Name: Eine Pipeline zur Charakterisierung struktureller Herzfehler in der fetalen Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Lernen Sie eine Pipeline zur Diagnose struktureller Herzfehler bei fetalen Mäusen mittels Echokardiografie, Nekropsie und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende 3D-Rekonstruktionen für präzise anatomische Analysen.

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Die Verwendung von Mäusen für diese Studien ist notwendig, da Mäuse vierkammerige Herzen haben, die menschliche KHK nachahmen können. Mäuse wurden tierärztlich versorgt und in der von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditierten Tierpflegeeinrichtung der Institution untergebracht. Strenge Protokolle wurden befolgt, um die Beschwerden, den Stress, die Schmerzen und die Verletzungen der Mäuse zu minimieren. Mäuse wurden mit CO2 -Gas eingeschläfert, was für kleine Nagetiere nach den Richtlinien der American Veterinary Medical Association zur Sterbehilfe akzeptabel ist. Die Studien an Mäusen in diesem Manuskript wurden mit einem genehmigten IACUC-Protokoll an der Universität von Pittsburgh durchgeführt.
1. Fetales Echokardiogramm
HINWEIS: Ein Echokardiogramm ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von kardiovaskulären Fehlbildungen und extrakardialen Defekten bei Mäusen. Aufgrund der geringen Größe der Mausembryonen (ca. 1-2 mm bei der Geburt, 3,5 mm bei der Geburt) ist ein ultrahochfrequentes echokardiographisches Gerät mit Ultraschall-Biomikroskopie (UBM) erforderlich. UBM bietet verschiedene Hochfrequenz-Sonden (30-50 MHz) mit einem kleinen Bildgebungsfenster (15 mm x 14 mm), das die Auflösung (30 μm axial x 68 μm lateral) bietet, um jeweils einen Mausfötus zu visualisieren. Ein 40-MHz-Schallkopf liefert hochauflösende Bilder zur Identifizierung kardiovaskulärer Phänotypen7.
<ol><li>Schalten Sie das Echokardiogrammgerät ein und wählen Sie das Programm Kardiologie. ANMERKUNG: Das folgende Protokoll kann für jeden Maushintergrund vom Embryonaltag (E) 14.5 bis 19.5. verwendet werden.</li>
	<li>Betäuben Sie die gewünschte Maus in einer Anästhesie-Induktionskammer. Induzieren Sie eine Anästhesie mit einer Konzentration von 4% Isofluran und medizinischem Sauerstoff bei einer Flussrate von 1 l / min und reduzieren Sie sie auf 2% -3% für die Erhaltung.</li>
	<li>Platzieren Sie die Maus schnell auf der Imaging-Plattform. Die Bildgebungsplattform verfügt über beheizten Stahl, um die Maus während des Eingriffs warm zu halten. Legen Sie den Mund und die Nase der Maus in den Narkose-Nasenkegel. Sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband, um Bewegungen zu vermeiden. Überwachen Sie die Herzfrequenz, um sicherzustellen, dass sie zwischen 400 und 450 Schlägen pro Minute bleibt.</li>
	<li>Überwachen Sie die Temperatur mit einem Rektalthermometer und stellen Sie sicher, dass sie bei 37 °C ± 0,5 °C liegt. Überwachen Sie die Atmung, um Hypoxie zu vermeiden. Halten Sie eine sanfte Kraft auf die Sonde, um Schäden zu vermeiden. HINWEIS: Eine Wärmelampe kann über der Maus angebracht werden, um Unterkühlung zu verhindern und sich von der Narkose zu erholen. Vaseline ophthalmologische Salbe kann als Gleitmittel verwendet werden, um trockene Augen zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fell von Brustkorb und Bauch mit Enthaarungscreme. Tragen Sie die Creme auf und warten Sie 3 Minuten, bevor Sie sie entfernen. Reinigen Sie den Bereich mit 70% Ethanol. Ethanol wirkt besser als Wasser als Rasierschmiermittel.</li>
	<li>Erwärmen Sie das Ultraschallgel auf eine normale Körpertemperatur. Tragen Sie das Ultraschallgel großzügig auf und legen Sie den Schallkopf auf den Bauch, um ihn in einer horizontalen Ebene auszurichten und die Blase auf dem Bildschirm zu identifizieren. Sobald die Blase identifiziert ist, scannen Sie kranial von der Blase und suchen Sie nach dem Fötus. Messen Sie die Länge von Krone zu Gesäß, um das Gestationsaltervon 10 Jahren zu bestimmen (Abbildung 1 und Tabelle 1). HINWEIS: Ändern Sie die Positionen des Wandlers, um verschiedene Ebenen zu visualisieren, einschließlich der transversalen Vierkammer-, sagittalen und frontalen/koronalen Bildgebungsebenen7 (Abbildung 1).</li>
	<li>Verwenden Sie den Farbdoppler, um den Blutfluss vom Herzen zu analysieren.</li>
	<li>Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig, wenn die Embryonen nicht das vorgesehene Stadium erreicht haben. Andernfalls bereiten Sie die Maus für die Ernte vor. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Maus bereits wach ist und sich gut von der Narkose erholt hat, bevor Sie sie wieder in den Käfig legen.</li>
	<li>Schalten Sie Isofluran und Sauerstoff aus, reinigen Sie den Arbeitsbereich und schalten Sie das Gerät aus. HINWEIS: Es ist wichtig, das Gel aus dem Schallkopf zu entfernen.</li>
</ol>2. Obduktion
HINWEIS: Bei Verdacht auf abnorme kardiale Phänotypen mittels fetaler Echokardiographie werden die Föten gesammelt und durch Ganzkörpertauchen in der Fixierlösung fixiert: entweder 10% gepuffertes Formalinphosphat oder 4% Paraformaldehyd (PFA). Untersuchen Sie die äußere und innere Morphologie der Probe und suchen Sie nach makroskopischen anatomischen Anomalien oder Fehlbildungen.
<ol><li>Bereiten Sie die Maus vor.<ol><li>Wenn es sich bei der Maus um einen Erwachsenen handelt, wird die Maus mit einem Standard-CO2 -Protokoll eingeschläfert. Verwenden Sie eine Pinzette oder eine Sezierschere, um Schnitte (ca. 3 cm) im seitlichen Brustkorb und Bauch zu machen, um das Eindringen des Fixiermittels in die inneren Organe zu ermöglichen. ANMERKUNG: Die Probe sollte mindestens 24 Stunden vor der Obduktion fixiert werden, wenn der Embryo älter als E14,5 ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren Sie das Äußere des Körpers.<ol><li>Richten Sie die Software so ein, dass die Bilder mit einem Namen gespeichert werden, der die Identifizierung der Probe, die Vergrößerung des Mikroskops und den Inhalt des Bildes enthält. HINWEIS: Eine Vergrößerung von 1,0x bis 3,2x sollte für die Abbildung der meisten Strukturen in E14,5-Mäusen oder älter ausreichend sein.</li>
		<li>Legen Sie die Maus auf die Platte unter der Stereomikroskoplinse. Füllen Sie die Platte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um die Probe vollständig abzudecken, um Austrocknung und Reflexion in den Bildern zu verhindern. Passen Sie die Vergrößerung so an, dass der Bildschirm den gesamten Embryo enthält, und machen Sie dann ein Bild von der linken und rechten Seite des Embryos. HINWEIS: Die Unterseite der Platte sollte mit Paraffin, Silikon oder einem anderen Substrat beschichtet sein, um das Anheften zu erleichtern.</li>
		<li>Stecken Sie die Probe mit dem Gesicht nach oben durch den Hals und machen Sie ein weiteres Bild. HINWEIS: Richten Sie den Stift leicht nach oben aus, um sicherzustellen, dass keine wichtigen Strukturen der Brusthöhle durchstochen werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysiere die Brust.<ol><li>Während Sie die Haut in der Mitte des Halses mit einer Pinzette anheben, schneiden Sie die Haut mit der Schere in Richtung der beiden Achselhöhlen, bevor Sie die Haut entlang der Mittelachse in Richtung Schwanz schneiden. Dann schneiden Sie die Haut vom Nabel bis zu den Beinen. Stecken Sie die Probe durch ihre Handgelenke und Knöchel. HINWEIS: Achten Sie darauf, nur die Haut zu schneiden. Es wird empfohlen, die Klingen der Schere horizontal oder schräg nach oben zu halten.</li>
		<li>Um das Bindegewebe zu lösen, heben Sie die Haut mit einer Pinzette an, während Sie das darunter liegende Gewebe mit dem anderen Paar an Ort und Stelle halten. Stecken Sie die Probe durch die Haut, um die Brust und den Bauch freizulegen (Abbildung 2). HINWEIS: Zu starkes Dehnen beim Fixieren, Schneiden oder Schaben kann zu Gewebeschäden führen.</li>
		<li>Machen Sie ein Foto von den freiliegenden Muskeln und kratzen Sie dann vorsichtig die Muskeln ab, um die Rippen freizulegen.</li>
		<li>Machen Sie ein Foto von den freiliegenden Rippen. Trennen Sie die Rippen vom Zwerchfell und schneiden Sie die Rippen beidseitig so weit wie möglich auf der Seitenachse zum Hals hin ab.</li>
		<li>Entblößen Sie das Herz, indem Sie die abgeschnittenen Rippen entfernen. Machen Sie ein Foto vom Herzen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Thymusdrüse, indem Sie sie mit einer Pinzette schälen. Verwenden Sie die andere Pinzette, um die Basis des Thymus zu stabilisieren, um zu vermeiden, dass darunter liegende Gefäße gerissen werden. Machen Sie Fotos vom Herzen und den großen Gefäßen. HINWEIS: Die Verwendung von Pins zum Dehnen einiger benachbarter Strukturen kann dazu beitragen, bessere Bildaufnahmen zu erhalten. Machen Sie außerdem separate Fotos, die sich auf die großen Arterien, das Herz und andere interessante Strukturen konzentrieren, da sie möglicherweise nicht zusammen scharf sind.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysiere den Bauch.<ol><li>Ziehen Sie das Zwerchfell, um es zu entfernen und die Leber freizulegen. Machen Sie ein Foto.</li>
		<li>Stecken Sie die Leber zurück, um den Magen und die Bauchspeicheldrüse freizulegen. Machen Sie ein Foto.</li>
		<li>Schneiden Sie die Speiseröhre. Entfernen Sie den Dickdarm und den Darm, indem Sie sie mit einer Pinzette herausziehen. Schneiden Sie knapp über der Leber und entfernen Sie es, um die Nieren und Nebennieren freizulegen. Machen Sie ein Foto. HINWEIS: Die entnommenen Organe sollten in der Fixierlösung aufbewahrt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolieren Sie den Thorax für die ECM-Analyse.<ol><li>Schneiden Sie den unteren Thorax entlang einer geraden Linie zwischen Leber und Lunge. Schneiden Sie den Kopf hoch genug ab, um die Verzweigungen der Halsschlagadern nicht zu schneiden.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die seitlichen Rippen, während Sie die Rückenrippen und die Wirbelsäule beibehalten. Schälen Sie das Rückenfett und kratzen Sie es weg.</li>
		<li>Lösen Sie den Thorax vom Rest des Körpers und legen Sie ihn in eine 10% gepufferte Formalinphosphatlösung.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Einbettung
<ol><li>Dekantieren Sie das Fixiermittel in eine geeignete Sondermüllflasche. Waschen Sie die Proben dreimal mit 1x PBS für 15 min.</li>
	<li>Verwenden Sie steigende Konzentrationen von Ethanol und Xylol, um die Proben zu dehydrieren. Die Dauer aller folgenden Schritte hängt vom Stadium der Embryonen ab. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 2 . HINWEIS: Beim Wechseln der Lösungen ist Vorsicht geboten, um eine Beschädigung der Proben zu vermeiden. Die optimalen Parameter für die Probenbearbeitung können empirisch eingestellt werden. Xylol löst bestimmte Kunststoffe auf; Es sollten Instrumente und Behälter aus Glas verwendet werden.</li>
	<li>Ersetzen Sie Xylol für die gewünschte Dauer durch Paraffin. Die Flaschen werden für die entsprechende Dauer in einem Inkubator bei 65 °C gelagert (Tabelle 2).</li>
	<li>Verwenden Sie frisches Paraffin, um die Proben in die gewünschte Position einzubetten. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Probe in der Mitte des Paraffinblocks auszurichten, wobei die dorsale Seite nach oben und die hintere Seite nach vorne zeigt. Denken Sie beim Ausrichten der Probe daran, dass die Probe mit dem auf den Kopf stehenden Block eingebettet ist.</li>
</ol>4. Episkopische konfokale Mikroskopie (ECM)
HINWEIS: Nach entsprechender Einbettung werden die Embryonen zur histopathologischen Analyse seriell mittels ECM aufgenommen. Einzelne Objektträger können für weitere Studien aus dem Mikrotom gewonnen werden.
<ol><li>Nehmen Sie den Paraffinblock aus dem -20 °C Gefrierschrank und entfernen Sie die Metallformen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das Wachs an den Rändern und der Rückseite der Kassette zu trimmen. Schneiden Sie das Wachs, das die Probe umgibt, bis es von einem kleinen Wachsquadrat umhüllt ist, das an der Kassette befestigt ist. HINWEIS: Seien Sie äußerst vorsichtig bei der Handhabung von Messern.</li>
	<li>Verwenden Sie den Metallhebel, um den Paraffinblock gegen die Schneidephase des Mikrotoms zu klemmen. Wählen Sie im Run-Modus die MAN-Funktion (manuell), heben Sie die Oberfläche des Paraffins in die Nähe der Klinge und führen Sie einige Schlitten aus, um sicherzustellen, dass die Klinge den Paraffinblock berührt.</li>
	<li>Öffnen Sie die LAS AF-Anwendung und wählen Sie MatrixScreener aus. Wählen Sie Einzelne reguläre Matrix aus, und laden Sie die entsprechende zuvor gespeicherte Vorlage. Klicken Sie auf die Quick LUT-Taste , um zu weißem und orangefarbenem Ombre zu wechseln.</li>
	<li>Wählen Sie "Aufträge einrichten " und ziehen Sie den sichtbaren 405-nm-Laser auf das Maximum. Passen Sie den linken Rand des Spektrumblocks an die 405-nm-Linie an und ziehen Sie den rechten Rand auf die 800-nm-Linie. Markieren Sie die Option Lochblende und starten Sie die Live-Ansicht .</li>
	<li>Passen Sie die Position der Laserprojektion an, um die Probe auf dem Bildschirm zu zentrieren, und stellen Sie den Zoomknopf auf ~20x ein. Um die Auflösung zu optimieren, stellen Sie die Verstärkung auf 1.250 V ein und maximieren Sie den blauen Bereich mit dem Fokusknopf. Setzen Sie dann die Verstärkung für die Bildgebung auf ca. 750 V zurück. HINWEIS: Spezifische Werte können je nach Zustand des Embryos variieren.</li>
	<li>Schalten Sie die Schneidemethode auf Auto um, stellen Sie die Dicke auf etwa 50 μm ein und lassen Sie die Schlitten laufen. Hören Sie auf zu schneiden, wenn die Lunge und die Atemwege in Sicht sind.</li>
	<li>Wählen Sie eine Schnittstärke zwischen 8-10 μm und stoppen Sie die Live-Ansicht . Öffnen Sie Microtome Communicator , um die Bildgebung zu starten. Stellen Sie sicher, dass der temporäre Speicherordner leer ist, bevor Sie Bilder sammeln.</li>
	<li>Stoppen Sie das Schneiden, wenn keine zusätzliche Herzstruktur sichtbar ist. Schließen Sie die Anwendung Microtome Communicator und exportieren Sie die temporäre Datei über die Bildverarbeitungssoftware in eine .tiff Bildserien für spätere 3D-Rekonstruktionen.</li>
</ol>5. Dreidimensionale (3D) Rekonstruktion
HINWEIS: Der Zweck der 3D-Rekonstruktion besteht darin, einen 2D-Bildstapel aus der ECM-Bildgebung in 3D-Videos in koronaler, sagittaler und transversaler Ausrichtung zu verarbeiten und die 3D-Videos für die Diagnose der strukturellen und anatomischen Anomalien in den Proben zu verwenden.
<ol><li>Öffnen Sie den ECM-Bildstapel in der Bildverarbeitungssoftware.<ol><li>Ziehen Sie die Bilder per Drag & Drop in die Bildbearbeitungssoftware. Kippen Sie die ECM-Bilder horizontal, indem Sie in der Menüleiste Bild ></ol>

<ol><li>Wu, W., He, J., Shao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+mortality+trend+of+congenital+heart+disease+at+the+global%2C+regional%2C+and+national+level%2C+1990-2017%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine%22%5BJournal%5D)">Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017.</a> Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).</li>
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<li>Rosenthal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+high+resolution+three-dimensional+reconstruction+of+embryos+with+episcopic+fluorescence+image+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research.+Part+C%2C+Embryo+Today%3A+Review%22%5BJournal%5D)">Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture.</a> Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).</li>
<li>Weninger, W. J., Mohun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+transgenic+embryos%3A+a+rapid+3-D+screening+method+based+on+episcopic+fluorescence+image+capturing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing.</a> Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass in diesem Manuskript keine Interessenkonflikte bestehen.

Genetisch veränderte Mäuse wurden verwendet, um die Pathomechanismen von angeborenen Herzfehlern zu verstehen. Die Protokolle, die wir in dieser Studie zur Verfügung stellen, versuchen, den Prozess der Beurteilung von fetalen Herzfehlern der Maus zu rationalisieren und zu standardisieren. Es gibt jedoch kritische Schritte, die während des Protokolls zu beachten sind. Mausembryonen wachsen an jedem Tag der Schwangerschaft signifikant, und der richtige Zeitpunkt für die Ernte einer Maus kann durch ein fetales Echokardiogra...

Angeborene Herzfehler (KHK) sind die häufigsten neonatalen Geburtsfehler 1,2, von denen etwa 0,8 % bis 1,7 % der Neugeborenen betroffen sind und die zu einer signifikanten Mortalität und Morbidität bei Neugeborenen führen3. Eine genetische Ätiologie ist bei KHK 4,5 stark indiziert. Genetisch veränderte Mausmodelle wurden in großem Umfang verwendet, um die Komplexität von KHK und die Mechanismen zu verstehen, die sie verursachen, da die Mäuse Vierkammerherzen und vergleichbare kardiale Entwicklungs-DNA-Sequenzen bei Maus- und menschlichen Föten haben6. Die Identifizierung des Phänotyps der Mausmutanten ist der grundlegende erste Schritt, um die Funktion des Zielgens zu charakterisieren. Mausmodelle, die Gendosiseffekte ausdrücken, bei denen eine einzige genetische Mutation zu einem Spektrum von Herzfehlern führen kann, die menschliche KHK nachahmen, sind wichtig, um die Komplexität von KHK und die Mechanismen, die sie verursachen, zu verstehen.
Dieser Artikel skizziert eine Pipeline zur Charakterisierung kardialer Phänotypen in Mausmodellen. Die angewandten Methoden verwenden das fetale Echokardiogramm 7, gefolgt von der Nekropsie und der EZM-Histopathologie 7,8, die die detaillierte Anatomie der sich entwickelnden murinen Herzphänotypen darstellen können. Ein fetales Echokardiogramm ist eine nichtinvasive Methode, die eine direkte Visualisierung mehrerer Embryonen mit angemessener Bildauflösung ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht ein fetales Echokardiogramm eine schnelle Bestimmung der Gesamtzahl der Embryonen in einem Wurf, ihrer Entwicklungsstadien sowie der relativen Orientierung und Lage im Gebärmutterhorn. Mit einem spektralen Doppler/Farbfluss können abnorme Embryonen anhand der Struktur, der hämodynamischen Störung, der Wachstumseinschränkung oder der Entwicklung von Hydrops identifiziert werden. Da es sich bei einer fetalen Echokardiogramm-Studie um eine nichtinvasive Technik handelt, kann sie verwendet werden, um an mehreren Tagen zu scannen und die Veränderungen der Hämodynamik oder der Herzmorphologie zu beobachten. Die Erstellung einer qualitativ hochwertigen Bildgebung von fetalen Echokardiogrammen erfordert Übung und Geschicklichkeit, da bestimmte Herzfehler aufgrund mangelnder Erfahrung und mangelnden Wissens übersehen werden können. Aus diesem Grund kann eine definitivere Analyse der Herzmorphologie durch eine Kombination von Nekropsie und EZM-Histopathologie erhalten werden. Die Nekropsie ermöglicht die direkte Visualisierung der Bogenstruktur, der relativen Beziehungen der Aorta und der Lungenarterie, der Größe der Ventrikel und Vorhöfe, der Position des Herzens relativ zur Brust und der bronchopulmonalen Strukturen. Innere Merkmale wie die Herzklappen und die Wandstärke können jedoch durch Obduktion allein schwer zu beurteilen sein. Daher wird die EZM-Histopathologie für eine schlüssige Diagnose empfohlen. Die ECM-Histopathologie ist eine hochauflösende Visualisierungstechnik, die sowohl eine 2D- als auch eine 3D-Rekonstruktion des Bildstapelsermöglicht 9. Diese Bilder werden durch serielle episkopische Fluoreszenzbildgebung einer in Paraffin eingebetteten Probe erhalten, während sie in einem konsistenten Intervall durch ein automatisches Mikrotom dünn geschnitten wird. Im Gegensatz zur klassischen Histologie werden Bilder als Ausschnitt erfasst, bevor sie aus dem Block herausgeschnitten werden, so dass alle Bilder innerhalb desselben Bezugssystems erfasst werden. Dadurch kann der von der ECM-Histopathologie erzeugte 2D-Bildstapel einfach und zuverlässig dreidimensional rekonstruiert werden. Dies geschieht mit einem DICOM-Viewer, der eine 3D-Visualisierung der Bilder in den drei anatomischen Ebenen ermöglicht: koronale, sagittal und transversal. Aus diesen hochauflösenden 3D-Rekonstruktionen kann eine definitive Herzdiagnose gestellt werden. Die Anwendung dieser drei verschiedenen Visualisierungsmodalitäten, entweder einzeln oder in Kombination, kann genaue Charakterisierungen von strukturellen Herzfehlern in Mausembryonen liefern.

<table><tbody><tr><td>1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), PH7.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Eppendorf Röhrchen (oder bevorzugtes Fläschchen für die Gewebeaufbewahrung)</td><td>SealRite</td><td>1615-5599</td><td></td></tr><tr><td>10% gepufferte Formalinphosphatlösung</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd (PFA) Fixiermittel&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>28908</td><td>4 % Arbeitskonzentration frisch zubereitet in 1x PBS bei 4 & Grad; C</td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6&ndash; 12-Well-Platte oder 20-ml-Fläschchen zur Lagerung von Embryonen</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop&nbsp;</td><td>Leica</td><td>MDG36</td><td></td></tr><tr><td>Präpariernadeln (Klasse A1 oder A2)</td><td>F.S.T</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Präparierplatte&nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>FB0875713</td><td>Petrischale mit Paraffinbasis</td></tr><tr><td>Einbettformen</td><td>Sakura</td><td>4133</td><td></td></tr><tr><td>Extra schmale Schere (10,5 cm)</td><td>F.S.T</td><td>14088-10</td><td>1&ndash; 2 Paar&nbsp;</td></tr><tr><td>Fidschi Anwendung/Bild J</td><td>NIH</td><td></td><td>Fiji.sc</td></tr><tr><td>Feine Spitze (0,05 mm x 0,01 mm) Präparierzange (11 cm)</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td>2 Paar</td></tr><tr><td>Heißzange&nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td>Zur Orientierung von Embryonen Industrieller</td></tr><tr><td>Marker für Wachsblöcke&nbsp;</td><td>Sharpie</td><td>2003898</td><td>Formatiert für den Laborgebrauch</td></tr><tr><td>Jenoptik ProgRes C14plus Mikroskopkamera&nbsp;</td><td>Jenoptik</td><td>017953-650-26</td><td></td></tr><tr><td>Jenoptik ProgRess CapturePro Erfassungssoftware</td><td>Jenoptik</td><td></td><td>jenoptik.com</td></tr><tr><td>Großglasbecher&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S111053</td><td>Zum Schmelzen von Paraffin</td></tr><tr><td>Leica M165 FC Binokularmikroskop (16,5:1 Zoomoptik)</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>OsiriX MD Version 12.0</td><td>OsiriX</td><td></td><td>osirix-viewer.com&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraplast Einbettung Paraffinwachs</td><td>Millipore Sigma</td><td>1003230215</td><td></td></tr><tr><td>Kleiner Glasbecher</td><td>Fisher Scientific</td><td>S111045</td><td></td></tr><tr><td>Kleiner, perforierter Löffel (14,5 cm)</td><td>F.S.T</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Vannas Schere (4&ndash; 8 mm)</td><td>F.S.T</td><td>15018-10</td><td>Ein Paar</td></tr><tr><td>Vevo2100 Ultrahochfrequenz-Ultraschall-Biomikroskop</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc.</td><td>Vevo2100</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fischer Chemikalie</td><td>UN1307</td><td></td></tr></tbody></table>

eine pipeline zur charakterisierung struktureller herzfehler in der fetalen maus

A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse

Angeborene Herzfehler (KHK) sind die Hauptursachen für den Tod von Säuglingen in den Vereinigten Staaten. In den 1980er Jahren und früher starben die meisten Patienten mit mittelschwerer oder schwerer KHK vor dem Erwachsenenalter, wobei die maximale Mortalität in der ersten Lebenswoche lag. Bemerkenswerte Fortschritte bei chirurgischen Techniken, diagnostischen Ansätzen und medizinischem Management haben zu deutlichen Verbesserungen der Ergebnisse geführt. Um den kritischen Forschungsbedarf des Verständnisses von angeborenen Herzfehlern zu decken, haben Mausmodelle eine ideale Forschungsplattform geschaffen, da sie eine sehr ähnliche Herzanatomie wie der Mensch und kurze Schwangerschaftsraten aufweisen. Die Kombination von Gentechnik mit Hochdurchsatz-Phänotypisierungswerkzeugen hat die Replikation und Diagnose von strukturellen Herzfehlern ermöglicht, um die molekularen Signalwege hinter KHK weiter aufzuklären. Der Einsatz der nicht-invasiven fetalen Echokardiographie zum Screening der kardialen Phänotypen in Mausmodellen in Verbindung mit der hohen Genauigkeit der episkopischen Fluoreszenzbilderfassung (EFIC) mittels episkopischer konfokaler Mikroskopie (ECM) Histopathologie mit dreidimensionalen (3D) Rekonstruktionen ermöglicht einen detaillierten Einblick in die Anatomie verschiedener angeborener Herzfehler. Dieses Protokoll beschreibt einen vollständigen Arbeitsablauf dieser Methoden, um eine genaue Diagnose von angeborenen Herzfehlern der Maus zu erhalten. Die Anwendung dieses Phänotypisierungsprotokolls auf Modellorganismen ermöglicht eine genaue KHK-Diagnose und liefert Einblicke in die Mechanismen der KHK. Die Identifizierung der zugrunde liegenden Mechanismen der KHK bietet Möglichkeiten für mögliche Therapien und Interventionen.

Die Mausembryonen mit signifikanten hämodynamischen Defekten erwiesen sich als embryonal tödlich. Eine Vielzahl von KHK kann durch das nichtinvasive fetale Echokardiogramm mit hoher Leistung unter Verwendung verschiedener Ansichten identifiziert werden (Abbildung 1).
Septumdefekte: Die häufigsten KHK sind Septumdefekte wie ein Ventrikelseptumdefekt (VSD), ein atrioventrikulärer Septumdefekt (AVSD) und ein Vorhofseptumdefekt (ASD)...

Dieser Artikel beschreibt die diagnostischen Methoden der angeborenen Herzfehler (KHK) der Maus unter Verwendung der fetalen Echokardiographie, der Nekropsie und der episkopischen Fluoreszenzbilderfassung (EFIC) unter Verwendung der episkopischen konfokalen Mikroskopie (ECM), gefolgt von einer dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion.

Eine Pipeline zur Charakterisierung struktureller Herzfehler in der fetalen Maus

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe ...

Dieses Protokoll beschreibt modernste Methoden zur Generierung hochauflösender Bildgebungsdaten für die Diagnose von angeborenen Herzfehlern. Wir führen funktionelle Beurteilungen mit nicht-invasiver fetaler Echokardiographie in Kombination mit Nekropsie und anschließender episkopaler konfokaler Mikroskopie-Histopathologie durch, um serielle 2D-Bildstapel und 3D-Rekonstruktionen für eine umfassende KHK-Diagnose zu erstellen. Diese Methode kann die detaillierten anatomischen Veränderungen nicht nur bei angeborenen Herzfehlern aufklären, sondern kann auch verwendet werden, um strukturelle Geburtsfehler in anderen Organen zu untersuchen, einschließlich kranialer Gesichtsfehler, Gliedmaßen- und Skelettanomalien sowie Defekte des Gehirns und anderer viszeraler Organe.Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang und Benjamin Glennon, alle Forscher aus unserem Labor, werden diese Verfahren demonstrieren. Nachdem Sie die Maus für den Eingriff vorbereitet haben, erwärmen Sie das Ultraschallgel auf eine Körpertemperatur und tragen Sie es großzügig auf den Bildgebungsbereich auf. Legen Sie dann den Schallkopf auf den Bauch, der in einer horizontalen Ebene ausgerichtet ist, und identifizieren Sie die Blase auf dem Bildschirm.Sobald die Blase identifiziert ist, scannen Sie kranial von der Blase, suchen Sie nach dem Fötus und bestimmen Sie das Gestationsalter, indem Sie die Krone auf die Rumpflänge messen. Als nächstes verwenden Sie den Farbdoppler, um den Blutfluss vom Herzen zu analysieren. Um das Eindringen von Fixiermitteln in die inneren Organe zu ermöglichen, machen Sie Schnitte im seitlichen Brustkorb und Bauch mit einer Pinzette oder einer Sezierschere und lassen Sie die Probe mindestens 24 Stunden in einem Kühlraum fixieren.Richten Sie dann die Software so ein, dass die Bilder mit einem Namen gespeichert werden, einschließlich der Identifizierung der Probe, der Vergrößerung des Mikroskops und des Bildinhalts. Stecken Sie die Probe durch ihre Handgelenke und Knöchel. Bevor Sie die Haut entlang der Mittelachse in Richtung Schwanz schneiden, heben Sie die Haut in der Mitte des Halses mit einer Pinzette an und schneiden Sie die Haut mit der Schere in Richtung der beiden Achselhöhlen.Schneiden Sie dann die Haut vom Nabel bis zu den Beinen. Stellen Sie nach dem Einbetten der Proben die Laserprojektionsposition auf die Mitte der Probe auf dem Bildschirm ein und stellen Sie den Zoomknopf auf 20x ein. Um die Auflösung zu optimieren, stellen Sie die Verstärkung auf 1.250 V ein.Maximieren Sie den blauen Bereich mit dem Fokusknopf und setzen Sie dann die Verstärkung für die Bildgebung auf ca. 750 V zurück. Als nächstes stellen Sie die Schneidemethode auf Auto um. Stellen Sie die Dicke auf etwa 50 Mikrometer ein und lassen Sie die Objektträger laufen.Hören Sie auf zu schneiden, wenn die Lunge und die Atemwege in Sicht sind. Wählen Sie eine Schnittstärke zwischen acht bis 10 Mikrometern und stoppen Sie die Live-Ansicht offen. Öffnen Sie Microtome Communicator, um die Bildgebung zu starten.Stellen Sie sicher, dass der temporäre Speicherordner leer ist, bevor Sie Bilder sammeln. Stoppen Sie die Bildsammlung, wenn keine feste Struktur sichtbar ist. Geben Sie die temporär gespeicherten Dateien in eine TIFF-Bildserie aus.Geben Sie für die Pixel-X-Auflösung und die Pixel-Y-Auflösung die Bildauflösung ein, indem Sie den Zoom angeben, der während der ECM-Bildgebung verwendet wird. Geben Sie für das Schichtintervall die Schichtdicke ein, die während der ECM-Bildgebung zum Schneiden verwendet wird. Verwenden Sie als Nächstes das WWWL-Tool, um die Fensterbreite und die Fensterebene anzupassen.Klicken Sie auf das Werkzeug und ziehen Sie es auf das Bild nach oben, um die Bildhelligkeit zu verringern, und nach unten, um sie zu erhöhen. Klicken Sie auf das Werkzeug und ziehen Sie es nach rechts, um den Bildkontrast zu verringern, und das linke Wort, um ihn zu erhöhen. Ziehen Sie die Bilder mit dem Schwenkwerkzeug an die gewünschten Positionen.Verwenden Sie das Zoom-Werkzeug, um das Bild zu vergrößern oder zu verkleinern, und das Drehen-Werkzeug, um das Bild wie gewünscht zu drehen. Klicken Sie nun auf die farbige Achse des ersten Fensters und ziehen Sie sie. Beachten Sie, wie sich die Ausrichtung der beiden anderen Bereiche durch Drehen dieser Achse ändert.Drehen Sie die Achsen der drei Felder, bis die drei Felder koronale, sagittale und transversale Ansichten der Probe darstellen. Sobald alle drei Panels entsprechend positioniert, ausgerichtet und aufgehellt sind, klicken Sie auf das Panel, das die koronale Ansicht darstellt. Klicken Sie dann auf der rechten Seite der Menüleiste auf Movie Export.Klicken Sie auf Stapel und ziehen Sie die Schieberegler "Von" und "Bis", um den gesamten Interessenbereich zu erfassen. Wählen Sie für das Intervall die Option "Identisch mit der Dicke" und speichern Sie das Video, das die Ausrichtung der Ansicht angibt. Das Echo zeigt ein intaktes Ventrikelseptum ohne intraventrikulären Shunt und normal verwandte große Arterien in der normalen Kontrolle, was durch ECM bestätigt wurde.Die Frontalansicht zeigt die Kommunikation zwischen LA, RA, LV und RV sowohl im Echo als auch in der ECM, was auf einen atrioventrikulären Septumdefekt hindeutet. Der Farbfluss zeigt den Fluss über LV und RV, der auf einen Ventrikelseptumdefekt hinweist. Echo und ECM zeigten einen doppelten Ausgang des rechten Ventrikels mit einem Ventrikelseptumdefekt zwischen LV und RV mit nebeneinander liegenden großen Arterien.Die Ultraschalldiagnostik des persistierenden Truncus arteriosus zeigt die Kommunikation zwischen LV und RV mit einem einzigen Abflusstrakt, der beide Ventrikel überlagert, was auch durch ECM im Stadium E14,5 bestätigt wurde. Die aus der ECM-Histologie gewonnenen Schnitte können für die Immunfärbung, die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung und sogar die Nukleinsäureextraktion für die Genotypisierung und das transkriptionelle Profiling oder die Proteinextraktion für die Proteomikanalyse weiterverarbeitet werden. Die Bilder aus der dreidimensionalen Rekonstruktion können für die Beurteilung von quantitativen Perimetern wie Fläche oder Volumen weiterverarbeitet werden.Eine genaue Phänotypisierung zur Identifizierung von Defekten in der kardiovaskulären Anatomie ist unerlässlich für die Etablierung von gentechnisch veränderten und mutierten Mausmodellen für angeborene Herzfehler, um die Pathomechanismen angeborener Herzfehler aufzuklären. Dies kann zu potenziellen Möglichkeiten führen, Therapien und Interventionen zu entwickeln, um das klinische Ergebnis bei Patienten mit angeborenen Herzfehlern zu verbessern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Fetalen und perinatalen Tod ist ein gemeinsames Merkmal bei der Untersuchung genetischer Veränderungen beeinflussen kardiale Entwicklung. Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung hat 2-D-Auflösung verbessert und kann ausgezeichnete Informationen über frühe Herz-Entwicklung bieten und ist eine ideale Methode, um die Auswirkungen auf die kardiale Struktur und Funktion vor dem Tod zu erkennen.

Murine fetale Echokardiographie

Ultrahochfrequenz-Ultraschall ist ein leistungsstarkes Live-Imaging-Tool, um Herzrhythmusstörungen bei Kleintieren zu untersuchen. Seine Nichtinvasivität ermöglicht die Aufrechterhaltung der physiologischen Zustand der Embryonen. Hier zeigen wir die Verwendung von M-Mode-Ultraschall, um die Herzfrequenz von Embryonen bei E18.5 in utero zu messen.

In utero Messung der Herzfrequenz in Mouse von Nichtinvasive M-Mode-Echokardiographie

Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Mutationen, die zu angeborenen Herzfehlern führen, profitieren von der in vivo Untersuchung der Herzstruktur während der Entwicklung, aber hochauflösende Strukturstudien im embryonalen Herzen der Maus sind technisch anspruchsvoll. In dieser Arbeit stellen wir eine robuste Immunfluoreszenz- und Bildanalysemethode vor, um Kardiomyozyten-spezifische Strukturen im sich entwickelnden Mausherz zu beurteilen.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der fetalen Maus bildgebenden Auflösung verbessert und bieten präzise nicht-invasive Charakterisierung der kardialen Entwicklung und strukturelle Mängel. Die hier beschriebenen Protokoll soll in Echtzeit fetalen Mäuse Echokardiographie in Vivodurchführen.

Fetale kardiovaskuläre Bildgebung mit einem Hochfrequenz-Ultraschall (30 / 45MHZ) Maus

Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Technik kombiniert mit optischen Ausgleich der murine Herz zu studieren.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Wir präsentieren Ihnen die Protokolle, um die Maus Herz Entwicklung mit ganzen Berg Epifluorescent Mikroskopie auf Mausembryonen seziert von ventrikulären spezifische MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht es uns, jede Stufe der ventrikulären Formation während der Maus Herz Entwicklung ohne arbeitsintensive histochemische Methoden direkt zu visualisieren.

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

In diesem Protokoll beschreiben wir Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Entwicklungsphänotypen bei Mäusen, die mit angeborenen Herzfehlern assoziiert sind.

Analyse von angeborenen Herzfehlern bei Mausembryonen mit qualitativen und quantitativen histologischen Methoden

Hier beschreiben wir einen korrelativen Workflow für die Exzision, Druckbeaufschlagung, Fixierung und Bildgebung der murinen Pulmonalklappe, um die grobe Konformation und lokale extrazelluläre Matrixstrukturen zu bestimmen.

Chirurgie und Probenverarbeitung zur korrelativen Bildgebung der murinen Pulmonalklappe

Das vorliegende Protokoll beschreibt die echokardiographische Beurteilung der linksventrikulären Morphologie, Funktion und des koronaren Blutflusses bei 7 Tage alten neugeborenen Mäusen.

Echokardiographische Charakterisierung der linksventrikulären Struktur, Funktion und Koronarfluss bei neugeborenen Mäusen

Lernen Sie eine Pipeline zur Diagnose struktureller Herzfehler bei fetalen Mäusen mittels Echokardiografie, Nekropsie und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende 3D-Rekonstruktionen für präzise anatomische Analysen.

Eine Pipeline zur Charakterisierung struktureller Herzfehler in der fetalen Maus

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