Name: Dreidimensionale Kultivierung von vaskularisiertem thermogenem Fettgewebe aus mikrovaskulären Fragmenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Erfahren Sie die dreidimensionale Kultivierung vaskularisierten thermogenen Fettgewebes aus mikrovaskulären Fragmenten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Adipogenese und Angiogenese für metabolische Forschung.

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Dr. Acosta wird durch die Zuschüsse CA148724 und TL1TR002647 der National Institutes of Health unterstützt. Dr. Gonzalez Porras wird vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases der National Institutes of Health unter der Fördernummer F32-0DK122754 unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil von den National Institutes of Health (5SC1DK122578) und dem Department of Biomedical Engineering der University of Texas at San Antonio unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wider. Figuren wurden teilweise mit Biorender.com erstellt.

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<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+transplantation+reverses+obesity+in+Ob%2FOb+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice.</a> Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).</li>
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<li>Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+approach+to+engineer+vascularized+adipose+tissue+using+microvascular+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).</li>
<li>Acosta, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+differentiation+alters+properties+of+vascularized+tissue-engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).</li>
<li>Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+adipocyte+organoid+model+using+isolated+human+microvessel+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments.</a> Biofabrication. 13 (3), 035022(2021).</li>
<li>Acosta, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+functional+vascularized+beige+adipose+tissue+from+microvascular+fragments+of+models+of+healthy+and+type+II+diabetes+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions.</a> Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337(2022).</li>
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<li>Herold, J., Kalucka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+adipose+tissue%3A+The+interplay+between+adipose+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells.</a> Frontiers in Physiology. 11, 1861(2021).</li>
<li>McCarthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat-On-A-Chip+models+for+research+and+discovery+in+obesity+and+its+metabolic+comorbidities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).</li>
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<li>Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+diabetes+delays+perfusion+and+engraftment+of+3D+constructs+by+impinging+on+angiogenesis%3B+which+can+be+rescued+by+hepatocyte+growth+factor+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).</li>
<li>Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+impairs+arterio-venous+specification+in+engineered+vascular+tissues+in+a+perivascular+cell+recruitment-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner.</a> Biomaterials. 119, 23-32 (2017).</li>
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<li>Später, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+microvascular+fragment+isolates+from+visceral+and+subcutaneous+adipose+tissue+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice.</a> Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).</li>
<li>Später, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+microvascular+fragments+from+male+and+female+fat+donors+exhibit+a+comparable+vascularization+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687(2021).</li>
<li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simpler%2C+the+better%3A+tissue+vascularization+using+the+body%27s+own+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The simpler, the better: tissue vascularization using the body's own resources.</a> Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).</li>
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<li>Pilkington, A. -C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipose+tissue+identification+and+marker+specificity-Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 599134(2021).</li>
<li>Chiou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold+architecture+and+matrix+strain+modulate+mesenchymal+cell+and+microvascular+growth+and+development+in+a+time+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass die Untersuchung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Das Gebiet des braun/beigen Fettgewebe-Engineerings ist weitgehend unausgereift 22,23,24,25,26,27,28, wobei der Großteil der Fettmodelle für weißes Fettgewebe entwickelt wird 8,22,31. Künstlich herg...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Entwicklung von vaskularisiertem beigem Fettgewebe aus einem einzigen, potenziell autologen Mikrovaskulärfragment (MVF) zu beschreiben. Es wurde gezeigt, dass braunes und beigefarbenes Fettgewebe vorteilhafte Eigenschaften im Zusammenhang mit der Stoffwechselregulierung aufweist. Das geringe Volumen dieser Fettgewebsdepots bei Erwachsenen begrenzt jedoch die potenziellen Auswirkungen auf den systemischen Stoffwechsel, insbesondere bei Erkrankungen wie Adipositas oder Typ-2-Diabetes 1,2,3,4,5,6,7. Es besteht ein erhebliches Interesse an braunem/beigem Fett als therapeutisches Ziel, um die schädlichen metabolischen Auswirkungen von Adipositas und ihren Komorbiditäten zu verhindern 8,9,10,11,12.
MVFs sind Gefäßstrukturen, die direkt aus Fettgewebe isoliert, kultiviert und über längere Zeiträume in einer dreidimensionalen Konfiguration gehalten werden können13,14,15. Frühere Arbeiten unserer Gruppe und anderer haben begonnen, die multizelluläre und multipotente Kapazität von MVFs zu nutzen, insbesondere in Bezug auf die Bildung von Fettgewebe16,17,18. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir kürzlich gezeigt, dass MVFs, die aus Nagetiermodellen für gesunden und Typ-2-Diabetes19 und von menschlichen Probanden (Erwachsene über 50 Jahre)20 stammen, Zellen enthalten, die zur Bildung von thermogenem oder beigefarbenem Fettgewebe induziert werden können.
Hierin liegt ein innovativer Ansatz vor, bei dem ein MVF aus einer einzigen Quelle verwendet wird, das nicht nur in der Lage ist, beiges Fettgewebe zu erzeugen, sondern auch die damit verbundene und kritische vaskuläre Komponente21. Der Einsatz dieser Technik könnte von großem Wert für Studien sein, die nach einem einfachen Tissue-Engineering-Ansatz für die thermogene Bildung von Fettgewebe suchen. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die darauf abzielen, beiges Fettgewebe 22,23,24,25,26,27,28 zu entwickeln, erfordert der in dieser Studie beschriebene Prozess nicht die Verwendung mehrerer Zelltypen oder komplexer Induktionsschemata. Vaskularisierte beige und weiße Fettmodelle können mit MVFs erstellt werden, die aus Nagetieren und menschlichen Quellen stammen, was ein großes Translationspotenzial aufweist. Das Endprodukt dieses Protokolls ist ein künstlich hergestelltes beigefarbenes thermogenes Fettgewebe mit einer Struktur und Stoffwechselfunktion, die mit braunem Fettgewebe vergleichbar ist. Insgesamt stellt dieses Protokoll die Idee dar, dass eine leicht zugängliche und möglicherweise autologe Quelle MVF eine lohnende therapeutische Intervention und ein Werkzeug zur Untersuchung von Stoffwechselstörungen sein könnte.

<table><tbody><tr><td>Aminocapronsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>In DMEM in einer Konzentration von 1 mg/ml</td></tr><tr><td>zugesetzt Schere mit stumpfer Spitze</td><td>Fisher scientific</td><td>12-000-172</td><td>Sterilisieren im Autoklaven</td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td><td>Millipore</td><td>126575-10GM</td><td>Verdünnt in PBS auf 4 mg/ml und 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 1</td><td>Fisher scientific</td><td>NC9633623</td><td>Verdünnt auf 6 mg/ml in BSA 4 mg/ml, Aufschluss von Hackfleisch</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC230302500</td><td>Verdünnt in Ethanol bei einer Stammkonzentration von 2 mg/ml</td></tr><tr><td>Einwegunterlagen</td><td>Fisher scientific</td><td>23-666-062</td><td>Für die Flüssigkeitsaufnahme während der Operation</td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>Fisher scientific</td><td>08-951-5</td><td>Im Autoklaven</td></tr> <tr><td>sterilisierenDulbecco&prime; s modifizierter Eagle&prime; s Medium (DMEM)</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s modifizierter Eagle&prime; s Medium/Nährstoffmischung F-12 Schinken (DMEM/F12)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16140089</td><td>In DMEM zu 20 % v/v hinzugefügt.</td></tr><tr><td>Fibrinogen&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-25G</td><td>Solubilisiert in DMEM in einer Konzentration von 20 mg/ml, Protein im Blutplasma und Hauptbestandteil des Hydrogelkolbens</td></tr><tr><td>, 250 mL</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>FB500250</td><td>Ermöglicht die Verdauung von Fett unter Verwendung einer großen Oberfläche</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fisher scientific</td><td>50-264-21</td><td>Sterilisieren im Autoklaven, Zur Handhabung von Gewebe und Filtern</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>In der</td></tr><tr><td></td> aktuellen Studie wurden humane MVF <td>Advanced Solutions Life Scienes, LLC</td><td>https://www.advancedsolutions.com/microvessels</td><td>humane MVFs (hMVFs) verwendet, die von drei verschiedenen Patienten (52-, 54- und 56-jährige weibliche Frauen) isoliert wurden.</td></tr><tr><td>Indomethacin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7378</td><td>Verdünnt in Ethanol in einer Stammkonzentration von 12,5 mM</td></tr><tr><td>Insulin aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5523</td><td>Verdünnt in 0,01 N HCl in einer Stammkonzentration von 5 mg/ml</td></tr><tr><td>MycoZap</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>NC9023832</td><td>Zugabe in DMEM zu 0,2 % w/v, Mykoplasmen Prophylaxe&nbsp;</td></tr><tr><td>Pennycilin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>15140122</td><td>in DMEM bis zu 1 % v/v hinzugefügt.</td></tr><tr><td>Petrischale, Polystyrol (100 mm x 15 mm).</td><td>Fisher Scientific</td><td>351029</td><td>3 zum Entfernen von Blutgefäßen und Zerkleinern, 8 (Deckel) zum Einweichen von Sieben & 8 (Schale) zum Filtern mit 500 oder 37 & micro; M Siebe</td></tr><tr><td>Petrischale, Polystyrol (35 mm x 10 mm).</td><td>Fisher scientific</td><td>50-202-036</td><td>Zum Zählen von Fragmenten</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-190-250</td><td>1x Verdünnt auf 1x mit sterilem deionisiertem Wasser.</td></tr><tr><td>Rattenschere (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>NC0854141</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>R0106200MG</td><td>Verdünnt in DMSO bei einer Stammkonzentration von 10 mM</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>1 für den ersten Schnitt, 1 für den Nebenhodenschnitt, 1 für den Spitzenschnitt</td></tr><tr><td>Sieb&nbsp; 37 & micro; M&nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>652222R</td><td>In 3" abgerundete Quadrate geschnitten und in Ethylenoxid sterilisiert, Fragmenteinschluss und Entfernung von sehr kleinen Fragmenten/Einzelzellen und Ablagerungen</td></tr><tr><td>Sieb 500 & Mikro; M&nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>652222F</td><td>In 3" abgerundete Quadrate geschnitten und in Ethylenoxid sterilisiert, entfernt größere Fragmente/Ablagerungen</td></tr><tr><td>Gezackter Hämostat</td><td>Fisher scientific</td><td>12-000-171</td><td>Sterilisieren im Autoklaven, Zum Einklemmen der Haut vor dem Einschnitt</td></tr><tr><td>Steriflip-Filter 0,22 & mu; M&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Fisher scientific</td><td>6051601KU</td><td>Verdünnt in entionisiertem Wasser auf 10 U/ml, wird als Gerinnungsmittel verwendet, das Fibrinogen in Fibrin umwandelt</td></tr><tr><td>Schilddrüsenhormon (T3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2877</td><td>Verdünnt in 1N NaOH bei einer Stammkonzentration von 0,02 mM</td></tr><tr><td>Zucker diabetische Fett (ZDF) Ratten - fettleibig (FA/FA) oder mager (FA/+) männlich&nbsp;</td><td>Charles River</td><td>https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611</td><td>Gewonnen aus Charles River (Wilmington, MA). Ratten wurden im Alter von 4 Wochen erworben und bis zur Euthanasie (15-19 Wochen) mit Purina 5008 gefüttert. Der Glukosespiegel (Blut aus der Vena saphena lateralis) lag bei allen FA/FA-Ratten, die in der Studie verwendet wurden, bei mehr als 300 mg/dl. Alle Tiere wurden in einer temperaturkontrollierten Umgebung mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht und ad libitum gefüttert.</td></tr></tbody></table>

dreidimensionale kultivierung von vaskularisiertem thermogenem fettgewebe aus mikrovaskulären fragmenten

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Die Entwicklung von thermogenem Fettgewebe (z. B. beigem oder braunem Fettgewebe) wurde als potenzielle Therapie für Stoffwechselerkrankungen oder für das Design von personalisiertem Mikrogewebe für Gesundheitsuntersuchungen und Arzneimitteltests untersucht. Aktuelle Strategien sind oft sehr komplex und können die multizellulären und funktionellen Eigenschaften von thermogenem Fettgewebe nicht vollständig vollständig abbilden. Mikrovaskuläre Fragmente, kleine intakte Mikrogefäße, die aus Arteriolen, Venolen und Kapillaren bestehen, die aus Fettgewebe isoliert sind, dienen als eine einzige autologen Quelle von Zellen, die die Vaskularisierung und die Bildung von Fettgewebe ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Optimierung der Kulturbedingungen, um die Erzeugung von dreidimensionalem, vaskularisiertem und funktionellem thermogenem Fettgewebe aus mikrovaskulären Fragmenten zu ermöglichen, einschließlich Protokollen zur Isolierung mikrovaskulärer Fragmente aus Fettgewebe und Kulturbedingungen. Darüber hinaus werden Best Practices sowie Techniken zur Charakterisierung der künstlich hergestellten Gewebe diskutiert, und es werden Probenergebnisse sowohl von Nagetieren als auch von menschlichen mikrovaskulären Fragmenten bereitgestellt. Dieser Ansatz hat das Potenzial, für das Verständnis und die Entwicklung von Therapien für Fettleibigkeit und Stoffwechselerkrankungen genutzt zu werden.

Es gibt einige wichtige phänotypische morphologische Merkmale des beige/braunen Fettgewebes: Es ist multilokulär / enthält kleine Lipidtröpfchen, besitzt eine große Anzahl von Mitochondrien (der Grund für sein charakteristisches "bräunliches" Aussehen in vivo), hat dementsprechend eine hohe Sauerstoffverbrauchsrate/mitochondriale Bioenergetik, ist stark vaskularisiert, hat eine erhöhte Lipolyse/insulinstimulierte Glukoseaufnahme und, am berüchtigtsten, exprimiert hohe Konzentrationen von Uncoupling Protein 1 (U...

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Verwendung von mikrovaskulären Fragmenten, die aus Nagetier- oder menschlichem Fettgewebe isoliert wurden, als einfachen Ansatz zur Herstellung von funktionellem, vaskularisiertem beigefarbenem Fettgewebe beschreibt.

Dreidimensionale Kultivierung von vaskularisiertem thermogenem Fettgewebe aus mikrovaskulären Fragmenten

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von dreidimensionalem vaskularisiertem und funktionellem thermogenem Fett aus mikrovaskulären Fragmenten (MVFs). Aktuelle Strategien zur Herstellung von thermogenem Fettgewebe sind komplex und bilden seine multizellulären und funktionellen Eigenschaften nicht vollständig ab. MVFs sind eine einzige Quelle von Zellen, die die Vaskularisierung und die Bildung von Fettgewebe ermöglichen.Da es sich um eine einfache Methode zur Herstellung biologischer Imitationen von beigem Fett handelt, bergen MVFs ein erhebliches Potenzial für die Förderung des Verständnisses oder der Entwicklung von Behandlungen für Fettleibigkeit und Stoffwechselerkrankungen. Legen Sie das entsprechend rasierte und euthanasierte Tier, das mit 70%igem Ethanol behandelt wurde, in Rückenlage und beginnen Sie mit der Isolierung des Leistenfetts. Heben Sie die Haut unter dem Penis mit einer Schere an und führen Sie den Schnitt durch, beginnend in der Mitte und seitlich schneidend, um eine V-Form zu bilden, bevor Sie sich zum Hinterteil des Tieres schlängeln, um an die gesamte Fettdepot zu gelangen.Achten Sie beim Schneiden auf die Trennung der Haut vom Fett, indem Sie das miteinander verbundene Fasziengewebe durchtrennen. Sobald die Faszie richtig geschnitten ist, stellen Sie sicher, dass das Leistenfett von beiden Seiten, das sich von der Leiste nach hinten erstreckt, sichtbar ist. Als nächstes entfernen Sie das Fett von beiden Seiten in separaten konischen Röhrchen, die 10 Milliliter BSA in PBS mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter enthalten.Um das Nebenhodenfett zu gewinnen, schneiden Sie durch die Bauchhaut und anschließend vorsichtig durch die dünne Schicht, die die Hoden umgibt. Ziehen Sie das Fettgewebe vorsichtig mit einer Pinzette und schneiden Sie es mit einer Schere heraus, während Sie die Sektion der wichtigsten sichtbaren Blutgefäße vermeiden. Geben Sie nun das entfernte Fett in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS enthält.Um das hintere Unterhautfett zu isolieren, drehen Sie die Ratte auf den Bauch und schneiden Sie mit einer großen Schere die dicke Haut des Rückens bis zur Kopfhaut ab, wobei Sie darauf achten müssen, nicht zu tief unter die Haut zu schneiden. Schneiden Sie die Faszien durch, die die Haut mit dem Gewebe verbinden. Unterscheiden Sie das subkutane Fett, das sich in der intrascapularen Region befindet, von dem braunen Fett, das sich näher an der Wirbelsäule befindet, bevor Sie das subkutane Fett isolieren und in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen geben, das 10 Milliliter eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS enthält.Während Sie in einer Biohaube arbeiten, verwenden Sie eine Pinzette, um das herausgeschnittene Fett in eine Standard-100-Milliliter-Petrischale zu geben, die 0,5 Milliliter eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS enthält. Entfernen Sie alle sichtbaren Blutgefäße, Muskeln oder Fremdgewebe aus dem Fett. Hacken Sie das Fett mit einer Schere 10 Minuten lang und prüfen Sie, ob Klumpen vorhanden sind, indem Sie etwas mehr BSA hinzufügen.Zerkleinern Sie bei Bedarf weiter, bevor Sie die Hackfettsuspension mit einer 10-Milliliter-Pipette in einen sterilen 250-Milliliter-Kolben überführen. Stellen Sie das Volumen im Kolben auf 20 Milliliter her, indem Sie genügend BSA in PBS hinzufügen. Fügen Sie nun BSA in PBS zur Kollagenase hinzu und homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie sie vorsichtig schütteln, bevor Sie sie steril durch einen 0,22-Mikron-Nylon-Netzfilter filtern.Geben Sie sofort die erforderliche Menge Kollagenaselösung in die Hackfettsuspension und verdauen Sie das Fett, indem Sie den Kolben in kreisenden Bewegungen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für die entsprechende Zeit schütteln. Übertragen Sie das verdaute Fett in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das als verdautes Fett oder Hackfett gekennzeichnet ist. Zentrifugieren Sie das Röhrchen vier Minuten lang bei 400 G, um die mikrovaskulären Fragmente (MVFs) zu einem roten Pellet zu schleudern.Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das mit Abfall beschriftet ist, ohne das Pellet zu stören. Als nächstes geben Sie 10 Milliliter eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS in das Röhrchen mit dem Pellet und mischen Sie die Pelletsuspension, indem Sie sie zweimal vorsichtig auf und ab pipettieren, ohne die Fragmente zu zerstören. Nehmen Sie nun das 500-Mikron-Sieb, das in einer sterilen Petrischale mit fünf Millilitern eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS vorgetränkt ist, und legen Sie es über den Kunststoffsiebhalter, der auf einer neuen Petrischale aufbewahrt wird.Pipettieren Sie 10 Milliliter Suspension aus dem aufgeschlossenen Pelletröhrchen in konzentrischen Kreisen auf das Sieb. Waschen Sie den Filter mit weiteren fünf Millilitern eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS und entsorgen Sie ihn, während das Filtrat in der Petrischale verbleibt. Legen Sie dann das vorgetränkte 37-Mikron-Sieb über dem Kunststoff-Siebhalter auf eine neue Petrischale.Mit einer frischen Pipette das Filtrat aus der ersten Filtration in konzentrischen Kreisen auf das Sieb übertragen. Wie zuvor beschrieben, waschen Sie das Sieb mit BSA in PBS und verwerfen Sie dieses Mal das Filtrat, während Sie das 37-Mikron-Sieb beibehalten. Schieben Sie das 37-Mikrometer-Sieb in eine neue Petrischale, die fünf Milliliter eines Milligramms pro Milliliter BSA in PBS enthält.Entfernen Sie die Fragmente, indem Sie die Schale vorsichtig gegen einen konischen Halter klopfen, ohne Flüssigkeit zu verschütten. Spülen Sie den Filter mit zusätzlichen fünf Millilitern BSA in PBS aus. Als nächstes füllen Sie die Flüssigkeit aus der Petrischale in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen.Spülen Sie das 37-Mikron-Sieb noch einige Male aus und geben Sie die Wäsche in das konische Röhrchen, bis das gesammelte Gesamtvolumen 15 bis 20 Milliliter beträgt. Entsorgen Sie das Sieb nach dem letzten Spülen. Schneiden Sie das Ende einer 20-Mikroliter-Pipettenspitze mit einer Schere ab.Schütteln Sie das Röhrchen mit der Flüssigkeit vorsichtig, bevor Sie mit der abgeschnittenen Pipettenspitze zwei Aliquots von 20 Mikrolitern entnehmen, und pipettieren Sie jedes der Aliquots in eine saubere 35-Millimeter-Petrischale. Zählen Sie die Anzahl der Fragmente in der Probe in jeder Petrischale mit einem Standard-Lichtmikroskop und erhalten Sie mit der im Manuskript genannten Formel die Gesamtzahl der isolierten mikrovaskulären Fragmente. Schleudern Sie die restliche Flüssigkeit im konischen 50-Milliliter-Röhrchen bei 400 G vier Minuten lang, um den MVF aufzufangen.Nach dem Schleudern den größten Teil des Überstands aus dem konischen Röhrchen umfüllen und mit einer Pipette das kleine Flüssigkeitsvolumen entfernen, das am Rand des Röhrchens verbleibt. Als nächstes geben Sie Thrombin in die Vertiefungen, die für das Gießen von Gelen vorgesehen sind. Schneiden Sie das Ende einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab und resuspendieren Sie damit vorsichtig die MVFs in Fibrinogen, um die gewünschte Enddichte zu erreichen.Pipettieren Sie die Suspension in die Thrombinlösung in der Vertiefung und homogenisieren Sie die Mischung schnell durch Auf- und Abpipettieren. Sobald alle Gele gegossen sind, legen Sie die Wellplatte für etwa 15 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um eine Gelvernetzung zu ermöglichen. Die Lipide und die differenzierten Adipozyten wurden durch konfokale mikroskopische Bildgebung der Hydrogele unter Verwendung von BODIPY als Lipidfärbung beobachtet.Die Kultivierung von nicht-vaskularisiertem Fettgewebe unter Verwendung von weißem adipogenem oder beigem adipogenem Medium führte zur Bildung von nicht-vaskularisiertem weißem bzw. beigefarbenem Fettgewebe sowohl aus mageren als auch aus diabetischen Nagetier-MVFs. In ähnlicher Weise führte die Kultivierung von vaskularisiertem Fettgewebe unter Verwendung von weißem adipogenem oder beigem adipogenem Medium zur Bildung von vaskularisiertem weißem bzw. beigem Fettgewebe aus den von Nagetieren stammenden MVFs. Nicht-vaskularisiertes weißes und beiges Fettgewebe, das aus humanen MVFs gewonnen wurde, wurde ebenfalls durch konfokale Mikroskopie beobachtet.Die Fähigkeit von MVFs, sich in beiges Fettgewebe zu differenzieren, wurde mittels RT-qPCR genetisch bestätigt. Magere und diabetische MVFs von Nagetieren, die direkt bei weißen adipogenen oder beigen adipogenen Medien exponiert wurden, wurden auf Adipogenese, Thermogenese und Angiogenese untersucht. Die Expression des Entkopplungsproteins 1 war erwartungsgemäß im beigen adipogenen Gewebe signifikant höher.Ein ähnlicher Trend wurde bei Nagetier-MVFs beobachtet, die indirekten weißen adipogenen oder beigen adipogenen Medien ausgesetzt waren, sowie bei menschlichen MVFs, die direkt weißen adipogenen oder beigen adipogenen Medien ausgesetzt waren. Schließlich zeigte sich aus der mitochondrialen Bioenergetik, dass das beige Fettgewebe funktionell in allen Fällen eine charakteristisch höhere Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) aufwies. Die enzymatische Verdauung des Fettgewebes sollte optimiert werden, um MVFs ähnlicher Größe und Qualität konsistent zu reproduzieren.Nach dem Aufschluss sollten MVFs vorsichtig und mit besonderer Sorgfalt behandelt werden, um ein weiteres Aufbrechen der Fragmente zu vermeiden. Diese Technik trug dazu bei, das Gleichgewicht zwischen Gefäßwachstum und Adipozytendifferenzierung zu fördern, was nachweislich von den eingebrachten Faktoren abhängt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung, Kultivierung und Phänotypisierung von mikrovaskulären Endothelzellen aus humanem subkutanem Fettgewebe (hSATMVECs). Zusätzlich beschreiben wir ein experimentelles Modell des hSATMVEC-Adipozyten-Cross-Talks.

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Erfahren Sie die dreidimensionale Kultivierung vaskularisierten thermogenen Fettgewebes aus mikrovaskulären Fragmenten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Adipogenese und Angiogenese für metabolische Forschung.

Dreidimensionale Kultivierung von vaskularisiertem thermogenem Fettgewebe aus mikrovaskulären Fragmenten

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