Name: Um Pipeline para Caracterizar Defeitos Cardíacos Estruturais em Rato Fetal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a caracterizar defeitos cardíacos estruturais em ratos fetais usando ecocardiografia fetal não invasiva, necropsia e microscopia confocal episcópica. Este método permite reconstrução 3D de alta resolução para diagnóstico preciso de cardiopatias congênitas.

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O uso de camundongos para esses estudos é necessário, pois os camundongos têm corações de quatro câmaras que podem imitar as DCCs humanas. Os camundongos receberam cuidados veterinários e foram alojados na instalação de cuidados com animais credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC) da instituição. Protocolos rigorosos foram seguidos para minimizar o desconforto, o estresse, a dor e a lesão dos camundongos. Os ratos foram sacrificados usando gás CO2 , o que é aceitável para pequenos roedores de acordo com as Diretrizes da Associação Médica Veterinária Americana sobre Eutanásia. Os estudos em camundongos neste manuscrito foram realizados com um protocolo IACUC aprovado na Universidade de Pittsburgh.
1. Ecocardiograma fetal
NOTA: Um ecocardiograma é uma ferramenta poderosa para identificar malformação cardiovascular e defeitos extracardíacos em camundongos. Devido ao pequeno tamanho dos embriões de camundongos (cerca de 1-2 mm no meio da gestação, 3,5 mm no nascimento), é necessário equipamento ecocardiográfico de ultra-alta frequência com biomicroscopia de ultrassom (UBM). O UBM fornece diferentes sondas de alta frequência (30-50 MHz) com uma pequena janela de imagem (15 mm x 14 mm) que fornece a resolução (30 μm axial x 68 μm lateral) para visualizar um feto de camundongo de cada vez. Um transdutor de 40 MHz fornece imagens de alta resolução para identificar fenótipos cardiovasculares7.
<ol><li>Ligue a máquina de ecocardiograma e selecione o programa Cardiologia. NOTA: O protocolo a seguir pode ser usado para qualquer fundo de rato do dia embrionário (E)14.5 a 19.5.</li>
	<li>Anestesiar o rato desejado em uma câmara de indução anestésica. Induzir anestesia usando uma concentração de 4% de isoflurano e oxigênio medicinal a uma taxa de fluxo de 1 L / min e reduzi-lo para 2%-3% para manutenção.</li>
	<li>Coloque o mouse na plataforma de imagem rapidamente. A plataforma de imagem tem aço aquecido para manter o mouse aquecido durante o procedimento. Coloque a boca e o nariz do rato no cone anestésico do nariz. Prenda os membros com fita adesiva para evitar o movimento. Monitore a frequência cardíaca para garantir que ela permaneça entre 400-450 bpm.</li>
	<li>Monitore a temperatura usando uma sonda de termômetro retal e certifique-se de que ela descansa a 37 °C ± 0,5 °C. Monitore a respiração para evitar hipóxia. Mantenha uma força suave na sonda para evitar danos. NOTA: Uma lâmpada de calor pode ser ajustada acima do mouse para evitar a hipotermia enquanto estiver sob e para se recuperar da anestesia. A pomada oftálmica Petrolatum pode ser usada como lubrificante para evitar olhos secos.</li>
	<li>Remova a pele do tórax e do abdômen usando creme depilatório. Aplique o creme e aguarde 3 min antes de remover. Limpe a área com etanol a 70%. O etanol funciona melhor do que a água como lubrificante de barbear.</li>
	<li>Aqueça o gel de ultrassom a uma temperatura corporal normal. Aplique o gel de ultrassom generosamente e coloque o transdutor no abdômen para orientá-lo em um plano horizontal e identificar a bexiga na tela. Uma vez que a bexiga é identificada, varredura cranialmente da bexiga e procure o feto. Meça o comprimento coroa-garupa para determinar a idade gestacional10 (Figura 1 e Tabela 1). NOTA: Altere as posições do transdutor para visualizar diferentes planos, incluindo os planos transversais de imagem de quatro câmaras, sagital e frontal/coronal7 (Figura 1).</li>
	<li>Use o Doppler colorido para analisar o fluxo sanguíneo do coração.</li>
	<li>Coloque o rato de volta na gaiola se os embriões não tiverem atingido a fase pretendida. Caso contrário, prepare o mouse para a colheita. NOTA: Certifique-se de que o rato já está acordado e a recuperar bem da anestesia antes de o colocar de volta na gaiola.</li>
	<li>Desligue o isoflurano e o oxigênio, limpe a área de trabalho e desligue a máquina. NOTA: É importante remover o gel do transdutor.</li>
</ol>2. Necropsia
NOTA: Uma vez que os fenótipos cardíacos anormais são suspeitos usando ecocardiografia fetal, os fetos são coletados e fixados via submersão de corpo inteiro na solução fixadora: fosfato de formalina tamponada a 10% ou paraformaldeído (PFA) a 4%. Inspecione a morfologia externa e interna da amostra, procurando anormalidades anatômicas macroscópicas ou malformações.
<ol><li>Prepare o mouse.<ol><li>Se o rato for um adulto, eutanasie o rato utilizando um protocolo CO2 padrão. Use fórceps ou tesoura dissecante para fazer incisões (cerca de 3 cm) no tórax lateral e abdômen para permitir a penetração do fixador nos órgãos internos. NOTA: A amostra deve ser fixada durante, pelo menos, 24 horas antes da necropsia, se o embrião for superior a E14.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Analise o exterior do corpo.<ol><li>Configure o software para salvar as imagens com um nome, incluindo a identificação da amostra, a ampliação do microscópio e o conteúdo da imagem. NOTA: A ampliação de 1,0x a 3,2x deve ser adequada para a imagem da maioria das estruturas em camundongos E14.5 ou mais.</li>
		<li>Coloque o mouse na placa sob a lente do estereomicroscópio. Encha a placa com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para cobrir completamente a amostra para evitar a desidratação e reflexão nas imagens. Ajuste a ampliação para que a tela inclua todo o embrião e, em seguida, tire uma foto dos lados esquerdo e direito do embrião. NOTA: O fundo da placa deve ser revestido em parafina, silício ou outro substrato para facilitar a fixação.</li>
		<li>Prenda a amostra através de sua garganta, virada para cima, e tire outra foto. NOTA: Oriente o pino ligeiramente para cima para garantir que nenhuma estrutura importante da cavidade torácica seja perfurada.</li>
	</ol></li>
	<li>Analise o peito.<ol><li>Ao levantar a pele no meio do pescoço com fórceps, corte a pele em direção a ambas as axilas com a tesoura antes de cortar a pele ao longo do eixo mediano em direção à cauda. Em seguida, corte a pele do umbigo para as pernas. Prenda a amostra através de seus pulsos e tornozelos. NOTA: Tenha cuidado para cortar apenas a pele. Recomenda-se segurar as lâminas da tesoura horizontalmente ou inclinadas para cima.</li>
		<li>Para quebrar o tecido conjuntivo, levante a pele com um par de pinças enquanto mantém o tecido subjacente no lugar com o outro par. Fixe a amostra através da pele para ajudar a expor o tórax e o abdômen (Figura 2). NOTA: Muito alongamento durante a fixação, corte ou raspagem pode resultar em danos nos tecidos.</li>
		<li>Tire uma foto dos músculos expostos e, em seguida, raspe suavemente os músculos para expor as costelas.</li>
		<li>Tire uma foto das costelas expostas. Separe as costelas do diafragma e corte as costelas de ambos os lados, tanto quanto possível, no eixo lateral em direção ao pescoço.</li>
		<li>Exponha o coração removendo as costelas cortadas. Tire uma foto do coração.</li>
		<li>Remova o timo descascando-o com um par de fórceps. Use o outro par de fórceps para estabilizar a base do timo para evitar rasgar quaisquer vasos subjacentes. Tire fotos do coração e dos grandes vasos. NOTA: O uso de pinos para esticar algumas estruturas adjacentes pode ajudar a obter melhores visualizações de imagem. Além disso, tire fotos separadas focadas nas grandes artérias, coração e outras estruturas de interesse, pois elas podem não estar em foco juntas.</li>
	</ol></li>
	<li>Analise o abdômen.<ol><li>Puxe o diafragma para removê-lo e expor o fígado. Tire uma foto.</li>
		<li>Prenda de volta o fígado para expor o estômago e o pâncreas. Tire uma foto.</li>
		<li>Corte o esôfago. Remova o cólon e os intestinos, puxando-os para fora com fórceps. Corte logo acima do fígado e remova-o para revelar os rins e as glândulas suprarrenais. Tire uma foto. NOTA: Os órgãos removidos devem ser mantidos na solução fixadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Isole o tórax para a análise da MEC.<ol><li>Corte o tórax inferior ao longo de uma linha reta entre o fígado e os pulmões. Corte a cabeça alto o suficiente para não cortar as ramificações das artérias carótidas.</li>
		<li>Remova suavemente as costelas laterais, mantendo as costelas dorsais e a coluna vertebral. Descasque e raspe a gordura dorsal.</li>
		<li>Separe o tórax do resto do corpo e coloque-o em uma solução de fosfato de formalina tamponada a 10%.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Incorporação
<ol><li>Decantar o fixador em uma garrafa de resíduos perigosos apropriada. Lave as amostras com 1x PBS por 15 min três vezes.</li>
	<li>Use concentrações crescentes de etanol e xileno para desidratar as amostras. A duração de todas as etapas a seguir depende do estágio dos embriões. Consulte a Tabela 2 para obter detalhes. NOTA: Deve-se ter cuidado ao mudar as soluções para evitar danificar as amostras. Os parâmetros ideais para o processamento de amostras podem ser ajustados empiricamente. O xileno irá dissolver certos plásticos; devem ser utilizados instrumentos e recipientes de vidro.</li>
	<li>Substitua o xileno por parafina pela duração desejada. Deixar os frascos numa incubadora a 65 °C durante o período adequado (quadro 2).</li>
	<li>Use parafina fresca para incorporar as amostras na posição desejada. NOTA: Recomenda-se orientar a amostra para o meio do bloco de parafina, com seu lado dorsal voltado para o topo e o lado posterior voltado para a frente do bloco. Ao orientar a amostra, lembre-se de que a amostra está embutida com o bloco virado de cabeça para baixo.</li>
</ol>4. Microscopia confocal episcópica (MEC)
NOTA: Após a incorporação adequada, os embriões são submetidos à coleta de imagens em série via ECM para análise histopatológica. Lâminas individuais podem ser recuperadas do micrótomo para estudos adicionais.
<ol><li>Retire o bloco de parafina do congelador a -20 °C e retire os moldes metálicos.</li>
	<li>Use uma lâmina de barbear para aparar a cera nas bordas e na parte de trás do. Corte a cera que rodeia a amostra até que esteja envolta num pequeno quadrado de cera preso à. NOTA: Tenha extremo cuidado ao manusear lâminas.</li>
	<li>Use a alavanca de metal para prender o bloco de parafina contra o estágio de corte do micrótomo. Selecione a função MAN (manual) no Modo de execução, levante a superfície da parafina perto da lâmina e execute alguns slides para garantir que a lâmina entre em contato com o bloco de parafina.</li>
	<li>Abra o aplicativo LAS AF e selecione MatrixScreener. Selecione Matriz Regular Única e carregue o modelo apropriado salvo anteriormente. Clique no botão Quick LUT para mudar para ombre branco e laranja.</li>
	<li>Selecione Configurar trabalhos e arraste o laser visível de 405 nm até o máximo. Combine a borda esquerda do bloco de espectro com a linha de 405 nm e arraste a borda direita para a linha de 800 nm. Marque a opção Pinhole e inicie a Visualização dinâmica.</li>
	<li>Ajuste a posição da projeção a laser para centralizar a amostra na tela e ajuste o botão Zoom para ~20x. Para otimizar a resolução, defina o ganho para 1.250 V e maximize a área azul usando o botão de foco; em seguida, redefina o ganho para aproximadamente 750 V para geração de imagens. NOTA: Valores específicos podem variar dependendo da condição do embrião.</li>
	<li>Alterne o método de corte para Auto, defina a espessura para cerca de 50 μm e execute os slides. Pare de cortar quando os pulmões e as vias aéreas estiverem à vista.</li>
	<li>Escolha uma espessura de corte entre 8-10 μm e pare a Visualização dinâmica. Abra o Microtome Communicator para iniciar a geração de imagens. Verifique se a pasta de armazenamento temporário está vazia antes de coletar imagens.</li>
	<li>Pare de cortar quando nenhuma estrutura cardíaca adicional for visualizada. Feche o aplicativo Microtome Communicator e exporte o arquivo temporário para uma série de imagens .tiff por meio do software de processamento de imagem para reconstruções 3D posteriores.</li>
</ol>5. Reconstrução tridimensional (3D)
NOTA: O objetivo da reconstrução 3D é processar uma pilha de imagens 2D de imagens ECM em vídeos 3D nas orientações coronal, sagital e transversal e usar os vídeos 3D para o diagnóstico das anormalidades estruturais e anatômicas nas amostras.
<ol><li>Abra a pilha de imagens ECM no software de processamento de imagens.<ol><li>Arraste e solte a imagem dos arquivos no software de processamento de imagem. Inverta as imagens ECM horizontalmente selecionando Imagem > Transformar > Inverter horizontalmente na barra de menus.</li>
		<li>Salve a imagem invertida e feche o software de processamento de imagem.</li>
	</ol></li>
	<li>Importe a pilha de imagens ECM no software de visualização DICOM.<ol><li>Arraste e solte as imagens ECM viradas horizontalmente no software de visualização DICOM. Verifique se há uma borda azul clara ao redor da lista de exemplo, ou imagens podem ser adicionadas a uma pasta de exemplo existente.</li>
		<li>Selecione os links ou os arquivos a serem copiados para o banco de dados quando a janela pop-up for exibida. Um novo exemplo aparecerá na lista de exemplos com o mesmo nome do arquivo copiado para o software de exibição DICOM.</li>
		<li>Clique no arquivo recém-adicionado para abri-lo.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar reconstrução 3D.<ol><li>Uma vez que o arquivo é aberto, clique no menu Ferramentas de reconstrução 2D / 3D na barra de ferramentas e selecione 3D MPR.</li>
		<li>Para Resolução de Pixel X e Resolução de Pixel Y, insira a resolução da imagem fornecendo o zoom usado durante a geração de imagens de ECM. Para o Intervalo de fatia, insira a espessura da fatia usada para cortar durante a imagem de ECM. NOTA: A resolução da câmera muda dependendo do zoom da câmera e pode diferir de câmera para câmera.</li>
	</ol></li>
	<li>Use as diferentes ferramentas da guia Ferramentas no lado esquerdo para ajustar as pilhas de imagens conforme desejado.<ol><li>Use a ferramenta WW/WL para ajustar a largura da janela e o nível da janela. Clique e arraste a ferramenta na imagem para cima para diminuir o brilho da imagem e para baixo para aumentá-la. Clique e arraste a ferramenta na imagem para a direita para diminuir o contraste da imagem e para a esquerda para aumentá-la. NOTA: As configurações ideais de WW/WL para uma estrutura podem estar abaixo do ideal para outra. Por esse motivo, recomenda-se a criação de vídeos separados para visualizar diferentes estruturas.</li>
		<li>Use a ferramenta Panorâmica para arrastar as imagens para as posições desejadas. Use a ferramenta Zoom para ampliar ou reduzir a imagem conforme desejado e a ferramenta Girar para girar a imagem conforme desejado. Observação : ampliar imagens pode causar diminuição da qualidade da imagem. Seja cauteloso ao girar imagens, pois isso pode fazer com que os eixos se invertam.</li>
	</ol></li>
	<li>Clique e arraste o eixo colorido do primeiro painel. Observe como a rotação desse eixo altera a orientação dos outros dois painéis. Gire os eixos dos três painéis até que os três painéis representem vistas coronais, sagitais e transversais da amostra. NOTA: Ao reorientar as amostras, mantenha a orientação anterior/posterior correta.</li>
	<li>Gerar vídeos.<ol><li>Uma vez que todos os três painéis estejam devidamente posicionados, orientados e iluminados, clique no painel que representa a visão coronal.</li>
		<li>Clique em Exportação de filme no lado direito da barra de menus. Clique em Lote e arraste os controles deslizantes De e Para para abranger toda a região de interesse. Para Intervalo, selecione a opção Igual a Espessura . Salve o vídeo indicando a orientação da exibição.</li>
		<li>Revise o vídeo para ver se as estruturas de interesse podem ser adequadamente identificadas. Caso contrário, use as ferramentas (etapa 5.4) para reajustar os vídeos conforme necessário e salvá-lo novamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Repita a etapa 5.6 para vistas transversais e sagitais. Diagnosticar as amostras usando vídeos reconstruídos. NOTA: Assista atentamente aos vídeos em cada orientação para fazer uma avaliação completa se a amostra apresenta alguma anormalidade anatômica ou fenótipos de doença (Figura 3).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste manuscrito.

Camundongos geneticamente modificados têm sido usados para entender os patomecanismos de defeitos cardíacos congênitos. Os protocolos que fornecemos neste estudo tentam agilizar e padronizar o processo de avaliação de defeitos cardíacos fetais murinos. No entanto, existem etapas críticas a serem observadas durante o protocolo. Os embriões de camundongos crescem significativamente durante cada dia de gestação, e o tempo correto para colher um camundongo pode ser determinado pela realização de um ecocardiograma fetal com p...

As cardiopatias congênitas (DCC) são o defeito congênito neonatal mais comum 1,2, acometendo cerca de 0,8%-1,7% dos neonatos e resultando em mortalidade e morbidade neonatais significativas3. A etiologia genética é fortemente indicada com DCC 4,5. Modelos de camundongos geneticamente modificados têm sido amplamente utilizados para entender a complexidade das DCCs e os mecanismos que as causam devido aos camundongos terem corações de quatro câmaras e sequências de DNA de desenvolvimento cardíaco comparáveis em fetos de camundongos e humanos6. Identificar o fenótipo dos mutantes de camundongos é o primeiro passo fundamental para caracterizar a função do gene alvo. Modelos de camundongos que expressam efeitos de dosagem gênica, nos quais uma única mutação genética pode resultar em um espectro de defeitos cardíacos que imitam as DCCs humanas, são importantes para a compreensão da complexidade das DCCs e dos mecanismos que as causam.
Este artigo descreve um pipeline para caracterizar fenótipos cardíacos em modelos de camundongos. Os métodos aplicados utilizam o ecocardiograma fetal 7, seguido de necropsia e histopatologia da MEC7,8, que pode exibir a anatomia detalhada do desenvolvimento de fenótipos cardíacos murinos. O ecocardiograma fetal é uma modalidade não invasiva que permite a visualização direta de múltiplos embriões com resolução de imagem razoável. Além disso, um ecocardiograma fetal fornece uma determinação rápida do número total de embriões em uma ninhada, seus estágios de desenvolvimento e a orientação relativa e localização no corno uterino. Usando um Doppler/fluxo de cor espectral, embriões anormais podem ser identificados com base na estrutura, no distúrbio hemodinâmico, na restrição de crescimento ou no desenvolvimento de hidropisia hidropissexual. Como o estudo do ecocardiograma fetal é uma técnica não invasiva, ele pode ser usado para fazer a varredura em vários dias e observar as alterações na hemodinâmica ou morfologia cardíaca. A obtenção de imagens de alta qualidade de ecocardiogramas fetais requer prática e habilidade, pois defeitos cardíacos específicos podem ser perdidos devido à falta de experiência e conhecimento. Devido a isso, uma análise mais definitiva da morfologia cardíaca pode ser obtida através de uma combinação de necropsia e histopatologia da MEC. A necropsia fornece visualização direta da estrutura do arco, das relações relativas da aorta e da artéria pulmonar, do tamanho dos ventrículos e átrios, da posição do coração em relação ao tórax e das estruturas broncopulmonares. No entanto, características internas, como as válvulas cardíacas e a espessura da parede, podem ser difíceis de avaliar apenas através da necropsia. Assim, a histopatologia da ECM é recomendada para um diagnóstico conclusivo. A histopatologia da ECM é uma técnica de visualização de alta resolução que permite a reconstrução 2D e 3D da pilha de imagens9. Essas imagens são obtidas por meio de imagens fluorescentes episcoscópicas seriais de uma amostra embutida em parafina, pois é finamente seccionada em um intervalo consistente por um micrótomo automático. Ao contrário da histologia clássica, as imagens são capturadas como uma seção antes de serem cortadas do bloco, de modo que todas as imagens sejam capturadas dentro do mesmo quadro de referência. Devido a isso, a pilha de imagens 2D produzida pela histopatologia da ECM pode ser facilmente e de forma confiável reconstruída em três dimensões. Isso é feito usando um visualizador DICOM, que permite a visualização 3D das imagens nos três planos anatômicos: coronal, sagital e transversal. A partir dessas reconstruções 3D de alta resolução, um diagnóstico cardíaco definitivo pode ser feito. A aplicação dessas três diferentes modalidades de visualização, individualmente ou em combinação, pode fornecer caracterizações precisas de defeitos cardíacos estruturais em embriões de camundongos.

<table><tbody><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato (PBS), PH7.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos Eppendorf (ou frasco preferido para armazenamento de tecidos)</td><td>SealRite</td><td>1615-5599</td><td></td></tr><tr><td>Solução de fosfato de formalina tamponada a 10%</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldeído (PFA) fixador&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>28908</td><td>4% de concentração de trabalho recém-preparada em 1x PBS a 4 &graus; Tubos C</td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6&ndash; Placa de 12 poços ou frasco de 20 mL&nbsp; para armazenamento de embriões</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação&nbsp;</td>Pinos de Dissecação <td>Leica</td><td>MDG36</td><td></td></tr><tr><td>(grau A1 ou A2)</td><td>F.S.T</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Dissecação&nbsp;</td>Placa <td>de</td> Petri <td>FB0875713 F.S.T</td><td>com base em parafina</td></tr><tr><td>Moldes de embutir</td><td>Sakura</td><td>4133</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura extra estreita (10,5 cm)</td><td>F.S.T</td><td>14088-10</td><td>1&ndash; 2 pares&nbsp;</td></tr><tr><td>Aplicação/Imagem Fiji J</td><td>NIH</td><td></td><td>Fiji.sc</td></tr><tr><td>Ponta fina (0,05 mm x 0,01 mm) Pinça de dissecação (11 cm)</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td>2 Pares</td></tr><tr><td>de pinças quentes&nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td>Para orientação de embriões</td></tr><tr><td>Marcador Industrial para Blocos de Cera&nbsp;</td><td>Sharpie</td><td>2003898</td><td>Formatado para uso em laboratório</td></tr><tr><td>Câmera de microscópio Jenoptik ProgRes C14plus&nbsp;</td><td>Jenoptik</td><td>017953-650-26</td><td></td></tr><tr><td>Jenoptik ProgRess CapturePro software de aquisição</td><td>Jenoptik</td><td></td><td>jenoptik.com</td></tr><tr><td>Grande copo de vidro&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S111053</td><td>Para derreter parafina</td></tr><tr><td>Microscópio binocular Leica M165 FC (óptica zoom 16.5:1)</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>OsiriX MD Versão 12.0</td><td>OsiriX</td><td></td><td>osirix-viewer.com&nbsp;</td></tr>Copo <tr><td>de vidro pequeno</td><td>Fisher Scientific</td><td>1003230215</td> Fisher Scientific S111045 <td></td></tr><tr><td>Colher pequena perfurada (14,5 cm)</td><td>F.S.T</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Tesoura Reta Vannas (4&ndash;<td></td></tr><tr><td> 8 mm)</td> <td>FST</td><td>15018-10</td><td>Um par</td></tr><tr><td>de biomicroscópio de ultrassom de ultra-alta frequência Vevo2100</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc.</td><td>Vevo2100</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Químico</td><td>UN1307</td><td></td></tr></tbody></table>

um pipeline para caracterizar defeitos cardíacos estruturais em rato fetal

A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse

As cardiopatias congênitas (DCC) são as principais causas de morte infantil nos Estados Unidos. Na década de 1980 e anteriores, a maioria dos pacientes com DCC moderada ou grave morreu antes da idade adulta, com a mortalidade máxima durante a primeira semana de vida. Avanços notáveis em técnicas cirúrgicas, abordagens diagnósticas e manejo médico levaram a melhorias marcantes nos resultados. Para atender às necessidades críticas de pesquisa da compreensão de defeitos cardíacos congênitos, os modelos murinos forneceram uma plataforma de pesquisa ideal, pois têm anatomia cardíaca muito semelhante à dos seres humanos e taxas de gestação curtas. A combinação de engenharia genética com ferramentas de fenotipagem de alto rendimento permitiu a replicação e o diagnóstico de defeitos cardíacos estruturais para elucidar ainda mais as vias moleculares por trás das DCC. O uso da ecocardiografia fetal não invasiva para rastrear os fenótipos cardíacos em modelos de camundongos, juntamente com a alta fidelidade da captura de imagem de fluorescência episcópica (EFIC) usando a histopatologia da microscopia confocal episcopada (ECM) com reconstruções tridimensionais (3D), permite uma visão detalhada da anatomia de vários defeitos cardíacos congênitos. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho completo desses métodos para obter um diagnóstico preciso de defeitos cardíacos congênitos murinos. A aplicação deste protocolo de fenotipagem a organismos modelo permitirá um diagnóstico preciso de DCC, produzindo insights sobre os mecanismos da DCC. Identificar os mecanismos subjacentes da DCC oferece oportunidades para potenciais terapias e intervenções.

Os embriões de camundongos com defeitos hemodinâmicos significativos foram observados como embrionários letais. Uma grande variedade de DCC pode ser identificada através do ecocardiograma fetal não invasivo de alto débito, utilizando diferentes pontos de vista (Figura 1).
Defeitos septais: As DCC mais comuns são defeitos septais, como um defeito do septo ventricular (CIV), um defeito do septo atrioventricular (DSAV) e um defeito do septo atrial (T...

Este artigo detalha os métodos diagnósticos de cardiopatia congênita murina (DCC) usando ecocardiografia fetal, necropsia e captura de imagem de fluorescência episcópica (EFIC) usando microscopia confocal episcópica (ECM) seguida de reconstrução tridimensional (3D).

Um Pipeline para Caracterizar Defeitos Cardíacos Estruturais em Rato Fetal

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe ...

Este protocolo descreve métodos de ponta para gerar dados de imagem de alta resolução para diagnosticar defeitos cardíacos congênitos. Realizamos avaliações funcionais com ecocardiografia fetal não invasiva combinada com necropsia seguida de histopatologia por microscopia confocal episcopal para gerar pilhas de imagens 2D seriadas e reconstruções 3D para diagnóstico abrangente de DCC. Este método pode elucidar as alterações anatômicas detalhadas não apenas em cardiopatias congênitas, mas também pode ser usado para investigar defeitos congênitos estruturais em outros órgãos, incluindo defeitos cranianos faciais, anomalias de membros e esqueléticos, bem como defeitos do cérebro e outros órgãos viscerais.Demonstrando esses procedimentos estarão Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang e Benjamin Glennon, todos pesquisadores do nosso laboratório. Depois de preparar o rato para o procedimento, aqueça o gel de ultrassom a uma temperatura corporal e aplique-o generosamente sobre a área de imagem. Em seguida, coloque o transdutor no abdômen orientado em um plano horizontal e identifique a bexiga na tela.Uma vez que a bexiga é identificada, varredura cranialmente da bexiga, procure o feto e determine a idade gestacional medindo o comprimento da coroa à garupa. Em seguida, use o doppler colorido para analisar o fluxo sanguíneo do coração. Para permitir a penetração fixadora nos órgãos internos, faça incisões no tórax lateral e no abdômen usando fórceps ou tesoura dissecante e permita que a amostra se fixe por pelo menos 24 horas em uma câmara fria.Em seguida, configure o software para salvar as imagens com um nome, incluindo a identificação da amostra, a ampliação do microscópio e o conteúdo da imagem. Prenda a amostra através de seus pulsos e tornozelos. Antes de cortar a pele ao longo do eixo mediano em direção à cauda, levante a pele no meio do pescoço usando fórceps e corte a pele em direção a ambas as axilas com a tesoura.Em seguida, corte a pele do umbigo para as pernas. Depois de incorporar as amostras, ajuste a posição de projeção do laser para o centro da amostra na tela e ajuste o botão de zoom para 20x. Para otimizar a resolução, defina o ganho como 1, 250V.Maximize a área azul usando o botão de foco e, em seguida, redefina o ganho para aproximadamente 750V para geração de imagens. Em seguida, alterne o método de corte para automático. Defina a espessura para cerca de 50 micrômetros e execute os slides.Pare de cortar quando os pulmões e as vias aéreas estiverem à vista. Escolha uma espessura de corte entre oito a 10 micrômetros e pare a visualização ao vivo aberta. Abra o Microtome Communicator para iniciar a geração de imagens.Verifique se a pasta de armazenamento temporário está vazia antes de coletar imagens. Pare a coleção de imagens quando nenhuma estrutura rígida estiver visível. Saída dos arquivos armazenados temporariamente em uma série de imagens TIFF.Para a reconstrução de imagem 3D, arraste e solte os arquivos de imagem no software de processamento de imagem. Quando a janela pop-up aparecer, selecione os links ou os arquivos a serem copiados para o banco de dados. Uma vez que o arquivo é aberto, clique no menu de ferramentas de reconstrução 2D 3D na barra de ferramentas e selecione 3D MPR.Para resolução de pixel X e resolução de pixel Y, insira a resolução da imagem fornecendo o zoom usado durante a geração de imagens ECM. Para o intervalo de fatia, insira a espessura da fatia usada para cortar durante a imagem de ECM. Em seguida, use a ferramenta WWWL para ajustar a largura e o nível da janela.Clique e arraste a ferramenta na imagem para cima para diminuir o brilho da imagem e para baixo para aumentá-la. Clique e arraste a ferramenta na imagem para a direita para diminuir o contraste da imagem e a palavra esquerda para aumentá-la. Arraste as imagens para as posições desejadas usando a ferramenta de panorâmica.Use a ferramenta de zoom para ampliar ou reduzir a imagem e a ferramenta girar para girar a imagem conforme desejado. Agora, clique e arraste o eixo colorido do primeiro painel. Observe como a rotação desse eixo altera a orientação dos outros dois painéis.Gire os três eixos dos painéis até que os três painéis representem as vistas coronal, sagital e transversal da amostra. Uma vez que todos os três painéis estejam adequadamente posicionados, orientados e iluminados, clique no painel que representa a vista coronal. Em seguida, clique em Exportação de filme no lado direito da barra de menus.Clique em lote e arraste os controles deslizantes de e para para abranger toda a região de interesse. Para intervalo, selecione a mesma opção de espessura e salve o vídeo indicando a orientação das visualizações. A ecocardiografia mostra septo ventricular íntegro sem shunt intraventricular e grandes artérias normais relacionadas no controle normal, o que foi confirmado pela MEC.A visão frontal demonstra comunicação entre LA, AR, VE e VD tanto na eco quanto na ECM, sugerindo comunicação do septo atrioventricular. O fluxo de cor demonstra o fluxo através do VE e do VD, indicando defeito do septo ventricular. A ecocardiografia e a MEC demonstraram dupla saída do ventrículo direito com defeito do septo ventricular entre o VE e o VD com grandes artérias lado a lado.O diagnóstico ultrassonográfico de truncus arteriosus persistente demonstra comunicação entre VE e VD com uma única via de saída sobrepondo-se a ambos os ventrículos, também confirmada pela MEC no estágio E14.5. Os cortes coletados da histologia da MEC podem ser processados para imunocoloração, coloração de hematoxilina e eosina e até mesmo extração de ácido nucleico para genotipagem e perfil transcricional ou extração de proteínas para análise proteômica. As imagens da reconstrução tridimensional podem ser processadas para avaliações de perímetros quantitativos, como área ou volume.A fenotipagem precisa para identificar defeitos na anatomia cardiovascular é essencial para o estabelecimento de modelos geneticamente modificados e mutantes de doença cardíaca congênita em camundongos para elucidar os patomecanismos da cardiopatia congênita. Isso pode levar a potenciais oportunidades que desenvolvem terapias e intervenções para melhorar o desfecho clínico em pacientes com cardiopatia congênita.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Morte fetal e perinatal é uma característica comum quando se estuda alterações genéticas que afetam o desenvolvimento cardíaco. De alta freqüência ultra-sonografia tem melhorado 2-D resolução e pode fornecer excelentes informações sobre o desenvolvimento cardíaco precoce e é um método ideal para detectar o impacto sobre a estrutura e função cardíaca antes da morte.

Ecocardiografia Fetal murino

Ultra-alta freqüência ultra-som é uma ferramenta de imagem ao vivo poderoso para examinar anormalidades cardíacas em pequenos animais. Sua noninvasiveness permite manter o estado fisiológico de embriões. Aqui, vamos mostrar o uso do M-modo ultra-som para medir os batimentos cardíacos de embriões em E18.5 no útero.

Na medição utero da frequência cardíaca em rato por não invasiva em modo M Ecocardiografia

Nós descrevemos uma série de métodos para injectar corantes, os vectores de ADN, vírus e células, a fim de controlar tanto o destino celular e fenótipo das células endógenas e enxertados derivados de células embrionárias ou pluripotentes dentro de embriões de ratinho no dia embrionário (E) 9,5 e as fases posteriores de desenvolvimento.

Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

Mutações que levam a defeitos cardíacos congênitos se beneficiam da investigação in vivo da estrutura cardíaca durante o desenvolvimento, mas estudos estruturais de alta resolução no coração embrionário de camundongos são tecnicamente desafiadores. Aqui apresentamos um método robusto de imunofluorescência e análise de imagem para avaliar estruturas específicas de cardiomiócitos no coração de camundongo em desenvolvimento.

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

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Imagem cardiovascular fetal de camundongo usando um sistema de ultrassom de alta frequência (30/45MHZ)

Este estudo utiliza uma técnica de microscopia (LSFM) de fluorescência de luz-folha de iluminação dupla face combinada com compensação óptica para estudar o coração murino.

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Apresentamos os protocolos para examinar o desenvolvimento de coração de rato usando microscopia epifluorescente de montagem toda em embriões de rato dissecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos. Este método nos permite visualizar diretamente a cada estágio da formação ventricular durante o desenvolvimento de coração de rato sem métodos histoquímicos trabalho intensivos.

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Neste protocolo, descrevemos procedimentos para analisar qualitativamente e quantitativamente fenótipos de desenvolvimento em camundongos associados a defeitos cardíacos congênitos.

Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho correlativo para a excisão, pressurização, fixação e imagem da válvula pulmonar murina para determinar a conformação bruta e as estruturas da matriz extracelular local.

Cirurgia e Processamento de Amostras para Imagem Correlativa da Válvula Pulmonar Murina

O presente protocolo descreve a avaliação ecocardiográfica da morfologia, função e fluxo sanguíneo coronariano do ventrículo esquerdo em camundongos recém-nascidos de 7 dias de idade.

Caracterização ecocardiográfica da estrutura, função e fluxo coronariano do ventrículo esquerdo em camundongos recém-nascidos

Aprenda a caracterizar defeitos cardíacos estruturais em ratos fetais usando ecocardiografia fetal não invasiva, necropsia e microscopia confocal episcópica. Este método permite reconstrução 3D de alta resolução para diagnóstico preciso de cardiopatias congênitas.

Um Pipeline para Caracterizar Defeitos Cardíacos Estruturais em Rato Fetal

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