Name: IDG-SW3 Zellkultur in einer dreidimensionalen extrazellulären Matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Lernen Sie die dreidimensionale Kultivierung von IDG-SW3-Zellen in einer extrazellulären Matrix zur Untersuchung der Osteogenese und Dendritenbildung. Diese Methode ermöglicht verbesserte Bildgebung und Genexpressionsanalysen.

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Wir danken Dr. Lynda F. Bonewald für das Geschenk der IDG-SW3-Zelllinie. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82070902, 82100935 und 81700778) und dem Shanghai "Science and Technology Innovation" Sailing Project (21YF1442000) unterstützt.

Dieses Protokoll eignet sich für die Kultivierung von Zellen in vier Wells mit 24-Well-Platten. Bei der Vorbereitung mehrerer Proben oder Platten sollten die Mengen der Reagenzien entsprechend erhöht werden.
1. Herstellung der Kollagen-I-Mischung
HINWEIS: Kollagen I und Basalmembran-Matrix-Gel schnell bei Raumtemperatur. Daher sollte Kollagen auf Eis (2 °C bis 8 °C) gehandhabt werden. Alle verwendeten Spitzen und Röhrchen müssen vorgekühlt werden, sofern nicht anders angegeben. Alle Eingriffe sollten in einer Schutzhaube durchgeführt werden.
<ol><li>Alle Reagenzien und Zentrifugenröhrchen auf Eis legen.</li>
	<li>Langsam 0,48 ml Kollagen I (5 mg/ml) und 0,1 ml 10x Minimum Essential Medium (MEM) (mit Phenolrot) in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen pipettieren, das auf Eis aufbewahrt wird. Gut mischen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Verwenden Sie entsprechend der Farbpalette des Phenolrotindikators ein angemessenes Volumen von 7,5 % (w/v) NaHCO3 (ca. 0,2 ml), um den Phenolrotindikator auf Orange einzustellen, was anzeigt, dass der pH-Wert im Bereich von 7,0-7,4 liegt. HINWEIS: Abhängig vom pH-Wert des Mediums wird ein Volumen NaHCO3 verwendet, um den pH-Wert auf etwa 7,0-7,4 zu bringen. Zusätzlich wird NaOH zur pH-Neutralisation eingesetzt.</li>
	<li>Das Endvolumen der Mischung wird auf 1 ml erhöht, indem ein geeignetes Volumen ddH2O hinzugefügt wird. Gut mischen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, um die Verwendung vorzubereiten. ANMERKUNG: Das endgültige Volumen vonddH2Ohängt von der Menge an NaHCO3 oder NaOH ab, die in Schritt 1.3 verwendet wurde.</li>
</ol>2. Herstellung des Zell-Matrix-Gemisches
<ol><li>Langsam 0,9 ml Basalmembranmatrix in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf dem Eis pipettieren.</li>
	<li>Die IDG-SW3-Zellen werden in einem T25-Kolben mit 4 ml vollständigem Medium (Alpha-MEM mit 10 % fötalem Kälberserum [FBS]), ergänzt mit 50 U/ml INF-γ bei 33 °C, kultiviert.</li>
	<li>Sobald die IDG-SW3-Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4 während des gesamten Protokolls) mit einer Pipette. Die Zellen werden mit 0,5 ml 0,25%iger Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37 °C für 30 s verdaut.</li>
	<li>Inaktivieren Sie das Trypsin durch Zugabe von 3,5 ml vollständigem Medium (Alpha-MEM mit 10 % fötalem Kälberserum [FBS]). Die 4-ml-Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird bei 300 × g für 5 min bei 4 °C heruntergeschleudert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml des kompletten Mediums auf Eis.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die endgültige Zelldichte mit dem gesamten Medium auf 4 × 105 Zellen/ml ein. 0,1 ml der hergestellten Zellsuspension werden zu 0,9 ml der extrazellulären Matrix aus Schritt 2.1 gegeben. Gut mischen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. HINWEIS: Wenn eine zellfreie Kontrolle erforderlich ist, fügen Sie 0,1 ml des vollständigen Mediums zu 0,9 ml extrazellulärer Matrix als Negativkontrolle hinzu.</li>
</ol>3. Beschichtung der Zell-Gel-Mischung
<ol><li>Mischen Sie die beiden Mischungen aus Schritt 2.6 und Schritt 1.4 vorsichtig gut auf 2 ml, indem Sie auf dem Eis auf und ab pipettieren. Pipettieren Sie 0,5 ml der Endmischung in jede Vertiefung (vier Vertiefungen einer 24-Well-Platte). Bei 37 °C für 1 h inkubieren, um ein Zell-Gel-Gemisch zu bilden.</li>
	<li>0,5 ml osteogenes Medium (vollständiges Medium mit 50 μg/ml Ascorbinsäure und 4 mM β-Glycerophosphat, auch bekannt als osteogenes Induktionsmedium)4 in die Zell-Gel-Mischung in jeder Vertiefung geben, um die osteogene Differenzierung bei 37 °C zu beginnen. Betrachten Sie dies als Tag 0.</li>
	<li>Ersetzen Sie alle 2 Tage die Hälfte des Mediums durch frisches osteogenes Medium, das bei 37 °C gehalten wird. Setzen Sie die Kultivierung 35 Tage lang fort.</li>
</ol>4. Identifizierung der Zelllebensfähigkeit und der zellulären Dendriten mit einem konfokalen Mikroskop
<ol><li>Zellfärbung HINWEIS: Calcein-Acetoxymethylester (Calcein AM) ist ein zelldurchlässiger Farbstoff, der zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit verwendet werden kann. Ethidium-Homodimer-I (EthD-1) durchdringt nicht die Membran intakter/lebensfähiger Zellen9. Somit kann Calcein AM/EthD-1 verwendet werden, um die Lebensfähigkeit von Zellen und zelluläre Dendriten zu identifizieren.<ol><li>An Tag 1 und Tag 7 der Kultur die Calcein-AM-Stammlösung (4 mM in DMSO) und die EthD-1-Stammlösung (2 mM in DMSO/H2O 1:4 [v/v]) aus dem Gefrierschrank nehmen und auf Raumtemperatur erwärmen lassen. HINWEIS: Die mineralisierte Matrix hat ein starkes Autofluoreszenzsignal, so dass das Präosteozytenstadium ohne Dmp1-Expression innerhalb von 7 Tagen nach der Kultivierung4 besser für die Beobachtung der Zellfärbung geeignet ist.</li>
		<li>4 μl der 2 mM EthD-1 Stammlösung und 5 μl der 4 mM Calcein-AM-Stammlösung zu 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) von Dulbecco geben und gut mischen. Daraus ergeben sich ca. 2 μM Calcein AM und 4 μM EthD-1 als Arbeitslösungen.</li>
		<li>Pipettieren Sie 0,5 ml der Arbeitslösung in die Vertiefungen in der 24-Well-Platte. 30-45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Zell-Gel-Matrix zu färben.</li>
		<li>Nach der Inkubation ca. 0,5 ml frisches D-PBS in eine neue 35-mm-Kulturschale mit Glasboden geben. Decken Sie die Schale ab, um eine Kontamination oder Austrocknung der Proben zu verhindern.</li>
		<li>Die gefärbte Zell-Gel-Matrix aus Schritt 4.1.3 wird mit einer Ellbogenpinzette vorsichtig in die 35-mm-Kulturschale aus Schritt 4.1.4 überführt. Vermeiden Sie es, die Zell-Gel-Matrix zu beschädigen oder zu scheren.</li>
		<li>Betrachten Sie die markierten Zellen unter einem konfokalen Laser-Fluoreszenzmikroskop.</li>
	</ol></li>
	<li>Scanning-Set für Mikroskope<ol><li>Stellen Sie die 35-mm-Schüssel auf die Bühne. Wählen Sie die Bereiche der Zell-Gel-Matrix aus, die mit einem 10-fach-Objektiv durch das Okular abgetastet werden sollen. Objektive mit höherer Vergrößerung werden aufgrund der Größe der verlängerten Dendriten nicht empfohlen.</li>
		<li>Wählen Sie die optischen Filter aus. Calcein kann mit einem Standard-Fluorescein-Bandpassfilter grün angezeigt werden, und EthD-1 kann mit Filtern für Propidiumiodid oder den Farbstoff Texas Red rot als rot angesehen werden. Wählen Sie den "Zeilenmodus" für das Scannen und stellen Sie die "Lochblende" auf 2 μm ein.</li>
		<li>Wählen Sie eine Datentiefe von 8 Bit Datentiefe und eine Bildauflösung von 1.024 Pixel x 1.024 Pixel.</li>
		<li>Bild mit sequentieller Zeilenabtastung mit den optimalen Laser- und Detektoreinstellungen (halten Sie eine minimale Laserenergie ein, um ein mögliches Photobleichen zu vermeiden). HINWEIS: Die optimale Detektoreinstellung hängt von den endgültigen Fluoreszenzsignalen ab.</li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln eines "Z-Stapels" von Bildern<ol><li>Definieren Sie entsprechend dem grünen Kanalsignal die obere und untere Position der zu scannenden Zell-Gel-Matrix, indem Sie während des kontinuierlichen Scannens durch die Probe fokussieren.</li>
		<li>Nachdem die Ober- und Unterseite der Probe festgelegt wurden, wählen Sie den gewünschten Scanrahmen aus. Starten Sie den Scanvorgang. Die Probe wird von oben nach unten mit den ausgewählten Einstellungen aus Schritt 4.2 gescannt, wodurch eine Bildergalerie erstellt wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifizierung der Zelllebensfähigkeit.<ol><li>Wählen Sie ein Segment aus Schritt 4.3 aus. Die grünen und roten Kanäle zeigen lebende bzw. tote Zellen an.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifizierung von Zelldendriten.<ol><li>Wählen Sie den einzelnen grünen Kanal aus, um 3D-Rekonstruktionen mit der Bilderfassungssoftware zu erstellen. Die Tiefeninformationen werden als eine Reihe von Regenbogen-Pseudofarbenbildern angezeigt. Die Dendriten, die sich am unteren Rand des Gels befinden, werden rot dargestellt, während die Dendriten an der Oberseite blau dargestellt werden.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Identifizierung des Aussehens mit einem Stereomikroskop
<ol><li>Entfernen Sie an Tag 1, Tag 7, Tag 21 und Tag 35 der Kultur das Nährmedium und waschen Sie die Gele in der Platte zweimal mit D-PBS. Geben Sie 0,5 ml 4% (v/v) Paraformaldehyd in D-PBS in die Vertiefung, um die Zell-Gel-Matrix in der Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu fixieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Paraformaldehyd aus der Vertiefung und waschen Sie die Zell-Gel-Matrix noch zwei weitere Male mit D-PBS in der Platte. Lassen Sie 0,5 ml D-PBS für die Bildgebung in jeder Vertiefung.</li>
	<li>Legen Sie die Platte auf den Tisch und wählen Sie die optimale Position durch das Okular mit einem 0,5-fach-Objektiv. Bilden Sie die Vollfeldansicht der Zell-Gel-Matrix in der Platte einzeln mit "automatischer Belichtung" unter dem Hellfeld ab.</li>
</ol>6. Identifizierung von Mineralablagerungen mit einem RFA-Assay
<ol><li>Prüfen Sie am Tag 35 der Kultur, ob der flüssige Stickstoff ausreichend ist. Starten Sie das RFA-System. Öffnen Sie den Probenraum und übertragen Sie die Gele mit einer Ellbogenpinzette von der Platte in die Mitte des Probentisches des Instruments. Schließen Sie den Probenraum und warten Sie 30 Minuten, damit das Gerät abkühlen kann, bevor Sie es verwenden.</li>
	<li>Stellen Sie die "Belichtungszeit" auf 35 ms, den "Spektrumbereich" auf 0-40 keV und den "Elektrischen Strom" auf 770 μA für die Aufnahmeeinrichtung ein.</li>
	<li>Wählen Sie drei bis fünf Scan-Stellen für die Analyse aus, indem Sie den Probentisch verschieben.</li>
	<li>Wählen Sie die zu erkennenden Elemente (Ca und P) aus. Starten Sie die Erkennung, und exportieren Sie die Ergebnisse. HINWEIS: Ca und P sind die am häufigsten vorkommenden Elemente in Hydroxylapatit.</li>
</ol>7. Identifizierung der funktionellen Genexpression
<ol><li>An Tag 1, Tag 7, Tag 21, Tag 28 und Tag 35 der Kultur wird das Nährmedium entfernt und die Zell-Gel-Matrix zweimal mit eiskaltem D-PBS in der Platte gewaschen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gele mit einer Ellbogenpinzette von der Platte in ein 2,0-ml-Röhrchen (je nach Kulturzeit schrumpft die Zell-Gel-Matrix allmählich auf etwa 0,1 ml am 35. Tag). Stellen Sie sicher, dass sich ein Gel in einer Tube befindet. Geben Sie 1 ml Phenolchloroform und zwei sterile Schlagperlen aus Edelstahl (4 mm, als Lysematrix) in jedes Röhrchen. Setzen Sie die Röhrchen symmetrisch in den vorgekühlten Probenschlitz des mechanischen Schlaghomogenisators.</li>
	<li>Stellen Sie die Schwebung auf eine Frequenz von 55 Hz und eine Amplitude von 1 cm in jeder 1-minütigen mechanischen Schwebung mit einer Pause von 10 s ein, mit insgesamt sechs Zyklen. Beginne mit dem Perlenschlagen.</li>
	<li>Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus der Zell-Gel-Matrix mit der Phenol-Chloroform-Isoamylachohol-Methode. Transkribieren Sie 2 μg Gesamt-RNA in cDNA mit zufälligen Hexamer-Primern.</li>
	<li>Entwerfen Sie Primer, die auf β-Aktin, Pdpn, Dmp1, Sost und Fgf23 abzielen, für die Real-Time-PCR (Tabelle 2). β-Aktin ist das Haushaltsgen, das für die Normalisierung verwendet wird. Die Gene Pdpn10 und Dmp1 11 werden hauptsächlich in Prä-Osteozyten und mineralisierten Osteozyten exprimiert, während Sost12 und Fgf23 13 hauptsächlich in reifen Osteozyten exprimiert werden.</li>
	<li>Stellen Sie das Röhrchen mit dem beheizten Deckel auf 105 °C auf einen Thermocycler und führen Sie die PCR-Amplifikation mit den folgenden PCR-Zykluseinstellungen durch: 95 °C für 5 s und 60 °C für 30 s für 35 Zyklen mit einem ersten Denaturierungsschritt bei 95 °C für 5 min und einem letzten Verlängerungsschritt bei 60 °C für 30 s. Analysieren Sie die Faltenänderungen mit der ΔΔCt-Methode.</li>
</ol>

<ol><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amazing+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteocyte%3A+An+endocrine+cell+...+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The osteocyte: An endocrine cell ... and more.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteocyte+in+bone+and+nonbone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">The role of the osteocyte in bone and nonbone disease.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Wang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+osteocyte+dendrite+formation+by+Sp7+and+its+target+gene+osteocrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin.</a> Nature Communications. 12 (1), 6271(2021).</li>
<li>Chicatun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoid-mimicking+dense+collagen%2Fchitosan+hybrid+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).</li>
<li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+in+humans%3A+making+the+hard+choices+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).</li>
<li>Bosman, F. T., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+and+composition+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional structure and composition of the extracellular matrix.</a> Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).</li>
<li>Papadopoulos, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorescence+assay+for+the+determination+of+lymphocyte-mediated+cytotoxicity+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).</li>
<li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomorphic+conditional+deletion+of+E11%2FPodoplanin+reveals+a+role+in+osteocyte+dendrite+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Winkler, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+control+of+bone+formation+via+sclerostin%2C+a+novel+BMP+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist.</a> EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).</li>
<li>Riminucci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-23+in+fibrous+dysplasia+of+bone+and+its+relationship+to+renal+phosphate+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).</li>
<li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).</li>
<li>Robin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+3D+osteoblast+migration+and+bone+apatite+during+in+vitro+early+osteocytogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis.</a> Bone. 88, 146-156 (2016).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mineralization+capacity+of+IDG-SW3+cells+in+3D+collagen+hydrogel+for+bone+healing+in+estrogen-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864(2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Ein kritischer Punkt in diesem Protokoll ist, dass die Schritte 1 und 2 auf Eis durchgeführt werden müssen, um eine spontane Gerinnung zu verhindern. Bei dieser Methode betrug die Endkonzentration von Kollagen I 1,2 mg/ml. Daher sollte ein optimalesddH2O-Volumenberechnet werden, das zu den verschiedenen Kollagenen verschiedener Hersteller passt.
In vivo beinhaltet die Osteozytogenese eine polare Bewegung von Osteoblasten von der Oberfläche ins Innere des trabekulären Knoche...

Osteozyten sind terminale differenzierte Zellen, die von Osteoblasten abstammen 1,2. Sobald der Osteoblast vom Osteoid begraben ist, durchläuft er eine Osteozytogenese und exprimiert das Pdpn-Gen, um Präosteozyten zu bilden, das Dmp1-Gen, um das Osteoid zu mineralisieren, und die Sost- und Fgf23-Gene, um als reifer Osteozyt im Knochengewebe zu fungieren3. Hier wird ein 3D-Kultivierungssystem eingeführt, um die Dendritenverlängerung und die Markergenexpression im Osteozytogeneseprozess zu identifizieren.
IDG-SW3-Zellen sind eine immortalisierte primäre Zelllinie, die von transgenen Mäusen abstammt und die Differenzierung von Osteoblasten bis hin zu späten Osteozyten erweitern oder replizieren können, wenn sie in verschiedenen Medien kultiviertwerden 4. Im Vergleich zu MLO-A5, MLO-Y4 und anderen Zelllinien sind das Expressionsprofil funktioneller Proteine, die Fähigkeit, Kalziumsalzablagerungen durchzuführen, und die Reaktionen auf verschiedene Hormone in IDG-SW3-Zellen eher die gleichen wie die von primären Osteozyten im Knochengewebe4.
Im Vergleich zu 2D-Systemen sind 3D-Kultivierungssysteme besser in der Lage, die In-vivo-Zellwachstumsumgebung nachzuahmen, einschließlich des Nährstoffgradienten, der geringen mechanischen Steifigkeit und des umgebenden mechanischen Bereichs (Tabelle 1). Die meisten der bisherigen Methoden zur Kultivierung osteoblastischer Zellen in einem 3D-System verwendeten Kollagen I als einzigartige Komponente in Formulierungen 4,5,6, da Kollagen-I-Fasern als Ort der Kalzium- und Phosphorablagerung dienen. Ein unverzichtbarer Bestandteil des Osteoids, die extrazelluläre Matrix, enthält jedoch eine große Gruppe zellulärer Faktoren, die das Zellwachstum, die Adhäsion und die Migration fördern 7,8 und ist transparent und für die bildgebende Beobachtung geeignet. Daher verwendet dieses Protokoll Matrigel (im Folgenden als Basalmembranmatrix bezeichnet) als sekundäre Komponente für die Osteozytogenese-Studie.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Hyklon</td><td>SH30042,01</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Corning, NY, USA</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>7,5 % (w/v) Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10483-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator für fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BiHeng&nbsp; Biotechnologie, Shanghai, China</td><td>SKSI</td><td></td></tr><tr><td>Laser konfokale Fluoreszenzmikroskopie</td><td>Carl&nbsp; Zeiss, Oberkochen, Deutschland</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Lebende/tote Zellen Imaging Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning, NY, USA</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10X), ohne</td><td>Glutamin Thermo Fisher Scientific</td><td>21430079</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Hyclone</td><td>SH30256. </td><td></td>FS</tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Carl&nbsp; Zeiss, Oberkochen, Deutschland</td><td>Zeiss Axio ZOOM. V16</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Röntgenfluoreszenz</td><td>EDAX, USA</td><td>EAGLE III</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerophosphat</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

idg-sw3 zellkultur in einer dreidimensionalen extrazellulären matrix

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

Osteozyten gelten als nicht-proliferative Zellen, die sich terminalmäßig von Osteoblasten unterscheiden. Osteoblasten, die in die extrazelluläre Matrix des Knochens (Osteoid) eingebettet sind, exprimieren das Pdpn-Gen , um zelluläre Dendriten zu bilden und sich in Präosteozyten umzuwandeln. Später exprimieren Präosteozyten das Dmp1-Gen , um die Matrixmineralisierung zu fördern und sich dadurch in reife Osteozyten umzuwandeln. Dieser Prozess wird als Osteozytogenese bezeichnet. IDG-SW3 ist eine bekannte Zelllinie für In-vitro-Studien zur Osteozytogenese. Viele frühere Methoden haben Kollagen I als Haupt- oder einzige Komponente der Kultivierungsmatrix verwendet. Neben Kollagen I enthält das Osteoid jedoch auch eine Grundsubstanz, die eine wichtige Komponente bei der Förderung des Zellwachstums, der Adhäsion und der Migration ist. Darüber hinaus ist die Matrixsubstanz transparent, was die Transparenz des Kollagen-I-gebildeten Gels erhöht und somit die Erforschung der Dendritenbildung durch bildgebende Verfahren unterstützt. Daher wird in dieser Arbeit ein Protokoll zur Etablierung eines 3D-Gels unter Verwendung einer extrazellulären Matrix zusammen mit Kollagen I für das Überleben von IDG-SW3 beschrieben. In dieser Arbeit wurden die Dendritenbildung und die Genexpression während der Osteozytogenese untersucht. Nach 7 Tagen osteogener Kultur konnte unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop deutlich ein ausgedehntes Dendritennetzwerk beobachtet werden. Die Real-Time-PCR zeigte, dass die mRNA-Spiegel von Pdpn und Dmp1 über 3 Wochen kontinuierlich anstiegen. In Woche 4 zeigte das Stereomikroskop ein undurchsichtiges Gel, das mit Mineralpartikeln gefüllt war, was mit dem Röntgenfluoreszenz-Assay (RFA) übereinstimmte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Kulturmatrix den Übergang von Osteoblasten zu reifen Osteozyten erfolgreich erleichtert.

Nach der Färbung lebender/toter Zellen wurden die Zellen mit einem konfokalen Lasermikroskop sichtbar gemacht. Alle Zellen waren Calcein-AM-positiv (grüne Farbe), und es gab fast keine EthD-1-positiven Zellen (rote Farbe) im Feld, was darauf hindeutet, dass das mit dieser Methode hergestellte Gelsystem sehr gut für die Osteozytogenese geeignet ist (Abbildung 1A, links). Um die räumliche Verteilung der Zellen besser bestimmen zu können, wurde ein Pseudofarbenbild gewählt, um die Zelldendriten...

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Kultivierung von IDG-SW3-Zellen in einer dreidimensionalen (3D) extrazellulären Matrix vor.

IDG-SW3 Zellkultur in einer dreidimensionalen extrazellulären Matrix

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...

Wir haben ein Protokoll zur Etablierung eines 3D-Systems unter Verwendung einer extrazellulären Metrik zusammen mit Kollagen zur Analyse der Bildung und Genexpression durch Osteogenese detailliert beschrieben. Extrazelluläre Metriken können die Transparenz des Kollagen-One-Form-Gels erhöhen und eignen sich für die Untersuchung der Dendritenbildung für bildgebende Verfahren. Um zu beginnen, pipettieren Sie langsam 0,9 Milliliter Basalmembranmatrix in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis und legen Sie es beiseite.Als Nächstes wird eine T25-Zahnseide aus IDG SW3-Zellen in vier Millilitern des vollständigen Mediums, das mit Interferon-Gamma ergänzt wurde, aus dem Inkubator entnommen. Nach dem Entfernen des Kulturmediums werden die Zellen mit PBS pH 7,4 mit einer Pipette gewaschen. Dann werden die Zellen mit 0,5 Millilitern 0,25%iger Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für 30 Sekunden trypsanisiert.Inaktivieren Sie Trypsin durch Zugabe von 3,5 Millilitern des vollständigen Mediums. Übertragen Sie vier Milliliter der Celsius-Rente in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Schleudern Sie die Zellsuspension bei 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius herunter.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellpalette in einem Milliliter des kompletten Mediums auf Eis. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die endgültige Zelldichte mit dem kompletten Medium auf viermal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter ein. Zu den 0,9 Millilitern der auf Eis gehaltenen extrazellulären Matrix werden 0,1 Milliliter der vorbereiteten Zellsuspension gegeben.Gut mischen, indem man vorsichtig auf und ab pipettiert. Mischen Sie vorsichtig einen Milliliter der Zellmatrixmischung und einen Milliliter des zuvor zubereiteten Kollagens, indem Sie auf dem Eis auf und ab pipettieren. Pipettieren Sie 0,5 Milliliter der Endmischung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um eine Zellgelmischung zu bilden.Nach der Inkubation werden in jeder Vertiefung 0,5 Milliliter osteogenes Medium in die Zellgelmischung gegeben. Um die osteogene Differenzierung bei 37 Grad Celsius zu beginnen, betrachten Sie dies als Tag Null. Ersetzen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Mediums durch frisches osteogenes Medium und setzen Sie die Kultivierung 35 Tage lang fort.Nehmen Sie die Kalzium-AM- und Ethidium-Stammlösungen aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen. Man fügt vier Mikroliter der zwei Millimolaren Ethidium-Stammlösung und fünf Mikroliter der vier Millimolaren Calcium-AM-Stammlösung zu zwei Millilitern DPBS hinzu und mischt gut, um zwei mikromolare Calcium-AM- und vier Mikromol-Ethidium-Stammlösung als Arbeitslösung zu erhalten. Um die Zellfärbung am ersten und siebten Tag der Kultivierung durchzuführen, pipettieren Sie 0,5 Milliliter der Arbeitslösung in die Vertiefungen der 24-Well-Platte und inkubieren Sie 30 bis 45 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellgelmatrix zu färben.Geben Sie ca. 0,5 Milliliter frisches DPBS in eine neue 35-Millimeter-Kulturschale mit Glasboden und decken Sie die Schale ab, um eine Kontamination oder Austrocknung der Proben zu verhindern. Übertragen Sie die gefärbte Zellgelmatrix vorsichtig mit einer Ellbogenzange in die DPBS-haltige Kulturschale, ohne die Zellgelmatrix zu beschädigen oder zu scheren. Betrachten Sie die markierten Zellen unter einem konfokalen Laser-Fluoreszenzmikroskop.Stellen Sie die Kulturschale mit der gefärbten Zellgelmatrix auf den Mikroskoptisch. Wählen Sie die Bereiche der Zellgelmatrix aus, die mit einem 10x-Objektiv durch das Okular abgetastet werden sollen. Um die Abtastung des Mikroskops einzustellen, wählen Sie die optischen Filter aus.Betrachten Sie Kalzium als grün mit einem Standard-Fluoreszenz-Bandpassfilter und Ethidium als rot mit Filtern für Propidiumiodid oder texanischen roten Farbstoff. Wählen Sie den Zeilenmodus für das Scannen aus und klicken Sie dann auf den Erfassungsmodus, um die luftigen Einheiten auf eine Au einzustellen. Wählen Sie eine Datentiefe von 8 Bit und eine Bildauflösung von 1024 x 1024 Pixeln.Wählen Sie dann den Zeilenschritt aus und stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf fünf ein. Um den Z-Stapel von Bildern zu erfassen, definieren Sie die obere und untere Position der zu scannenden Zellgelmatrix, indem Sie durch die Probe fokussieren, während Sie kontinuierlich gemäß dem grünen Kanalsignal scannen. Nachdem die Ober- und Unterseite der Probe festgelegt wurden, wählen Sie den gewünschten Scanrahmen aus und beginnen Sie mit dem Scannen.Die Probe wird von oben nach unten gescannt, wobei die ausgewählten Einstellungen eine Bildergalerie erzeugen. Um die lebensfähigen Zellen zu identifizieren, wählen Sie einen Bildausschnitt aus. Der grüne und der rote Kanal zeigen lebende bzw. tote Zellen an.Um den Zelldendriten zu identifizieren, wählen Sie den einzelnen grünen Kanal aus, um 3D-Rekonstruktionen mit der Bilderfassungssoftware zu erzeugen, eine Reihe von Regenbogen-Pseudofarbbildern zeigt die Tiefeninformation an. Die Dendriten am unteren Rand werden rot dargestellt, während die Dendriten am oberen Rand blau dargestellt werden. Entfernen Sie an verschiedenen Tagen der Kultivierung das Nährmedium und waschen Sie die Gele in der Platte zweimal mit DPBS.Geben Sie 0,5 Milliliter oder 4 % Paraformaldehyd in DPBS in die Vertiefung, um die Zellgelmatrix 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Platte zu fixieren. Entfernen Sie das Paraformaldehyd in der Vertiefung und waschen Sie die Zellgelmatrix zwei weitere Male mit DPBS in der Platte, wie zuvor gezeigt, und lassen Sie 0,5 Milliliter DPBS in jeder Vertiefung für die Bildgebung. Legen Sie die Platte auf den Stereomikroskoptisch und wählen Sie mit einem 0,5-fach-Objektiv die optimale Position durch das Okular.Bild, die Vollfeldansicht der Zellgelmatrix in der Platte einzeln unter Verwendung der automatischen Belichtung unter dem Hellfeld. Überprüfen Sie am 35. Tag der Kultivierung den Flüssigstickstoffgehalt und starten Sie das RFA-System. Öffnen Sie den Probenraum und übertragen Sie die Gele mit einer Ellbogenpinzette von der Platte in die Mitte des Probentisches des Instruments.Schließen Sie den Probenraum und warten Sie 30 Minuten, damit das Gerät abkühlen kann, bevor Sie es verwenden. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 35 Millisekunden ein. Der Spektrumbereich reicht von null bis 40 Kiloelektronenvolt und der elektrische Strom bis 770 Mikroampere für die Erfassung.Verschieben Sie den Probentisch und wählen Sie drei bis fünf Scanstellen für die Analyse aus. Wählen Sie die Elemente Kalzium und Phosphor aus. Starten Sie die Erkennung, und exportieren Sie die Ergebnisse.An verschiedenen Kultivierungstagen. Waschen Sie die aus dem Kulturmedium entfernte Zellgelmatrix zweimal mit eiskaltem DPBS, wie zuvor gezeigt. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus der Zellgelmatrix mit der Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Methode.Transkription dann zwei Mikrogramm Gesamt-RNA in CDNA mit zufälligen Hexamer-Primern. Legen Sie das Röhrchen auf einen Thermocycler und führen Sie eine PCR-Amplifikation durch. Nach der PCR analysieren Sie die Faltenveränderungen mit der Zwei-Delta-CT-Methode.Die Färbung lebender toter Zellen, die unter einem konfokalen Lasermikroskop visualisiert wurde, zeigte, dass alle Zellen Calcium-AM-positiv und fast keine Ethidium-1-positiven Zellen waren, was darauf hindeutet, dass das Gelsystem sehr gut für die Osteozytogenese geeignet ist. Die zellulären Dendriten dehnten sich bis zum siebten Tag allmählich zu einem Netzwerk im osteogenen Medium aus. Ein Pseudo-Farbbild der Tag-Sieb-Kultur zeigt die Zellandroiden in unterschiedlichen Tiefen am unteren und oberen Rand des Gels.Es werden Vollfeldbilder des Gels mit Zellen und des Gels ohne Zellen in einer 24-Well-Platte zu den angegebenen Zeitpunkten abgebildet. Die Transparenz der Gelmatrix nahm weiter ab, bis sie am Tag 35 im Gegensatz zur zellfreien Gelmatrix undurchsichtig wurde. Das RFA-Spektrum des trüben Gels an Tag 35 zeigte, dass das Gel vollständig mit Kalzium- und Phosphorablagerungen gefüllt war.Die Expression mehrerer Markergene, die mittels real-time PCR analysiert wurden, zeigte, dass die mRNA-Spiegel von Podoplanin und Dentinmatrixprotein eins vom ersten Tag bis zum Tag 21 kontinuierlich anstiegen und der mRNA-Spiegel nach Tag 21 abnahm. Die mRNA-Spiegel des Fibroblasten-Wachstumsfaktors 23 und des Sclerostins stiegen in allen Stadien kontinuierlich an. Kollagen eins und die Basalmembran Metriken gelieren schnell und bei Raumtemperatur.Daher müssen alle verwendeten Spitzen und Röhrchen vorgekühlt werden, sofern nicht anders angegeben. Man kann alle interessanten Ereignisse während der Osteogenese mit bildgebenden Verfahren beobachten. Es ist einfacher, die Molekülwirkung während der Dendritenbildung und -dehnung zu lokalisieren.

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Research

Forschung

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