Echtzeit-Void-Spot-Assay

Die in diesem Bericht beschriebene Methode kann verwendet werden, um physiologische und neuro-verhaltensbezogene Aspekte der willkürlichen Miktion in Gesundheits- und Krankheitszuständen zu verstehen. Diese Technik ermöglicht es uns, das Volumenverhalten der Maus in den hellen und dunklen Phasen des Tages zu überwachen und liefert zeitliche, räumliche und volumetrische Informationen zu Entleerungsereignissen. Um einen Echtzeit-Void-Spot-Assay oder eine RT-VSA-Aufzeichnungskammer vorzubereiten, legen Sie je nach Tageszeit ein dünnes oder dickes Filterpapier auf den Boden des RT-VSA-Aufzeichnungskäfigs.

Legen Sie auf das Filterpapier ein Plastik-Iglu für den Schlafplatz, ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zur Anreicherung und eine 60 mm x 15 mm große Plastikschale mit zwei oder drei Stücken Mäuse-Trockenfutter und 14 bis 16 Gramm Wasser in Form einer Gelpackung. Sobald die Aufnahmekammer fertig ist, legen Sie die Maus vorsichtig auf das Filterpapier. Stellen Sie sicher, dass der Transfer der Maus vom Gehäusekäfig in den Aufnahmekäfig mit minimaler Belastung erfolgt.

Sobald sich die Maus im Aufnahmekäfig befindet, setzen Sie den Deckel auf und decken Sie die Oberseite des Deckels mit einem saugfähigen blauen Bankpad ab, um direkte Umgebungslichtreflexionen auf der Plexiglasdeckeloberfläche zu minimieren. Schalten Sie das ultraviolette Licht in der unteren Kammer ein. Um RT-VSA-Videos von der oberen und unteren Kamera aufzuzeichnen, verwenden Sie eine Videoüberwachungs-Aufzeichnungssoftware, die für die gleichzeitige Aufzeichnung von mehreren Webcams oder Netzwerkkameras konfiguriert ist.

Starten Sie die Aufnahme durch Drücken von Cmd R im Programmfenster. Führen Sie Videoaufnahmen mit einem Bild pro Sekunde durch. Verlassen Sie unmittelbar nach Beginn der Aufnahmen den Raum und schließen Sie die Tür vorsichtig.

Stellen Sie sicher, dass der Raum während des gesamten Experiments ruhig bleibt. Stoppen Sie die Aufnahmen, indem Sie Cmd T drücken.Schalten Sie das ultraviolette Licht aus. Nach dem Stoppen der Aufnahme generiert die Software automatisch für jede Kamera eine Filmdatei im m4v-Format und speichert sie unter dem Namen der Kamera in einem zuvor ausgewählten Zielordner.

Stellen Sie sicher, dass die Experimente in den Ordnern der einzelnen Kameras nach Datum geordnet sind. Vergewissern Sie sich, dass in jedem Datums- oder Experimentordner eine m4v-Datei und alle einzelnen JPEG-Dateien vorhanden sind, die den einzelnen Filmbildern entsprechen. Erstellen Sie auf dem Desktop einen Ordner mit dem Namen und dem Datum des Experiments und übertragen Sie die m4v-Dateien in diesen Ordner.

Kopieren Sie den Filmordner auf ein Flash-Laufwerk, um ihn auf einem externen Computer zu analysieren. Öffnen Sie eine Filmdatei, die von der unteren Kamera während der hellen Phase oder von der oberen Kamera während der dunklen Phase zur Analyse erfasst wurde. Nachdem Sie die Qualität des Films bewertet haben, analysieren Sie die Experimente, indem Sie mit dem Schnellvorlaufbefehl oder dem Zeitleistenschieber zum richtigen Zeitfenster wechseln.

Die Entleerungsaktivität während der Lichtphase wird zwischen 11:00 und 17:00 Uhr und während der Dunkelphase zwischen Mitternacht und 6:00 Uhr aufgezeichnet. Spielen Sie den Film im Schnellvorlaufmodus ab, indem Sie auf das Symbol für den schnellen Vorlauf klicken, oder scrollen Sie manuell durch den Film, um nach Beweisen dafür zu suchen, dass die Maus leer wird. Achten Sie auf das plötzliche Auftreten von hellen Urinflecken auf dem Filterpapier oder auf Verhaltensänderungen, einschließlich der Bewegung in die Ecken des Käfigs und einer kurzen Zeit der Inaktivität, wenn die Maus entleert wird. Registrieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die einzelnen Stornierungen auftreten.

Als Konvention wird die Zeit des Hohlraums beim ersten Anzeichen des Urins aufgezeichnet. Um den Hohlraum zu messen, verwenden Sie zunächst die Bildlaufleiste, um sich in der Zeit vorwärts oder rückwärts zu bewegen, und suchen Sie nach dem Punkt, an dem die maximale Diffusion des Urinflecks stattgefunden hat. Halten Sie den Film an dieser Stelle an und platzieren Sie den Computer-Mauspfeil an der zu analysierenden Stelle, um die gewünschte Stelle im Screenshot zu markieren.

Benennen Sie die Screenshot-Datei mit korrelativen Zahlen, um die Reihenfolge des Erscheinens im Film zu berücksichtigen. Wenn alle Hohlräume analysiert wurden, messen Sie die Gesamtfläche des Filterpapiers, indem Sie einen Screenshot machen und den Rand des Filterpapiers abgrenzen. Berechnen Sie die prozentuale Fläche jedes Urinflecks.

Wandeln Sie die Werte der prozentualen Fläche in das Urinvolumen für jeden leeren Fleck um, indem Sie die Kalibrierungskurven und die Interpolationsfunktion in der Grafiksoftware verwenden. Das Entleerungsverhalten von weiblichen und männlichen Piezo1-, 2-, Knockout- und Kontrollmäusen wurde während der dunklen und hellen Phase des Tages aufgezeichnet. Während ihrer inaktiven Lichtphase wurden keine signifikanten Unterschiede in den analysierten Parametern für weibliche oder männliche Knockout-Mäuse im Vergleich zur Kontrolle beobachtet.

In der aktiven Dunkelphase zeigten weibliche und männliche Knockout-Mäuse jedoch einen veränderten Voiding-Phänotyp, der durch eine signifikante Zunahme der Anzahl und des Gesamtvolumens kleiner Void-Spots gekennzeichnet war. Es gab keine signifikanten Unterschiede in den primären Hohlraumflecken oder der PVS-Anzahl, dem durchschnittlichen Volumen pro PVS oder dem gesamten PVS-Volumen bei weiblichen oder männlichen Knockout-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Das Entleerungsverhalten weiblicher Mäuse wurde unter basalen Bedingungen und nach Cyclophosphamid-Behandlung getestet.

Im Vergleich zu den basalen Bedingungen ist die Menge der Urinabgabe pro Hohlraum nach der Behandlung mit Cyclophosphamid geringer und die Miktionsereignisse sind viel häufiger. Ein wichtiger Aspekt für die Reproduzierbarkeit von Assays ist es, die Tiere so schonend wie möglich zu manipulieren und sie während des gesamten Versuchszeitraums unter minimalem Stress zu halten. Da es sich um einen nicht-invasiven Assay handelt, können anschließend weitere Verfahren durchgeführt werden, einschließlich Zytometrie und Elektromyographie, um die Funktion des Schließmuskels der Blase bzw. der äußeren Harnröhre zu beurteilen.

Die Implementierung dieser Technik wird es den Forschern ermöglichen, den Beitrag spezifischer Signalwege zum Entleerungsverhalten in Gesundheits- und Krankheitszuständen zu definieren.