Name: Design und Implementierung eines ex vivo Lungenperfusionsmodells für Ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie ein kostengünstiges, modulares ex vivo Lungenperfusionsmodell für Ratten etablieren. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Lungenphysiologie-Studien und ergänzt in vivo Experimente zur Erforschung neuer Mechanismen.

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Die Unterstützung erfolgte zum Teil durch einen Merit Review Award (101 BX003482) des U.S. Department of Veteran Affairs Biomedical Laboratory R&D Service, einen NIH-Zuschuss (5R01 HL123227), einen Transformative Project Award (962204) der American Heart Association und durch institutionelle Mittel, die Dr. Riess verliehen wurden. Dr. Balzer erhielt eine unabhängige Förderung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Projektnummer BA 6287/1-1. Die Autoren danken Matthew D. Olsen, Chun Zhou, Zhu Li und Rebecca C. Riess für ihre wertvollen Beiträge zur Studie.

Der In-vivo-Teil der Versuche (von der Vollnarkose bis zur Euthanasie) bedarf der vorherigen Genehmigung durch das jeweilige Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle hierin beschriebenen Verfahren wurden von der IACUC am Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee, genehmigt (Protokollnummer M1700168) und in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien14 durchgeführt. Vor den Experimenten waren alle Ratten in der Tierpflegeeinrichtung des Instituts untergebracht, mit freiem Zugang zu Wasser und Futter. Unter Einbeziehung verschiedener Studien, die außerhalb des Geltungsbereichs dieses Manuskripts liegen, haben wir bisher insgesamt 148 männliche Sprague Dawley-Ratten im Alter von 7-10 Wochen mit einem Gewicht zwischen 250 g und 400 g verwendet.
1. Apparatebau
HINWEIS: Alle Teile, einschließlich der jeweiligen Hersteller, sind in der Werkstofftabelle aufgeführt.
<ol><li>Um jedes Gerät an Ort und Stelle zu halten, konstruieren Sie ein speziell angefertigtes Gitter, das eine einfache Konfiguration und Integration der neuen Geräte ermöglicht (Abbildung 1). Befestigen Sie Aluminiumstangen (1 bis 2 Fuß lang, 1 cm Durchmesser, in jedem Baumarkt erhältlich) mit Kreuzklemmen aneinander, um ein 3D-Gitter zu erstellen, und platzieren Sie sie auf einer Kunststoffschale (30 Zoll x 21 Zoll), um ein Verschütten von Flüssigkeiten zu verhindern.</li>
	<li>Montieren Sie Druckmessumformer in gleicher Höhe an der Lunge und verbinden Sie sie mit den Leitungen für die Lungenarterie (PA), die Lungenvene (PV) und den Beatmungsschlauch. HINWEIS: Diese Wandler übertragen Daten an ihre jeweiligen Bioverstärker, die mit dem Datenerfassungssystem (DAQ) und seiner Software verbunden sind.</li>
	<li>Anstatt im Handel erhältliche Kanülen zu verwenden, stellen Sie maßgeschneiderte Kanülen (Abbildung 2) aus Segmenten von 2 mm breiten, harten Kunststoffschläuchen her, die am Ende mit einer offenen Flamme aufgeweitet werden, um das sichere Abbinden der Nähte zu ermöglichen. Biegen Sie sie in eine U-Form, um die Belastung der Lunge beim Aufhängen zu verringern und in die Lungenkammer zu passen.</li>
	<li>Um die Kammer für die Lunge zu schaffen, in der die Lunge belüftet und durchblutet werden soll, wird ein 1.000-ml-Becherglas in ein 1.500-ml-Becherglas mit einem Wasserbad zwischen den beiden und in das 1.000-ml-Becherglas gelegt, wodurch ein Wasserbad entsteht. Stellen Sie diese Becher auf eine auf 48 °C eingestellte Heizplatte, so dass eine Kammer für die Lunge entsteht, die sowohl feucht als auch widerstandsfähig gegen Temperaturschwankungen ist.</li>
	<li>Bewahren Sie den Puffer für das Experiment in einem 150-ml-Messkolben auf, der auf eine auf 37 °C eingestellte Heizplatte gestellt wird. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um den Puffer im Becherglas zu zirkulieren. Stellen Sie den Meniskus des Puffers so ein, dass er 4 cm über der Lunge liegt, um einen angeborenen Druck von 4 cmH2O auf den PV zu erzeugen. Achten Sie während der Operation darauf, dass sich die Lunge des Tieres auf der gleichen Höhe wie der Puffer befindet, um die Bildung eines hydrostatischen Ödems zu reduzieren. HINWEIS: Die Verwendung eines Kolbens minimiert die Menge an Oberfläche, die mit der Raumluft in Kontakt kommt, wodurch die Gasdiffusion minimiert wird.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Rollenpumpe, um den Puffer durch einen Kreislauf zu bewegen, der aus einer Heizspirale und einer Luftfalle besteht, bevor Sie die Lunge durchbluten. Das Abwasser aus dem PV wird wieder in den Messkolben zurückgeführt. Schließen Sie sowohl die Heizspirale als auch die Luftfalle an ein ebenfalls auf 37 °C eingestelltes Umlaufwasserbad an. Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades entsprechend der Pumpendrehzahl ein, so dass das Perfusat eine konstante Temperatur von 37 °C hat.</li>
</ol>2. Vorgehensweise
<ol><li>Bereiten Sie vor Beginn des Experiments die Einrichtung vor.<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die Software ausgeführt wird (siehe unten) und Daten ordnungsgemäß erfasst.</li>
		<li>Kalibrieren Sie alle Druckmessumformer täglich, um sicherzustellen, dass sie nicht driften.</li>
		<li>Bereiten Sie den Puffer vor (siehe Tabelle 1 für die Bestandteile einer physiologischen Kochsalzlösung mit 4 % Rinderserumalbumin [BSA]) und stellen Sie sicher, dass der pH-Wert bei 7,4 liegt, wobei Sie HCl zur entsprechenden Anpassung verwenden. Richten Sie das Perfusionssystem mit erwärmtem Puffer (Tabelle 1) ein, der durchgehend zirkuliert und darauf achtet, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Geben Sie BSA mindestens 30 Minuten vor Beginn des Experiments hinzu, damit es sich ausreichend auflösen kann. In Ermangelung eines Oxygenators wird vor der Zugabe von BSA mit einer Gaszusammensetzung von 65 %N2, 30 %O2 und 5 % CO2 in den Perfusionspuffer Blasengas gegeben, um die CO2 - Gehalte der In-vivo-Lunge nachzuahmen. Dadurch wird verhindert, dass die Lösung nach Zugabe von BSA aufschäumt.</li>
		<li>Bereiten Sie den Operationsbereich mit allen notwendigen chirurgischen Instrumenten, Nähten und Klebeband vor. Neigen Sie das Operationsbrett in einem Winkel von 15°, so dass die anästhesierte Ratte mit dem Kopf über dem Rest des Körpers positioniert werden kann und die Luftröhre und der Herz-Lungen-Block leicht manipuliert werden können.</li>
		<li>Wiegen Sie die Ratte mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und geben Sie eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (65 mg/kg-1). Verwenden Sie nach 10 Minuten eine Zehenklemme, um sicherzustellen, dass die chirurgische Ebene der Vollnarkose erreicht ist. Verabreichen Sie bei Bedarf mehr Betäubungsmittel.</li>
	</ol></li>
	<li>Bringen Sie die Ratte in den Operationsbereich und fixieren Sie sie auf der Operationsplatte, indem Sie ihre Vorderbeine separat abkleben, gefolgt von den Hinterbeinen zusammen, wobei Sie darauf achten, dass die Vorderbeine locker genug getaped sind, um einen Schmerzreflex sichtbar zu machen, falls die Anästhesie nicht tief genug ist (Abbildung 3A).</li>
	<li>Sichern Sie den Kopf der Ratte, indem Sie das Maul mit einem langen, dünnen Streifen hinter den Vorderzähnen abkleben, ohne die Zunge oder den Luftstrom für die noch spontan atmende Ratte einzuschränken (Abbildung 3B).</li>
	<li>Führen Sie eine Tracheotomie durch, indem Sie die Haut über der Luftröhre mit einer Pinzette einklemmen und mit einer chirurgischen Schere schneiden. Präparieren Sie mit einer gebogenen Pinzette den Muskel und das Gewebe stumpf, um die Luftröhre zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass während dieses Schritts keine Blutungen auftreten.<ol><li>Führen Sie eine gebogene Pinzette unter die Luftröhre und öffnen Sie sie, um Platz für 3-0-Nähte darunter zu schaffen, die dann zu einem Boxknoten vorgebunden werden können (Abbildung 3B). Machen Sie einen kleinen Schnitt zwischen den Knorpelringen der Luftröhre und führen Sie die Trachealkanüle ein (modifizierte 18 G Nadel mit einem Schlauch von 1 mm Durchmesser, der um die Spitze geklebt wird, um eine Kerbe zu erzeugen). Binden Sie die Naht ab und stellen Sie sicher, dass keine Luft aus dem Trachealschnitt entweichen kann und die Kanüle die Luftröhre nicht belastet.</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie das Beatmungsgerät so ein, dass es mit einem Gasgemisch von 30 % O2, 5 % CO2 und 65 % N2 betrieben wird, mit einem Atemzugvolumen (VT) von 10 ml/kg, einem positiven Endexspirationsdruck (PEEP) von 0 cmH2O und einer Rate von 60 Atemzügen/min.</li>
	<li>Sobald die Trachealkanüle mit der Naht gesichert ist, beginnen Sie mit der Beatmung der Ratte mit den oben genannten Einstellungen. HINWEIS: Die verwendete Operationsmethode wurde von Nelson et al.9 übernommen und wird Schritt für Schritt beschrieben.</li>
	<li>Entferne das Fell vom Bauch der Ratte mit einer großen chirurgischen Schere und Pinzette. HINWEIS: Haarentfernungssalben können auch vor Beginn des Experiments verwendet werden.</li>
	<li>Während Sie den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette halten, machen Sie einen kleinen horizontalen Schnitt unterhalb der Rippen, um sicherzustellen, dass das Zwerchfell intakt bleibt. Sobald die inneren Organe sicher sichtbar gemacht werden können, verbreitern Sie den horizontalen Schnitt, um das gesamte Zwerchfell freizulegen.</li>
	<li>Unter äußerster Sorgfalt, um eine Punktion der Lunge zu vermeiden, injizieren Sie Heparin (3.000 U/kg-1) mit einer 22-G-Spritze in die untere Hohlvene (IVC).</li>
	<li>Halten Sie auch hier den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette fest und schneiden Sie kranial entlang des Brustbeins, während Sie ständig die Lungen visualisieren, um ein Durchtrennen zu verhindern.</li>
	<li>Um den Herz-Lungen-Block richtig zu sehen, spreizen Sie den Brustkorb mit zwei großen Zangen auseinander und achten Sie darauf, dass Sie sich nicht die Rippen brechen, da dies dazu führen kann, dass ein scharfes Knochenfragment die Lunge durchsticht (Abbildung 3C). HINWEIS: Nach dem Öffnen des Brustkorbs ist ein PEEP von 2-3 cmH2O zu verwenden, der durch eine Wasserschleuse eingestellt wird, die am exspiratorischen Schenkel des Beatmungsgeräts befestigt ist, um eine Atelektase zu vermeiden.</li>
	<li>Schneiden Sie zu diesem Zeitpunkt die IVC ab, um die Ratte durch Ausblutung einzuschläfern. Stellen Sie sorgfältig sicher, dass seit der Injektion von Heparin mindestens 1 Minute vergangen ist (siehe Schritt 2.9), damit es genügend Zeit zum Zirkulieren hat und Mikrogerinnsel in der Lunge vermieden werden.</li>
	<li>Kontrollieren Sie beim Platzieren der Perfusionskanülen ständig den Druck, um sicherzustellen, dass keine plötzlichen Veränderungen auftreten. HINWEIS: Ein plötzlicher Druckanstieg bei konstanter Drehzahl der Pumpe deutet auf eine Verstopfungsbildung hin, während ein plötzlicher Abfall auf eine Leckage hinweisen kann.</li>
	<li>Schneiden Sie überschüssigen Thymus ab, um eine einfachere Visualisierung des Lungengefäßsystems zu ermöglichen. Lokalisieren Sie die PA, führen Sie eine kleine, gebogene Pinzette darunter und führen Sie erneut eine 3-0-Naht darunter ein und binden Sie sie zu einem Boxknoten vor.</li>
	<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt in den rechten Ventrikel des Herzens und führen Sie die PA-Kanüle ein (hergestellt aus einem Kunststoffschlauch mit einem Durchmesser von 2 mm, der am Ende mit einer offenen Flamme aufgeweitet wird, um das Binden von Nähten zu ermöglichen), wobei Sie vorsichtig vorgehen sollten, um einen Riss der angrenzenden Arterie zu vermeiden. Sichern Sie die Kanüle mit der Naht und der Perfus, beginnend bei 1,5 ml/min-1 (Abbildung 3D).</li>
	<li>Schneiden Sie sofort die Spitze des Herzens heraus, um einen Druckaufbau in der Lunge zu vermeiden. Mit kleinen, gebogenen Pinzetten wird die Mitralklappe gerissen und visuell sichergestellt, dass die Pinzette ungehindert in den linken Vorhof eindringen kann.</li>
	<li>Legen Sie eine vorgebundene 3-0-Naht um das Herz unterhalb des Vorhofs (Abbildung 3E).</li>
	<li>Führen Sie die PV-Kanüle (ähnlich dem Aufbau der PA-Kanüle) in den linken Vorhof ein und stellen Sie sicher, dass der Puffer aus diesem abfließen kann, bevor Sie die Naht abbinden. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die PV-Kanüle hinter dem Mitralventil platziert wird, um sicherzustellen, dass sie richtig abgebunden werden kann, ohne dass sie zu tief platziert wird, um den PV-Fluss zu verletzen oder zu behindern (Abbildung 3E). Seien Sie besonders vorsichtig beim Binden der Naht, da ein zu lockeres Binden zu einem Flussverlust führt, während ein zu festes Binden das Herz schädigen kann, die Platzierung der Kanüle schwächt und möglicherweise zu Leckagen führt.</li>
	<li>Schneiden Sie überschüssiges Gewebe zwischen der Brusthöhle und dem Tracheostomaschnitt mit einer stumpfen Schere ab, um eine Beschädigung der Luftröhre zu vermeiden. Achten Sie darauf, dass die gesamte Luftröhre unterhalb der Trachealkanüle und der gesamte Herz-Lungen-Block sichtbar sind.</li>
	<li>Entfernen Sie den Herz-Lungen-Block und die Luftröhre, indem Sie die Trachealkanüle festhalten und das Bindegewebe hinter der Luftröhre mit einer gebogenen Schere mit stumpfer Spitze entfernen, wobei die Speiseröhre für eine zusätzliche strukturelle Unterstützung befestigt bleibt.</li>
	<li>Erhöhen Sie die Durchflussrate schrittweise auf einen maximalen Durchfluss von 40 mL/kg-1/min-1. Lassen Sie die ersten 50 ml Puffer aus dem System fließen, um eventuell freigesetzte entzündliche Zytokine zu entfernen (Abbildung 3G).</li>
	<li>Bewegen Sie die isolierte Lunge vorsichtig in die mit den beiden Bechern gebildete Doppelbadkammer. Stellen Sie sicher, dass sich die PA-, PV- oder Trachealkanüle an keiner Stelle verdreht, wenn Sie die Lunge bewegen oder hängen. HINWEIS: Die Verhinderung einer Atelektase während der Lungenentnahme und die Verbindung mit dem Setup ist wichtig, insbesondere wenn EVLP bei bereits geschädigten Lungen eingesetzt wird oder wenn Eingriffe vor der EVLP geplant sind. Dies kann beispielsweise durch einen kleinen Clip an der Luftröhre nach Inspiration vor der Überführung in das Beatmungsgerät15 erreicht werden.</li>
</ol>3. Datenerfassung
<ol><li>Verwenden Sie für die Datenerfassung einen handelsüblichen Analog-Digital-Wandler und ein Datenerfassungssystem.</li>
	<li>Achten Sie darauf, dass die Abtastfrequenz für den gegebenen Zweck ausreichend ist (hier 200 Hz) und dass alle relevanten abhängigen Parameter von Bioverstärkern und anderen Eingabegeräten gleichzeitig erfasst werden (Atemwegsdruck, PA und PV-Druck für dieses Protokoll ausgewählt)16.</li>
	<li>Aufzeichnung unabhängiger Parameter (z. B. Perfusionsgeschwindigkeit, Beatmungsrate, Zusammensetzung des belüfteten Gases, Zusammensetzung des Pufferelektrolyten und Lungengewicht).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte, weder finanziell noch anderweitig.

Mehr als 100 Experimente wurden in unserem Labor mit diesem Aufbau erfolgreich durchgeführt. Der modulare Aufbau dieses kundenspezifischen Aufbaus bot eine große Flexibilität für mögliche Änderungen der experimentellen Anforderungen. Während andere Aufbauten einen Deoxygenator18 verwenden, um den konstanten Sauerstoffverbrauch und die CO2 -Produktion durch Endorgane nachzuahmen, verwendete dieses vereinfachte Modell dieses Merkmal nicht, da der Schwerpunkt auf der Untersuchung der Auswi...

Ex-vivo-Lungenperfusionstechniken (EVLP)1 haben in den letzten zehn Jahren als Mittel zur Untersuchung von Lungentransplantationen2, Ischämie/Reperfusion3, Lungenstoffwechsel4 und Immunreaktionen5 zugenommen. Isolierte, aber intakte, beatmete und durchblutete Lungen bieten die äußerst wichtige Möglichkeit, die Reaktion der Lunge, einschließlich des Lungengefäßsystems, auf potenzielle Interventionen und/oder Therapeutika direkt zu beurteilen, ohne potenzielle Störfaktoren, wie z. B. neuronale und hormonelle Eingaben oder eine sich ändernde Hämodynamik in vivo. Gleichzeitig halten sie das physiologische Zusammenspiel von Beatmung und Perfusion aufrecht, im Gegensatz zu in vitro-Bedingungen. Ein Vorschlag, der sich mit Immunantworten in der Lunge5 befasst, benötigt beispielsweise die gleiche Datenqualität wie eine Studie, die sich auf die Vergrößerung des Spenderpools6 für Lungentransplantationen konzentriert. EVLP kann bei einer Vielzahl von Spezies eingesetzt werden, darunter Mäuse3, Ratten 7,8,9,10,11,12, Schweine13 und Menschen 2. Daher ist es notwendig, ein Modell zu etablieren, das zuverlässige Daten aus einer Vielzahl unterschiedlicher experimenteller Parameter liefern kann. Die klinische Relevanz wird in nachfolgenden Studien mit Hilfe des EVLP-Modells als Werkzeug generiert.
Während kommerzielle Setups für die meisten Spezies zum Kauf angeboten werden, können sie oft unerschwinglich sein und die Forscher auf eine bestimmte Marke von Geräten und proprietärer Software beschränken. Jede Abweichung vom Out-of-the-Box-Setup (z. B. der Wechsel von einer Art zu einer anderen) erfordert Weitsicht und das Umgehen des bereitgestellten Setups, was sich als schwierig oder unmöglich erweisen kann. Im Folgenden wird ein DIY-Setup (Do it yourself) für die isolierte Lunge von Ratten beschrieben, das sowohl modular als auch kostengünstig ist, sowie das chirurgische Vorgehen zur Isolierung der Lunge.

<table><tbody><tr><td>1.000 mL Glasbecher</td><td>Pyrex, Chicago, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.500 mL Glasbecher</td><td>Pyrex, Chicago, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Air Trap Compliance Chamber</td><td>Radnoti</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Bioverstärker</td><td>CWE Inc</td><td>BPM-832</td><td></td></tr><tr><td>Klemmen</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02626</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassung (Datenerfassung)</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>NI USB-6343</td><td></td></tr><tr><td>Gasmischer</td><td>CWE Inc, Ardmore, PA</td><td>GSM-4</td><td></td></tr><tr><td>Heizspirale</td><td>Radnoti, Covina, CA</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>11-100-49SH</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td></td><td>Pfizer W63422</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Vollständiges Entwicklungssystem 2014</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Diamondback Drogen</td><td>G2270-0235-50</td><td></td></tr><tr><td>pH700 Sonde</td><td>OAKTON, Vernon Hills, IL&nbsp;</td><td>EW-35419-10</td><td></td></tr><tr><td>Polystat Wasserbad</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-12121-02</td><td></td></tr><tr><td>Nagetierventilator</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>Modell 683</td><td></td></tr><tr><td>Rollenpumpe</td><td>Cole-Parmer, Wertheim, Deutschland&nbsp;</td><td>Ismatec REGLO Digital MS 2/8</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Charles River, Wilmington, MA</td><td>Stammcode 001</td><td></td></tr><tr><td>VetScan i-STAT</td><td>Abraxis, Chicago, IL</td><td>i-STAT 1</td><td></td></tr></tbody></table>

design und implementierung eines ex vivo lungenperfusionsmodells für ratten

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

Ex-vivo-Lungenpräparate sind ein nützliches Modell, das auf viele verschiedene Forschungsbereiche übertragen werden kann und entsprechende In-vivo - und In-vitro-Modelle ergänzt. Laboratorien, die isolierte Lungen verwenden möchten, müssen sich der wichtigen Schritte und inhärenten Herausforderungen bewusst sein, um ein Setup zu etablieren, das erschwinglich und zuverlässig ist und leicht an das gewünschte Thema angepasst werden kann. In dieser Arbeit wird ein DIY-Modell (Do it yourself) für die ex vivo Lungenventilation und -perfusion von Ratten beschrieben, um die Auswirkungen von Medikamenten und Gasen auf den pulmonalen Gefäßtonus zu untersuchen, unabhängig von Veränderungen des Herzzeitvolumens. Die Erstellung dieses Modells umfasst a) das Design und die Konstruktion des Geräts und b) das Verfahren zur Lungenisolierung. Dieses Modell führt zu einem Aufbau, der kostengünstiger ist als kommerzielle Alternativen und dennoch modular genug, um sich an Veränderungen spezifischer Forschungsfragen anzupassen. Verschiedene Hindernisse mussten aus dem Weg geräumt werden, um ein konsistentes Modell zu gewährleisten, das für eine Vielzahl unterschiedlicher Forschungsthemen eingesetzt werden kann. Einmal etabliert, hat sich dieses Modell als sehr anpassungsfähig an verschiedene Fragestellungen erwiesen und kann leicht für verschiedene Studienfächer geändert werden.

Nach 10 Minuten Stabilisierung und Ausgangswerten randomisierten wir einen ersten Satz von 10 männlichen Sprague-Dawley-Ratten in fünf kleine Gruppen: globale No-Flow-Ischämie für 5, 7,5, 8, 9 oder 10 Minuten (n = 2 pro Gruppe), gefolgt von Reperfusion; Diese begrenzten vorläufigen Dosisfindungsexperimente wurden durchgeführt, um eine möglichst lange Ischämiezeit zu ermitteln, die noch eine ausreichende Beatmung und Reperfusion ermöglicht, bevor sich schließlich ein steiler und irreversibler Anstieg des Atemwegsdrucks un...

Ex-vivo-Lungen sind nützlich für eine Vielzahl von Experimenten, um physiologische Daten zu sammeln, wobei die Störvariablen von In-vivo-Experimenten ausgeschlossen werden. Kommerzielle Setups sind oft teuer und in der Art der Daten, die sie sammeln können, begrenzt. Wir beschreiben eine Methode zum Aufbau eines vollständig modularen Aufbaus, der an verschiedene Studiendesigns angepasst werden kann.

Design und Implementierung eines ex vivo Lungenperfusionsmodells für Ratten

Ex vivo lung preparations are a useful model that can be translated to many different fields of research, complementing corresponding in vivo and in vitro ...

Wir demonstrieren eine einfache Methode zur Erstellung und Implementierung eines ex vivo Lungen-Setups von Grund auf. Dies ermöglicht ein erschwingliches und modulares Setup, das für eine Vielzahl von Setups implementiert werden kann. Die hier vorgestellte Technik ist erschwinglich, modular und an die Labore anpassbar, die das Protokoll einrichten.Die Ex-vivo-Operation kann zur Ergänzung von In-vivo-Modellen verwendet werden, um neue Mechanismen aufzuklären. Dieses DIY-Setup wurde entwickelt, um die Lunge in einer kontrollierten Umgebung zu untersuchen. Es steht im Einklang mit dem Forschungsschwerpunkt unseres Labors, der darin besteht, verschiedene Ansätze zur Verbesserung des Ergebnisses nach der HLW zu untersuchen.Der Aufbau kann jedoch an unterschiedliche Forschungsziele angepasst werden, was ihn sehr vielseitig macht. Die Operation erfordert Grundkenntnisse der Anatomie und Physiologie der Atemwege und kann durch Befolgen des Protokolls schnell gemeistert werden. Nichtsdestotrotz ist es wichtig, die in unserem Protokoll beschriebenen Schritte sorgfältig zu befolgen und vor allem die Lunge zu schützen, insbesondere bei der Entfernung der Rippen. Um eine Tracheotomie durchzuführen, kneifen Sie die Haut einer anästhesierten Ratte mit einer Pinzette über die Luftröhre und schneiden Sie die Haut auf.Präparieren Sie den Muskel und das Gewebe stumpf, um die Luftröhre zu erreichen, und stellen Sie sicher, dass keine Blutungen auftreten. Führen Sie dann eine gebogene Pinzette unter die Luftröhre und öffnen Sie sie, um Platz für 3-0-Nähte darunter zu schaffen. Binden Sie dann die Nähte zu einem Boxknoten vor.Machen Sie einen kleinen Schnitt zwischen den Knorpelringen der Luftröhre und führen Sie die Trachealkanüle ein. Binden Sie die Naht ab, um zu verhindern, dass Luft aus dem Trachealschnitt entweicht und um sicherzustellen, dass die Kanüle die Luftröhre nicht belastet. Sobald die Trachealkanüle befestigt ist, beginnen Sie mit der Beatmung der Ratte.Entfernen Sie mit einer großen chirurgischen Schere und Pinzette das Fell vom Bauch der Ratte. Fassen Sie den Xiphoid-Prozess mit der Pinzette und machen Sie einen kleinen horizontalen Schnitt unterhalb der Rippen, wobei Sie darauf achten, dass das Zwerchfell intakt bleibt. Erweitern Sie den horizontalen Schnitt, um die gesamte Membran freizulegen.Injizieren Sie mit einer 22-Gauge-Spritze Heparin in die untere Hohlvene und achten Sie darauf, die Lunge nicht zu punktieren. Fassen Sie den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette und schneiden Sie kranial entlang des Brustbeins, wobei Sie ständig die Lungen visualisieren, um ein Durchtrennen zu verhindern. Spreizen Sie den Brustkorb mit zwei großen Zangen auseinander und schneiden Sie die untere Hohlvene auf, um die Ratte durch Ausbluten einzuschläfern.Schneiden Sie überschüssigen Thymus ab, um eine einfachere Visualisierung des Lungengefäßsystems zu ermöglichen. Lokalisieren Sie die Lungenarterie und führen Sie eine kleine gebogene Pinzette darunter durch. Führen Sie auch hier eine 3-0-Naht darunter und binden Sie sie zu einem Kastenknoten vor.Machen Sie dann einen kleinen Schnitt in die rechte Herzkammer und führen Sie die PA-Kanüle ein. Befestigen Sie die Kanüle mit der Naht und beginnen Sie mit der Perfusion mit 1,5 Millilitern pro Minute. Schneiden Sie sofort die Spitze des Herzens heraus, um einen Druckaufbau in der Lunge zu verhindern.Reißen Sie mit einer kleinen gebogenen Pinzette die Mitralklappe und bestätigen Sie visuell, dass die Pinzette ungehindert in den linken Vorhof eindringen kann. Wickeln Sie eine 3-0-Naht fest um das Herz unterhalb des Vorhofs und führen Sie die PV-Kanüle in den linken Vorhof ein, um sicherzustellen, dass der Puffer aus dem linken Vorhof fließen kann, bevor Sie die Naht abbinden. Schneiden Sie anschließend mit einer stumpfen Schere überschüssiges Gewebe zwischen der Brusthöhle und dem Tracheostomaschnitt ab, um eine Beschädigung der Luftröhre zu vermeiden.Stellen Sie sicher, dass die Luftröhre unterhalb der Trachealkanüle und der gesamte Herz-Lungen-Block sichtbar sind. Um den Herz-Lungen-Block und die Luftröhre zu entfernen, halten Sie die Trachealkanüle fest und verwenden Sie eine gebogene Schere mit stumpfer Spitze, um das Bindegewebe hinter der Luftröhre zu entfernen. Die Lebensfähigkeit der Lunge nach Ischämie und Reperfusion wird vorgestellt.Die längste Ischämiezeit für 150 Minuten Reperfusion betrug acht Minuten. Es ist entscheidend, das Gefäßsystem richtig zu kanülieren, damit die isolierte Lunge während des gesamten Experiments lebensfähig bleibt. Die Lunge bleibt nach dem Eingriff intakt, so dass grundlegende Messungen wie Nass- oder Trockengewicht oder Histologie nach dem Versuch durchgeführt werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt eine ex vivo Technik zur isolierten Lungenperfusion. Es ist ein Instrument für die Lungenforschung, das die Untersuchung verschiedener physiologischer und pathologischer Mechanismen bei Lungentransplantationsverfahren unterstützen wird.

ex vivo Lungenperfusion: Eine Technik für die Lungenforschung im Kaninchenmodell

Ex-vivo-Lung Perfusion (EVLP) konnten Lungentransplantation beim Menschen leichter, indem du die Fähigkeit, Organe zu bewerten und zu erweitern den Spenderkreis zur Verfügung stehen. Hier beschreiben wir die Entwicklung einer Ratte EVLP Programm und Verfeinerungen, die für ein reproduzierbares Modell für zukünftige Erweiterungen zu ermöglichen.

Methode Isolated<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion in einem Rattenmodell: Lehren aus Entwicklung einer Ratte EVLP Programm gelernt

Hier stellen wir Optimierungen an einem Rattenlungentransplantationsmodell vor, die dazu dienen, die Ergebnisse zu verbessern. Wir bieten eine Größentabelle für Manschetten basierend auf dem Körpergewicht, eine Messstrategie zur Bestimmung des 4. Interkostalraums sowie Methoden des Wundverschlusses und der BAL-Flüssigkeit (bronchoalveoläre Lavage) und Gewebeentnahme.

Ein Ratten-Lungentransplantationsmodell für warme Ischämie/Reperfusionsschäden: Optimierungen zur Verbesserung der Ergebnisse

Das isolierte Kaninchenlungenpräparat ist ein Goldstandardwerkzeug in der Lungenforschung. Diese Publikation zielt darauf ab, die Technik zu beschreiben, die für die Untersuchung physiologischer und pathologischer Mechanismen entwickelt wurde, die an der Reaktivität der Atemwege, der Lungenerhaltung und der präklinischen Forschung bei Lungentransplantationen und Lungenödemen beteiligt sind.

Isoliertes Lungenperfusionssystem im Kaninchenmodell

In dieser Arbeit stellen wir ein Bewertungsprotokoll eines heterotopisch implantierten Herzens nach normothermer ex situ Konservierung im Rattenmodell vor.

Rattenmodell der normothermischen Ex-situ-perfundierten heterotopen Herztransplantation

Hier beschreiben wir die notwendigen Schritte zur Etablierung eines Ratten-EVLP-Modells und zeigen das Entzündungsprofil, das mit der perfundierten Lunge assoziiert ist. Ziel ist es, das Wissen und die Erfahrungen über das EVLP-Modell von Ratten zu verbreiten und so ein ganzheitliches Verständnis der biologischen Reaktionen zu ermöglichen, die mit dieser revolutionären Technik verbunden sind.

Etablierung eines ex vivo Lungenperfusionsmodells an Ratten für translationale Einblicke in die Lungentransplantation

Hier beschreiben wir die Anwendung eines polymerisierten humanen Hämoglobin (PolyhHb)-basierten Sauerstoffträgers als Perfusat und das Protokoll, in dem diese Perfusionslösung in einem Modell der ex vivo Lungenperfusion von Ratten getestet werden kann.

Erforschung alternativer Perfusionslösungen unter Verwendung von polymerisierten hämoglobinbasierten Sauerstoffträgern der nächsten Generation in einem Modell der ex vivo Lungenperfusion von Ratten

Das Ziel ist es, ein neues ex vivo Lungenperfusionsmodell (EVLP) an Ratten zu entwickeln, das eine konsistente Lungenfunktion für 4 Stunden während der gesamten EVLP aufrechterhalten kann und der Industrie Implementierungsspezifikationen liefert, die eine robuste Methode zur Anwendung von EVLP auf Nagetiermodelle bieten.

Etablierung eines neuartigen ex vivo Lungenperfusionssystems für Rattenlungen nach Kreislauftod

Dieses Protokoll stellt ein ex-vivo-Lungenperfusionsmodell von Ratten vor, das eine vorübergehende Exposition gegenüber einer kalibrierten thermischen Belastung beinhaltet und endogene Schutzmechanismen für die therapeutische Rekonditionierung geschädigter Lungentransplantate fördert. Der Ansatz ist skalierbar und reproduzierbar und unterstützt die Entwicklung nicht-medikamentöser Therapien zur Verbesserung des Erfolgs von Lungentransplantationen.

Thermische Präkonditionierung bei der ex-vivo Lungenperfusion zur Rehabilitation geschädigter Lungentransplantate vor der Transplantation

Ein neues in vitro-System für die gleichzeitige Laden vier Sehnen in der Kultur beschrieben wird.

Ex vivo mechanische Belastung der Sehnen

Erfahren Sie, wie Sie ein kostengünstiges, modulares ex vivo Lungenperfusionsmodell für Ratten etablieren. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Lungenphysiologie-Studien und ergänzt in vivo Experimente zur Erforschung neuer Mechanismen.

Design und Implementierung eines ex vivo Lungenperfusionsmodells für Ratten

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