Un pipeline pour caractériser les malformations cardiaques structurelles chez la souris fœtale

Ce protocole décrit des méthodes de pointe pour générer des données d’imagerie à haute résolution pour le diagnostic des malformations cardiaques congénitales. Nous effectuons des évaluations fonctionnelles avec échocardiographie fœtale non invasive combinée à une nécropsie suivie d’une histopathologie de microscopie confocale épiscopale pour générer des piles d’images 2D en série et des reconstructions 3D pour un diagnostic complet des maladies coronariennes. Cette méthode peut élucider les changements anatomiques détaillés non seulement dans les cardiopathies congénitales, mais peut également être utilisée pour étudier les malformations congénitales structurelles dans d’autres organes, y compris les anomalies faciales crâniennes, les anomalies des membres et du squelette, ainsi que les anomalies du cerveau et d’autres organes viscéraux.

Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang et Benjamin Glennon, tous chercheurs de notre laboratoire, feront la démonstration de ces procédures. Après avoir préparé la souris pour la procédure, réchauffez le gel à ultrasons à une température corporelle et appliquez-le généreusement sur la zone d’imagerie. Placez ensuite le transducteur sur l’abdomen orienté dans un plan horizontal et identifiez la vessie sur l’écran.

Une fois la vessie identifiée, balayez crânienne de la vessie, recherchez le fœtus et déterminez l’âge gestationnel en mesurant la longueur de la couronne à la croupe. Ensuite, utilisez le Doppler couleur pour analyser le flux sanguin du cœur. Pour permettre la pénétration fixatrice dans les organes internes, faites des incisions dans le thorax latéral et l’abdomen à l’aide de forceps ou de ciseaux disséquants et laissez l’échantillon se fixer pendant au moins 24 heures dans une chambre froide.

Ensuite, configurez le logiciel pour enregistrer les images avec un nom, y compris l’identification de l’échantillon, le grossissement du microscope et le contenu de l’image. Épinglez l’échantillon à travers ses poignets et ses chevilles. Avant de couper la peau le long de l’axe médian vers la queue, soulevez la peau au milieu du cou à l’aide d’une pince et coupez la peau vers les deux aisselles avec les ciseaux.

Ensuite, coupez la peau de l’ombilic aux jambes. Après avoir incorporé les échantillons, réglez la position de projection laser au centre de l’échantillon sur l’écran et réglez le bouton de zoom sur 20x. Pour optimiser la résolution, réglez le gain sur 1, 250V.

Agrandissez la zone bleue à l’aide du bouton de mise au point, puis réinitialisez le gain à environ 750 V pour l’imagerie. Ensuite, basculez la méthode de coupe sur auto. Réglez l’épaisseur à environ 50 micromètres et exécutez les diapositives.

Arrêtez de couper lorsque les poumons et les voies respiratoires sont en vue. Choisissez une épaisseur de coupe comprise entre huit et 10 micromètres et arrêtez la vue en direct ouverte. Ouvrez Microtome Communicator pour démarrer l’imagerie.

Assurez-vous que le dossier de stockage temporaire est vide avant de collecter des images. Arrêtez la collection d’images lorsqu’aucune structure physique n’est visible. Extrayez les fichiers stockés temporaires dans une série d’images TIFF.

Pour la reconstruction d’images 3D, faites glisser et déposez les fichiers image dans le logiciel de traitement d’image. Une fois la fenêtre contextuelle affichée, sélectionnez les liens ou les fichiers à copier dans la base de données. Une fois le fichier ouvert, cliquez sur le menu Outils de reconstruction 3D 2D de la barre d’outils et sélectionnez MPR 3D.

Pour la résolution pixel X et la résolution pixel Y, entrez la résolution de l’image en donnant le zoom utilisé lors de l’imagerie ECM. Pour l’intervalle de tranche, entrez l’épaisseur de tranche utilisée pour couper pendant l’imagerie ECM. Ensuite, utilisez l’outil WWWL pour ajuster la largeur et le niveau de la fenêtre.

Cliquez et faites glisser l’outil sur l’image vers le haut pour diminuer la luminosité de l’image et vers le bas pour l’augmenter. Cliquez et faites glisser l’outil sur l’image vers la droite pour réduire le contraste de l’image et le mot gauche pour l’augmenter. Faites glisser les images dans les positions souhaitées à l’aide de l’outil panoramique.

Utilisez l’outil de zoom pour agrandir ou réduire l’image et l’outil de rotation pour faire pivoter l’image comme vous le souhaitez. Maintenant, cliquez et faites glisser l’axe coloré du premier panneau. Remarquez comment la rotation de cet axe modifie l’orientation des deux autres panneaux.

Faites pivoter les trois axes des panneaux jusqu’à ce qu’ils représentent des vues coronales, sagittales et transversales de l’échantillon. Une fois que les trois panneaux sont correctement positionnés, orientés et éclairés, cliquez sur le panneau représentant la vue coronale. Cliquez ensuite sur Exportation de film sur le côté droit de la barre de menus.

Cliquez sur batch et faites glisser les curseurs de et vers pour englober toute la région d’intérêt. Pour l’intervalle, sélectionnez l’option identique à l’épaisseur et enregistrez la vidéo en indiquant l’orientation des vues. L’écho montre un septum ventriculaire intact sans shunt intraventriculaire et de grandes artères normales dans le contrôle normal, ce qui a été confirmé par ECM.

La vue frontale montre la communication entre LA, RA, LV et RV à la fois dans l’écho et l’ECM, suggérant une communication interau-ventriculaire. Le flux de couleur démontre le flux à travers le BT et le RV indiquant un défaut septal ventriculaire. L’écho et l’ECM ont démontré une double sortie du ventricule droit avec un défaut septal ventriculaire entre le VG et le RV avec de grandes artères côte à côte.

Le diagnostic échographique du tronc artériel persistant démontre une communication entre le VG et le RV avec un seul appareil de sortie dominant les deux ventricules, également confirmé par ECM au stade E14.5. Les sections collectées à partir de l’histologie ECM peuvent être traitées ultérieurement pour l’immunomarquage, la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et même l’extraction d’acides nucléiques pour le génotypage et le profilage transcriptionnel ou l’extraction de protéines pour l’analyse protéomique. Les images de la reconstruction tridimensionnelle peuvent être traitées ultérieurement pour des évaluations de périmètres quantitatifs tels que la surface ou le volume.

Un phénotypage précis pour identifier les défauts de l’anatomie cardiovasculaire est essentiel pour établir des modèles de cardiopathie congénitale génétiquement modifiés et mutants afin d’élucider les mécanismes pathologiques de la cardiopathie congénitale. Cela peut mener à des opportunités potentielles qui développent des thérapies et des interventions pour améliorer les résultats cliniques chez les patients atteints de cardiopathie congénitale.