mehreren Auswahlrunden von Kapsidbibliotheken oder unabhängig von einer Kapsidentwicklungsstudie zu überprüfen. Der Vorteil solcher Bibliotheken ist die Möglichkeit, mehrere Kapside zu screenen und gleichzeitig die Anzahl der Tiere zu reduzieren und die Variation zwischen den Tieren zu minimieren. Die ersten Studien, die diese Technologie in den AAV-Bereich einführten, wurden vor fast einem Jahrzehnt veröffentlicht. Das Nakai-Labor 12 markierte 191 Doppel-Alanin-Mutanten, die die Aminosäuren 356 bis 736 auf dem VP1 von AAV9 mit einem Paar 12-Nukleotid-Barcodes abdecken. Unter Verwendung von NGS wurde die Bibliothek in vivo auf Galaktosebindung und andere Eigenschaften untersucht12. Marsic und Kollegen beschrieben die Bioverteilung von AAV-Varianten mit Hilfe einer Doppel-Barcord-Analyse 1 Jahr später13. Eine neuere Studie an nichtmenschlichen Primaten verglich die Bioverteilung von 29 Kapsiden im Zentralnervensystem auf verschiedenen Verabreichungswegen23. Unser Labor hat kürzlich barcodierte AAV-Bibliotheksbildschirme von 183 Varianten veröffentlicht, die natürliche und technisch hergestellte AAVs enthielten. Diese Screenings auf DNA- und RNA-Ebene führten zur Identifizierung einer hochgradig myotropen AAV-Variante24 bei Mäusen sowie anderen, die eine hohe Zelltypspezifität im Mäusegehirn aufwiesen25.
Hier beschreiben wir die in dieser Arbeit verwendete Methodik und erweitern sie um das Screening von AAV-Peptid-Display-Bibliotheken. Dies umfasst die Generierung von AAV2-Peptid-Display-Bibliotheken, eine digitale Tröpfchen-PCR-Methode (dd-PCR) zur Quantifizierung und schließlich eine NGS-Pipeline zur Analyse der AAV-Varianten, die zum Teil auf der Arbeit von Weinmann und Kollegen24 basiert. Schließlich wird eine Beschreibung der Generierung von barcodierten AAV-Bibliotheken und der NGS-Pipeline bereitgestellt, die in derselben Publikation verwendet wird.

<table><tbody><tr><td>Amplifikationsprimer</td><td>ELLA Biotech (München, Deutschland)</td><td>-</td><td>Zweitstrangsynthese des Oligonukleotid-Inserts</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reagenzien</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>5067-1504</td><td>Validierung von DNA-Fragmenten</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>G2938C</td><td>Validierung von DNA-Fragmenten</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Bausatz&nbsp;</td><td>Qiagen (Venlo, Niederlande)</td><td>80204</td><td>DNA/RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reagenzien</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>5067-1504</td><td>NGS Vorbereitung der Bibliothek</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer System</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>G2938C</td><td>NGS Vorbereitung der Bibliothek</td></tr><tr><td>BC-seq fw:&nbsp;</td><td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td><td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&nbsp;</td><td>Vorbereitung der NGS-Bibliothek</td></tr><tr><td>BC-seq rv:&nbsp; &nbsp;</td><td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td><td>ggctggcaactagaaggcacaca&nbsp;</td><td>Vorbereitung der NGS-Bibliothek</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td><td>44-420-3250 ML</td><td>DNA/RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>BglI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>R0143</td><td>Aufschluss eines doppelsträngigen Einsatzes</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1851196</td><td>dd-PCR Cycler</td></tr><tr><td>dNTPS&nbsp;</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>N0447S</td><td>NGS Vorbereitung der Bibliothek</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix für Sonden (ohne dUTP)</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1863024</td><td>dd-PCR Supermix</td></tr><tr><td>Tröpfchenerzeugungsöl für Sonden</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1863005</td><td>dd-PCR Tröpfchenerzeugungsöl</td></tr><tr><td>DG8 Kartuschen für QX100 / QX200 Tröpfchengenerator</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1864008</td><td>dd-PCR Tröpfchengenerierung Kartusche</td></tr><tr><td>DG8 Kartuschenhalter</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1863051</td><td>dd-PCR Kartuschenhalter</td></tr><tr><td>Tröpfchengenerator DG8 Dichtung</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1863009</td><td>dd-PCR Abdeckung für Kartusche</td></tr><tr><td>ddPCR Platten 96-Well, Semi-Skirted</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>12001925</td><td>dd-PCR 96-Well-Platte</td></tr><tr><td>E.cloni 10G SUPREME Elektrokompetent Zellen</td><td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td><td>60081-1</td><td>Elektrokompetente Zellen</td></tr><tr><td>Elektroporationsküvetten, 1mm</td><td>Biozym Scientific (Oldendorf, Deutschland)</td><td>748050</td><td>Elektroporation</td></tr><tr><td>GAPDH Primer/Sondenmischung</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>Mm00186825_cn</td><td>Taqman qPCR Primer</td></tr><tr><td>Genepulser Xcell</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1652660</td><td>Elektroporation</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transkription Kit</td><td>Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)</td><td>4368814</td><td>cDNA reverse Transkription</td></tr><tr><td>ITR_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR Primer</td></tr><tr><td>ITR_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR-Primer</td></tr><tr><td>ITR_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR-Sonde</td></tr><tr><td>Illumina NextSeq 500 System</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td><td>SY-415-1001</td><td>NGS-Bibliothek </td></tr><tr><td>Sequenzierung KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td><td>Roche AG (Basel, Schweiz)</td><td>KK2600 07958919001</td><td>NGS Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>MagnaBot 96 Magnetic Separation Device</td><td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td><td>V8151</td><td>Probenvorbereitung für NGS-Bibliothek</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>ND-2000</td><td>Aufschluss von doppelsträngigem Einsatz</td></tr><tr><td>NGS_frw</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td><td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td><td>NGS Primer</td></tr><tr><td>NGS_rev</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td><td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td><td>NGS Primer</td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 Zyklen)</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td><td>FC-404-2005</td><td>NGS Library Sequencing</td></tr><tr><td>Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit&nbsp;</td><td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)</td><td>9092-256</td><td>NGS Vorbereitung</td></tr><tr><td>der Bibliothek PX1 Plattenversiegelung</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1814000</td><td>dd-PCR Plattenversiegelung</td></tr><tr><td>Durchstechbare Folie Heißsiegel</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1814040</td><td>dd-PCR Versiegelungsfolie</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>F530S</td><td>Zweitstrangsynthese des Oligonukleotideinsatzes</td></tr><tr><td>PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimin Hydrochlorid (MW 40.000)</td><td>Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)</td><td>24765-1G</td><td>AAV-Bibliotheksvorbereitung</td></tr><tr><td>ProNex Size-Selective Purification System</td><td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td><td>NG2002</td><td>Probenvorbereitung für NGS-Bibliothek</td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II Polymerase&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>F549L</td><td>NGS Vorbereitung der Bibliothek</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche AG (Basel, Schweiz)</td>5963117103 <td>DNA/RNA-Extraktion</td><td></td></tr> <tr><td>pRep2Cap2_PIS</td><td></td><td></td><td>ITR-Rep2Cap2-ITR-Vektor. Peptid-Insertionsstelle im Cap2 ORF, hergestellt/vorbereitet im Labor&nbsp;</td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchengenerator</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1864002</td><td>dd-PCR Tröpfchengenerator</td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchen-Reader</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1864003</td><td>dd-PCR Tröpfchenanalyse</td></tr><tr><td>QIAquick Nukleotidentfernungskit</td><td>Qiagen (Venlo, Niederlande)</td><td>28306</td><td>Zweitstrangsynthese der Oligonukleotid-Insert-Reinigung</td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen (Venlo, Niederlande)</td><td>28704</td><td>Aufreinigung von Plasmidvektoren</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Niederlande)</td><td>12162</td><td>DNA-Vorbereitung von Plasmidbibliotheken</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen (Venlo, Niederlande)</td><td>28104</td><td>Probenvorbereitung für NGS-Bibliothek</td></tr><tr><td>Qubit-Fluorometer</td><td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td><td>Q32857</td><td>Vorbereitung von NGS-Bibliotheken</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>Q32851</td><td>NGS Bibliotheksvorbereitung</td></tr><tr><td>QuantiFast PCR Master Mix</td><td>Qiagen (Venlo, Niederlande)</td><td>1044234</td><td>Taqman qPCR</td></tr><tr><td>rep_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td><td>dd-PCR Primer</td></tr><tr><td>rep_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>CAATCACGGCGCACATGT</td><td>dd-PCR Primer</td></tr><tr><td>rep_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td><td>dd-PCR-Sonde</td></tr><tr><td>RNase-freie DNase</td><td>Qiagen (Venlo, Niederlande)</td><td>79254</td><td>DNA/RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>R0123</td><td>Verdau eines Vektors</td></tr><tr><td>5 mm, Stahl Beads</td><td>Qiagen (Venlo, Niederlande)</td><td>69989</td><td>DNA/RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>TRIMER-Oligonukleotide</td><td>ELLA Biotech (München, Deutschland)</td>-<td>Entartete Oligonukleotid-T4-Ligase</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>M0202L</td><td>Plasmid-Bibliotheksligation</td></tr><tr><td>TissueLyserLT</td><td>Qiagen (Venlo, Niederlande)</td><td>85600</td><td>DNA/RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>YFP_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td><td>dd-PCR-Primer</td></tr><tr><td>YFP_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td><td>dd-PCR-Primer</td></tr><tr><td>YFP_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td><td>dd-PCR-Sonde</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (mit Deckel)</td><td>Zymo research (Irvine, CA, USA)</td><td>D4013</td><td>Vektor- und Ligationsreinigung</td></tr></tbody></table>

isolierung von gentherapievektoren der nächsten generation durch engineering, barcoding und screening von kapsidvarianten des adeno-assoziierten virus (aav)

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Genübertragungsvektoren, die vom Adeno-assoziierten Virus (AAV) abgeleitet sind, sind eines der vielversprechendsten Werkzeuge für die Behandlung genetischer Krankheiten, was durch ermutigende klinische Daten und die Zulassung mehrerer AAV-Gentherapien belegt wird. Zwei Hauptgründe für den Erfolg von AAV-Vektoren sind (i) die vorherige Isolierung verschiedener natürlich vorkommender viraler Serotypen mit unterschiedlichen Eigenschaften und (ii) die anschließende Etablierung leistungsfähiger Technologien für ihr molekulares Engineering und ihre Wiederverwendung im Hochdurchsatz. Das Potenzial dieser Techniken wird durch kürzlich implementierte Strategien zur Barcodierung ausgewählter AAV-Kapside auf DNA- und RNA-Ebene weiter gesteigert, die eine umfassende und parallele In-vivo-Stratifizierung in allen wichtigen Organen und Zelltypen eines einzigen Tieres ermöglichen. Hier stellen wir eine grundlegende Pipeline vor, die diese Reihe komplementärer Wege umfasst und die AAV-Peptidanzeige verwendet, um das vielfältige Arsenal der verfügbaren Kapsid-Engineering-Technologien darzustellen. Dementsprechend beschreiben wir zunächst die entscheidenden Schritte für die Generierung einer AAV-Peptid-Display-Bibliothek für die In-vivo-Auswahl von Kandidaten mit den gewünschten Eigenschaften, gefolgt von einer Demonstration, wie die interessantesten Kapsidvarianten für das sekundäre In-vivo-Screening mit einem Barcode versehen werden können. Als nächstes veranschaulichen wir die Methodik für die Erstellung von Bibliotheken für Next-Generation-Sequencing (NGS), einschließlich Barcode-Amplifikation und Adapterligation, bevor wir mit einem Überblick über die kritischsten Schritte während der NGS-Datenanalyse schließen. Da die hier berichteten Protokolle vielseitig und anpassungsfähig sind, können Forscher sie leicht nutzen, um die optimalen AAV-Kapsidvarianten in ihrem bevorzugten Krankheitsmodell und für Gentherapieanwendungen anzureichern.

Generierung einer AAV2-Peptid-Display-Bibliothek. Als erster Schritt zur Selektion von künstlich hergestellten AAVs wird die Generierung einer Plasmidbibliothek beschrieben. Der Peptideinsatz wird unter Verwendung von entarteten Primern hergestellt. Die Reduzierung der Kombination von Codons bei 64 auf 20 hat den Vorteil, dass Stoppcodons eliminiert und die NGS-Analyse erleichtert werden, indem die Bibliotheksvielfalt auf DNA-, aber nicht auf Proteinebene verringert wird. Das Oligonukleotid-Insert wird ...

Generierung von AAV-Peptid-Display-Bibliotheken und anschließende Validierung durch Barcoding von Kandidaten mit neuartigen Eigenschaften für die Erstellung von AAVs der nächsten Generation.

Isolierung von Gentherapievektoren der nächsten Generation durch Engineering, Barcoding und Screening von Kapsidvarianten des Adeno-assoziierten Virus (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Dieses Protokoll schließt eine bedeutende Lücke zwischen der natürlichen Evolution von Viren und ihrer Verwendung als rekombinante Vektoren für die menschliche Gentherapie, indem es ihre Entwicklung, Diversifizierung und Stratifizierung ermöglicht. Diese Technik ermöglicht das parallele Hochdurchsatz-Screening auf neuartige, isolierte oder gentechnisch hergestellte Adeno-assoziierte Virusvarianten, kurz AAV-Varianten, wodurch Tierzahlen, Arbeit, Kosten und Zeit eingespart werden. Die identifizierten AVV-Kapsidvarianten können die Wirksamkeit und Spezifität der AAV-basierten Verabreichung von therapeutischen Transgenen erhöhen und dadurch die erforderliche Virusdosis reduzieren.Dies könnte die Sicherheit und Anwendbarkeit der Gentherapie verbessern. Derselbe Ansatz könnte auch für das Kapsid- oder Promotor-Engineering anderer Gentransportvehikel verwendet werden, was unser Verständnis ihrer Biologie und ihrer Verwendung in der Gentherapie verbessert. An der Demonstration des Verfahrens beteiligen sich die Doktoranden Jonas Becker und Jixin Liu, die Postdoktorandin Joanna Szumska und Margarita Zayas sowie die wissenschaftlichen Mitarbeiterinnen Emma Gerstmann und Ellen Widtke aus meinem Labor.Beginnen Sie mit der Analyse der NGS-Sequenzierungsdaten mit Python 3 und Biopython. Die NGS-Analyse besteht aus zwei Schritten. Durchsuchen Sie im ersten Schritt die Sequenzdateien nach Sequenzen, die bestimmte Kriterien erfüllen, z. B. flankierende Sequenzen, Länge und Position mithilfe von Skript eins und einer Konfigurationsdatei, die die erforderlichen Informationen enthält.Für den zweiten Schritt übersetzen Sie die extrahierten Sequenzen beginnend mit der AGWGGC-Sequenz mit Skript Nummer zwei und der Konfiguration und Zuordnung. txt-Dateien, die die benötigten Informationen bereitstellen. Bereiten Sie zwei Ordner vor: Skript und Daten.Kopieren Sie die Gzip-komprimierten Dateien, die sich aus der Sequenzierung ergeben, in den Datenordner. Kopieren Sie dann die Python- und Konfigurationsdateien in den Skriptordner, wie im Textmanuskript beschrieben. Öffnen Sie vor dem Ausführen der Skripte die Zuordnung.txt-Datei und fügen Sie zwei durch Tabulatoren getrennte Spalten hinzu. Geben Sie die Namen der Gzip-Dateien in Spalte eins und den gewünschten endgültigen Namen in Spalte zwei ein. Ändern Sie die Variablen in der Konfigurationsdatei, wie im Textmanuskript beschrieben.Starten Sie mit dem spezifischen Befehl die Erkennung und Extraktion von Variantensequenzen. Die Ausgabe sind TXT-Dateien mit den extrahierten DNA-Sequenzen und deren Anzahl der Lesevorgänge. Der Header dieser Datei enthält statistische Daten, die in die folgenden Dateien übertragen werden.Diese TXT-Daten sind die Eingabedatei für Skript Nummer zwei, in dem die DNA-Sequenzen übersetzt, eingestuft und analysiert werden. Starten Sie mit dem spezifischen Befehl die PV-Übersetzung und Analyse der Textausgabedateien des ersten Skripts, wie im Textmanuskript beschrieben. Die Ausgabedateien von Skript Nummer zwei werden in der zweiten Spalte der Nachschlagetabelle in zuordnung benannt.txt mit Erweiterungen, die auf der Art der Analyse basieren. Stellen Sie sicher, dass die drei Ausgabedateien statistische Daten in den ersten Zeilen und eine erste Spalte mit dem Index jeder DNA-Sequenz aus den Eingabetextdateien enthalten. Die verbleibenden Spalten sollten aus der DNA-Sequenz, der Anzahl der Lesevorgänge, dem Vorwärts- oder Rückwärtslesen und der translatierten Peptidsequenz bestehen.Die ungültigen Sequenzen sollten NA haben und in den letzten beiden Spalten ungültig sein. Visualisieren Sie die Ausgabedateien mit verfügbarer Software basierend auf den Bedürfnissen des Benutzers. Um die Analyse der NGS-Sequenzierungsdaten mit benutzerdefiniertem Code in Python 3 durchzuführen, umfasst der Workflow die Erkennung von Barcode-Sequenzen, die durch flankierende Sequenzen geführt werden, deren Länge und Position sowie die Analyse der Barcode-Anreicherung und -Verteilung über den Satz von Geweben.Bereiten Sie zwei Ordner vor: Skript und Daten. Kopieren Sie die Gzip-komprimierten Dateien, die sich aus der Sequenzierung ergeben, in den Datenordner. Kopieren Sie dann die Python- und Konfigurationsdateien in den Skriptordner, wie im Textmanuskript beschrieben.Erstellen Sie vor dem Ausführen des Skripts zwei tabulatorgetrennte Textdateien: die Kapsidvarianz. txt-Datei mit den Barcode-Sequenzen, die den Namen der AAV-Kapsidvariante zugewiesen sind, und der Kontamination. TXT-Datei mit Barcode-Sequenzen, die von einer möglichen Kontamination herrühren.Bearbeiten Sie schließlich die Konfigurationsdatei, um die Informationen des Pfads zum Ordner mit Sequenzierungsdaten, die Reihenfolge der flankierenden Bereiche der Barcodes, ihre Position und die Fenstergröße für die Barcode-Erkennung aufzunehmen. Führen Sie das Barcode-Erkennungsskript mit den bereitgestellten Pfaden und Konfigurationsdateien mit dem entsprechenden Befehl aus. Die Ausgabe dieser Befehlsausführung sind TXT-Dateien mit Nachzählungen pro Kapsidvariante und der Gesamtzahl der aus den Rohdaten wiederhergestellten Lesevorgänge.Zur Beurteilung der Verteilung von barcodiertem AAV-Kapsid unter Geweben oder Organen in der Zuordnung. TXT-Datei, weisen Sie den Namen jeder Textdatei, die aus dem Barcode-Erkennungslauf erhalten wird, einem Gewebe- oder Organnamen zu. Fügen Sie die Namen der Textdateien in der ersten Spalte und die entsprechenden Gewebe- oder Organnamen in der durch Trennzeichen getrennten Zuordnung hinzu.Erstellen Sie ein Organ. TXT-Datei mit der Liste der Namen für On- und Off-Target-Organe, die den in der Zuordnung angegebenen Namen entsprechen. txt-Datei.Erstellen Sie dann normalization_organ. txt und normalization_variant. Durch txt getrennte Textdateien mit normalisierten Werten für alle Kapsidvarianten und alle Organe und Gewebe.In der ersten Spalte mit dem normalization_organ. txt-Datei, schreiben Sie die Namen für jedes Organ und die zweite Spalte mit Normalisierungswerten für das entsprechende Gewebe. Füllen Sie die erste Spalte des normalization_variant.TXT-Datei mit der Liste der Kapsidnamen und der zweiten Spalte mit den normalisierten Werten der Leseanzahl für jedes Kapsid in der gepoolten Bibliothek. Bearbeiten Sie die Konfigurationsdatei, indem Sie die vollständigen Pfade zu allen zusätzlichen Dateien angeben, und führen Sie das Barcode-Analyseskript mit diesem speziellen Befehl aus. Das Barcode-Analyseskript gibt mehrere Dateien aus, z. B. die Textdateien mit relativen Konzentrations- oder RC-Werten der Kapsidverteilung in verschiedenen Geweben basierend auf mehreren zuvor beschriebenen Normalisierungsschritten und die Tabellenkalkulationsdatei, die Textdateidaten zu zusammengeführten Matrixdaten kombiniert.Visualisieren Sie die Daten und führen Sie eine Clusteranalyse der Matrixdaten durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Das Skript gibt die relative Konzentration ein. XLS-Dateien und generieren zwei Diagramme der hierarchischen Cluster-Heatmap und der Hauptkomponentenanalyse.Um Plots oder PNG-Parameter zu ändern, öffnen Sie das R-Skript und befolgen Sie die Anweisungen im Kommentarbereich. Die quantifizierten Regionen des AAV2-Rep-Gens zeigten, dass 99,2% positiv für ITR waren, was darauf hindeutet, dass die AAV-Kapside das gesamte virale Genom enthielten. In allen drei Sätzen machten die extrahierten Lesevorgänge basierend auf bibliotheksspezifischen Signatursequenzen etwa 94 % der gesamten Lesevorgänge aus, was auf eine gute Qualität hinweist.Davon waren mehr als 99 % gültige PV-Lesevorgänge und über 99 % der gültigen PV-Lesevorgänge eindeutig, was darauf hindeutet, dass die Bibliothek mit hoher interner Diversität ausbalanciert war. Die beiden Hauptzweige der Heatmap-Hierarchie spiegelten den Unterschied in der Transduktionseffizienz von Kapsidvarianten wider. Der linke Ast mit der Mehrzahl der Kapsidvarianten umfasste alle Kapside, die in den meisten Geweben einen hohen relativen Konzentrationswert aufwiesen.Abgesehen von einer auffallend hohen Leberspezifität zeigten drei weitere Kapside Spezifität im Zwerchfell, in der Skelettmuskulatur, im Bizeps und im Gehirn. Der rechte Zweig der hierarchischen Clusterbildung umfasste die Kapsidvarianten mit insgesamt geringerer Transduktionseffizienz, die am deutlichsten im Zwölffingerdarm und in der Bauchspeicheldrüse zu beobachten war. Die Hauptkomponentenanalyse für die ursprüngliche Untergruppe bildet den Cluster der Kapsidvarianten mit hoher Leberspezifität und skizziert den herausragenden Muskeltropismus des VAR60-Kapsids.Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, müssen Sie auf Tippfehler achten. Die Syntax unterscheidet sich auch, wenn Sie die Windows-Eingabeaufforderung im Vergleich zu Linux verwenden. Nach der Identifizierung neuer AAV-Varianten muss das therapeutische und translationale Potenzial in einem verstorbenen oder größeren Tiermodell überprüft werden.Diese Technik ermöglicht einen direkten direkten direkten Vergleich von AAV-Varianten unter identischen Bedingungen und ist äußerst vielseitig einsetzbar und ebnet den Weg für ihre Übertragung in große Tiere oder sogar in Menschen.

isolation-next-generation-gene-therapy-vectors-through-engineering

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir zeigen die grundlegende Technik zur molekularen konstruieren und zu entwickeln synthetischen Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren für die Gentherapie durch DNA-Shuffling Familie. Darüber hinaus bieten wir allgemeine Richtlinien und repräsentative Beispiele für die Auswahl und Analyse der einzelnen chimären Kapside mit verbesserten Eigenschaften auf Ziel-Zellen in Kultur oder in der Maus.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für die Gentherapie über DNA-Familie Shuffling

Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Strategie zu produzieren, Titer und Qualitätskontrolle Chargen von Adeno-assoziierten Virus-Vektoren. Es ermöglicht dem Benutzer, eine Vektor-Vorbereitung mit hoher Titer zu erhalten (≥1 x 1013 Vektor Genome/mL) und eine hohe Reinheit, in Vitro oder in Vivo einsatzbereit.

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Hier bieten wir ein detailliertes Verfahren für die großtechnische Produktion von AAV-Vektoren in Forschungsqualität unter Verwendung von adhärenten HEK 293-Zellen, die in Zellstapeln gezüchtet wurden, und affinitätschromatographischer Aufreinigung. Dieses Protokoll liefert konsistent &gt;1 x 1013 Vektorgenomen/ml und liefert Vektormengen, die für Großtierstudien geeignet sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung und Validierung guter Laborpraktiken bei der konformen Detektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in menschlichen Tränen durch digitale Polymerase-Tröpfchenkettenreaktion zur Unterstützung der klinischen Entwicklung von Gentherapievektoren vor.

Ein validierbarer digitaler Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktions-Assay für den Nachweis von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in Bioshedding-Studien an Tränen

Das rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV) wird häufig für die klinische und präklinische Genverabreichung eingesetzt. Eine unterschätzte Anwendung für rAAVs ist die robuste Transduktion von kultivierten Zellen, ohne dass eine Aufreinigung erforderlich ist. Für Forscher, die neu in der rAAV sind, stellen wir ein Protokoll für das Klonen von Transgenkassetten, die Produktion von Rohvektoren und die Transduktion von Zellkulturen zur Verfügung.

Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Adeno-assoziiertes Virus wird in Suspensionszellkultur hergestellt und durch doppelte Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Es sind Schritte enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Virusausfällungen zu verringern und das endgültige Virusprodukt weiter zu konzentrieren. Die erwarteten Endtiter erreichen 10bis 12 Viruspartikel/ml und sind für die präklinische In-vivo-Anwendung geeignet.

Herstellung und Aufreinigung von Suspensionskulturen von Adeno-assoziierten Viren durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation für In-vivo-Anwendungen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Reinigung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren unter Verwendung einer optimierten Heparin-basierten Affinitätschromatographie-Methode. Es stellt einen einfachen, skalierbaren und kostengünstigen Ansatz dar, der die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation eliminiert. Die daraus resultierenden Vektoren weisen eine hohe Reinheit und biologische Aktivität auf, was ihren Wert in präklinischen Studien unter Beweis stellt.

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Da sich das Gebiet der Gentherapie ständig weiterentwickelt, besteht ein wachsender Bedarf an innovativen Methoden, die diese Herausforderungen bewältigen können. Hier wird eine einzigartige Methode vorgestellt, die den Prozess der Generierung von hochreinen und hochreinen AAV-Vektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform rationalisiert und die Qualitätsstandards für In-vivo-Studien erfüllt.

Ein optimiertes und standardisiertes Verfahren zur Generierung von hochtiternden, qualitativ hochwertigen Adeno-assoziierten Virusvektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform

Die genaue Quantifizierung von Vektorgenomkopien des Adeno-assoziierten Virus (AAV) ist von entscheidender Bedeutung, aber ein standardisiertes Protokoll muss noch etabliert werden. Dieses Protokoll beschreibt eine validierte Methode zur Aufbereitung gereinigter AAV-Proben und zur Durchführung einer digitalen Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (dd_PCR), um den viralen Genomtiter zuverlässig zu quantifizieren.

Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Herstellung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen (MSC)-abgeleiteten extrazellulären Vesikelbiomimetika für die Gentherapie einzuführen. Das Nanovesikel ist mit MSC-abgeleiteten Lipid-Doppelschichten eingeschlossen und kapselt rekombinante AAVs, die das relevante Gen im Lumen tragen. Dieses Nanovesikel bietet einen verbesserten Vektor für die Genlieferung in vivo .

Entwicklung mesenchymaler Stammzellmembran-umhüllte Nanovesikel zur verbesserten Genlieferung

Erfahren Sie die Isolierung neuer AAV-Kapsidvarianten durch Engineering, Barcoding und Hochdurchsatz-Screening für verbesserte Gentherapie. Diese Methode steigert Effizienz und Spezifität bei der Transgenlieferung.

Isolierung von Gentherapievektoren der nächsten Generation durch Engineering, Barcoding und Screening von Kapsidvarianten des Adeno-assoziierten Virus (AAV) (Video) | JoVE Journal

Isolierung von Gentherapievektoren der nächsten Generation durch Engineering, Barcoding und Screening von Kapsidvarianten des Adeno-assoziierten Virus (AAV)

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