Um Pipeline para Caracterizar Defeitos Cardíacos Estruturais em Rato Fetal

Este protocolo descreve métodos de ponta para gerar dados de imagem de alta resolução para diagnosticar defeitos cardíacos congênitos. Realizamos avaliações funcionais com ecocardiografia fetal não invasiva combinada com necropsia seguida de histopatologia por microscopia confocal episcopal para gerar pilhas de imagens 2D seriadas e reconstruções 3D para diagnóstico abrangente de DCC. Este método pode elucidar as alterações anatômicas detalhadas não apenas em cardiopatias congênitas, mas também pode ser usado para investigar defeitos congênitos estruturais em outros órgãos, incluindo defeitos cranianos faciais, anomalias de membros e esqueléticos, bem como defeitos do cérebro e outros órgãos viscerais.

Demonstrando esses procedimentos estarão Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang e Benjamin Glennon, todos pesquisadores do nosso laboratório. Depois de preparar o rato para o procedimento, aqueça o gel de ultrassom a uma temperatura corporal e aplique-o generosamente sobre a área de imagem. Em seguida, coloque o transdutor no abdômen orientado em um plano horizontal e identifique a bexiga na tela.

Uma vez que a bexiga é identificada, varredura cranialmente da bexiga, procure o feto e determine a idade gestacional medindo o comprimento da coroa à garupa. Em seguida, use o doppler colorido para analisar o fluxo sanguíneo do coração. Para permitir a penetração fixadora nos órgãos internos, faça incisões no tórax lateral e no abdômen usando fórceps ou tesoura dissecante e permita que a amostra se fixe por pelo menos 24 horas em uma câmara fria.

Em seguida, configure o software para salvar as imagens com um nome, incluindo a identificação da amostra, a ampliação do microscópio e o conteúdo da imagem. Prenda a amostra através de seus pulsos e tornozelos. Antes de cortar a pele ao longo do eixo mediano em direção à cauda, levante a pele no meio do pescoço usando fórceps e corte a pele em direção a ambas as axilas com a tesoura.

Em seguida, corte a pele do umbigo para as pernas. Depois de incorporar as amostras, ajuste a posição de projeção do laser para o centro da amostra na tela e ajuste o botão de zoom para 20x. Para otimizar a resolução, defina o ganho como 1, 250V.

Maximize a área azul usando o botão de foco e, em seguida, redefina o ganho para aproximadamente 750V para geração de imagens. Em seguida, alterne o método de corte para automático. Defina a espessura para cerca de 50 micrômetros e execute os slides.

Pare de cortar quando os pulmões e as vias aéreas estiverem à vista. Escolha uma espessura de corte entre oito a 10 micrômetros e pare a visualização ao vivo aberta. Abra o Microtome Communicator para iniciar a geração de imagens.

Verifique se a pasta de armazenamento temporário está vazia antes de coletar imagens. Pare a coleção de imagens quando nenhuma estrutura rígida estiver visível. Saída dos arquivos armazenados temporariamente em uma série de imagens TIFF.

Para a reconstrução de imagem 3D, arraste e solte os arquivos de imagem no software de processamento de imagem. Quando a janela pop-up aparecer, selecione os links ou os arquivos a serem copiados para o banco de dados. Uma vez que o arquivo é aberto, clique no menu de ferramentas de reconstrução 2D 3D na barra de ferramentas e selecione 3D MPR.

Para resolução de pixel X e resolução de pixel Y, insira a resolução da imagem fornecendo o zoom usado durante a geração de imagens ECM. Para o intervalo de fatia, insira a espessura da fatia usada para cortar durante a imagem de ECM. Em seguida, use a ferramenta WWWL para ajustar a largura e o nível da janela.

Clique e arraste a ferramenta na imagem para cima para diminuir o brilho da imagem e para baixo para aumentá-la. Clique e arraste a ferramenta na imagem para a direita para diminuir o contraste da imagem e a palavra esquerda para aumentá-la. Arraste as imagens para as posições desejadas usando a ferramenta de panorâmica.

Use a ferramenta de zoom para ampliar ou reduzir a imagem e a ferramenta girar para girar a imagem conforme desejado. Agora, clique e arraste o eixo colorido do primeiro painel. Observe como a rotação desse eixo altera a orientação dos outros dois painéis.

Gire os três eixos dos painéis até que os três painéis representem as vistas coronal, sagital e transversal da amostra. Uma vez que todos os três painéis estejam adequadamente posicionados, orientados e iluminados, clique no painel que representa a vista coronal. Em seguida, clique em Exportação de filme no lado direito da barra de menus.

Clique em lote e arraste os controles deslizantes de e para para abranger toda a região de interesse. Para intervalo, selecione a mesma opção de espessura e salve o vídeo indicando a orientação das visualizações. A ecocardiografia mostra septo ventricular íntegro sem shunt intraventricular e grandes artérias normais relacionadas no controle normal, o que foi confirmado pela MEC.

A visão frontal demonstra comunicação entre LA, AR, VE e VD tanto na eco quanto na ECM, sugerindo comunicação do septo atrioventricular. O fluxo de cor demonstra o fluxo através do VE e do VD, indicando defeito do septo ventricular. A ecocardiografia e a MEC demonstraram dupla saída do ventrículo direito com defeito do septo ventricular entre o VE e o VD com grandes artérias lado a lado.

O diagnóstico ultrassonográfico de truncus arteriosus persistente demonstra comunicação entre VE e VD com uma única via de saída sobrepondo-se a ambos os ventrículos, também confirmada pela MEC no estágio E14.5. Os cortes coletados da histologia da MEC podem ser processados para imunocoloração, coloração de hematoxilina e eosina e até mesmo extração de ácido nucleico para genotipagem e perfil transcricional ou extração de proteínas para análise proteômica. As imagens da reconstrução tridimensional podem ser processadas para avaliações de perímetros quantitativos, como área ou volume.

A fenotipagem precisa para identificar defeitos na anatomia cardiovascular é essencial para o estabelecimento de modelos geneticamente modificados e mutantes de doença cardíaca congênita em camundongos para elucidar os patomecanismos da cardiopatia congênita. Isso pode levar a potenciais oportunidades que desenvolvem terapias e intervenções para melhorar o desfecho clínico em pacientes com cardiopatia congênita.