Name: Schnelle Entwicklung von Schaltkreisen zur Identifizierung von Zellzuständen mit Poly-Transfektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Lernen Sie die Poly-Transfektionsmethode zur schnellen Entwicklung genetischer Schaltkreise in Säugetierzellen. Diese Technik ermöglicht die effiziente Charakterisierung komplexer Beziehungen zwischen biologischen Komponenten.

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Wir möchten uns bei ehemaligen Mitgliedern des Weiss Labs bedanken, die die Poly-Transfektionsmethode und ihre Anwendung auf Zellklassifikatoren geleitet oder dazu beigetragen haben: Jeremy Gam, Bre DiAndreth und Jin Huh; weitere Weiss-Labormitglieder, die zur weiteren Methodenentwicklung/-optimierung beigetragen haben: Wenlong Xu, Lei Wang und Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard und Gruppenmitglieder, darunter Patrick Donahue und Hailey Edelstein, für die Prüfung der Polytransfektion und die Bereitstellung von Feedback; und Prof. Nika Shakiba für die Einladung zu diesem Manuskript und das Feedback. Wir möchten uns auch bei den National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] bedanken; Nationale Wissenschaftsstiftung [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, teilweise] vom NCI und den National Institutes of Health [P50GM098792] zur Finanzierung dieser Arbeit.

HINWEIS: Tabelle 1 und Tabelle 2 dienen als wichtige Referenzen für dieses Protokoll. Tabelle 1 zeigt die Skalierung der Reagenzien für Reaktionen und Tabelle 2 zeigt die Arithmetik des DNA-Verhältnisses für eine im Protokoll beschriebene Beispiel-Polytransfektion (obere Hälfte) und für ein mögliches Folgeexperiment (untere Hälfte).
1. Zellen für die Transfektion vorbereiten
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die Kultur menschlicher embryonaler Nierenzellen (HEK293) zu 60 % bis 80 % konfluent ist, bevor Sie mit dem Protokoll beginnen. Dazu 1 x 106 Zellen 2 Tage vorher in einer 100 mm x 15 mm großen Gewebekultur-Petrischale aussäen und bei 37 °C mit 5% CO2 inkubieren. HINWEIS: Obwohl sich unser Protokoll auf HEK293-Zellen konzentriert, können andere Zelltypen substituiert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie das Medium und die Zellen für die Transfektion vor, wie unten beschrieben.<ol><li>Mindestens 20 ml einer Lösung von Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA; siehe Materialtabelle) auf 37 °C vorwärmen. Mindestens 2,4 ml Trypsin und 2,4 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ebenfalls auf 37 °C vorwärmen. Serummedium auf ~16 °C vorwärmen. HINWEIS: Alle Gewebekulturarbeiten sollten mit Sorgfalt in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in der DMEM-Lösung wie unten beschrieben.<ol><li>Aspirieren und entsorgen Sie die aktuellen Medien. Geben Sie 2 ml PBS auf die HEK293-Zellkultur, um die Zellen zu waschen. Saugen Sie das PBS ab und entsorgen Sie es.</li>
		<li>Geben Sie 2 ml Trypsin auf die HEK293-Zellkultur. Stellen Sie die Petrischale für 3 min in einen Inkubator bei 37 °C oder bis die Zellen nicht mehr an der Schale haften. Stellen Sie die Schale wieder in die Biosicherheitswerkbank und verdünnen Sie die Zelllösung, indem Sie 8 ml DMEM-Lösung in die Platte geben.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösung, indem Sie mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren. Saugen Sie das gesamte Medium ab und geben Sie es in ein konisches 15-ml-Röhrchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 3 Minuten, um sie zu pelletieren. Saugen Sie das Medium ab (achten Sie darauf, die Zellen nicht abzusaugen) und entsorgen Sie es. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml DMEM-Lösung und mischen Sie sie durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren.</li>
	<li>Schätzen Sie die aktuelle Zellkonzentration mit einem automatisierten Zellzähler (aufgeführt in der Materialtabelle). Säen Sie sechs Vertiefungen (in diesem Beispiel) in einer 24-Well-Platte mit 1 x 105 Zellen (für eine Aussaatdichte von 50.000 Zellen/cm2).</li>
	<li>Fügen Sie die DMEM-Lösung bis zu 500 μl hinzu (fügen Sie zuerst die DMEM-Lösung in die Wells hinzu) und kennzeichnen Sie dann eine Well-Vertiefung pro Behandlung wie folgt: keine Farbkontrolle, mKO2-Kontrolle, TagBFP-Kontrolle, NeonGreen-Kontrolle, gesamte Farbkontrolle und Polytransfektion 1. TagBFP-, mKO2- und NeonGreen-Kontrollvertiefungen sind einfarbige Kontrollen für alle fluoreszierenden Proteine, die in der Polytransfektion enthalten sind.</li>
</ol>2. Durchführung der Transfektion
<ol><li>Bereiten Sie Röhrchen für jedes DNA-Aggregat vor. Legen Sie 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen beiseite und beschriften Sie die Röhrchen als: keine Farbkontrolle, mKO2-Steuerung, TagBFP-Steuerung, NeonGreen-Steuerung, alle Farbkontrolle, Poly-Transfektionsmischung 1 und Poly-Transfektionsmischung 2.<ol><li>Geben Sie 36 μl reduziertes Serummedium in die No-Color-Control-, mKO2-Control-, TagBFP-Control-, NeonGreen-Control- und alle Color-Control-Röhrchen. Geben Sie 18 μl reduziertes Serummedium in jedes der Röhrchen der Poly-Transfektionsmischung 1 und der Poly-Transfektionsmischung 2. HINWEIS: Die Plasmidkonzentrationen werden mit 150 ng/μl angenommen.</li>
		<li>Geben Sie 600 ng Füllstoffplasmid in das farblose Kontrollröhrchen. Geben Sie 300 ng mKO2 und 300 ng Füllstoffplasmid in das mKO2-Farbkontrollröhrchen. Geben Sie 300 ng TagBFP und 300 ng Füllstoffplasmid in das TagBFP-Farbkontrollröhrchen.</li>
		<li>Geben Sie 300 ng konstitutives NeonGreen-Plasmid und 300 ng Füllstoffplasmid in das NeonGreen-Farbkontrollröhrchen. Fügen Sie jeweils 100 ng mKO2, TagBFP und konstitutives NeonGreen sowie 300 ng Füllstoffplasmid in das Allfarbkontrollröhrchen hinzu.</li>
		<li>150 ng mKO2 in das Röhrchen der Poly-Transfektionsmischung 1 geben. 75 ng Reporter-NeonGreen-Plasmid und 75 ng Füllstoff-Plasmid in das Röhrchen der Poly-Transfektionsmischung 1 geben.</li>
		<li>Geben Sie 150 ng TagBFP in das Röhrchen der Poly-Transfektionsmischung 2. 75 ng L7ae-Plasmid und 75 ng Füllstoffplasmid werden in das Poly-Transfektionsmischungs-2-Röhrchen gegeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie den Transfektions-Mastermix in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen her, indem Sie 216 μl reduziertes Serummedium mit 9,48 μl Transfektionsreagenz kombinieren (siehe Tabelle 1 für Reagenzienverhältnisse und Reaktionsskalierung). Durch Auf- und Abpipettieren gut mischen und beiseite stellen.</li>
	<li>Geben Sie 1,58 μl Enhancer-Reagenz in jedes der Röhrchen ohne Farbkontrolle, Einzelfarbkontrolle und alle Farbkontrollröhrchen. Geben Sie 79 μl Enhancer-Reagenz in jedes der Poly-Transfektions-Mischröhrchen. Mischen Sie jedes Röhrchen einzeln, indem Sie kräftig pipettieren.</li>
	<li>Geben Sie den Transfektions-Mastermix in jedes Röhrchen, das DNA enthält.<ol><li>Fügen Sie 37,58 μl Transfektions-Mastermix zu jedem der Röhrchen ohne Farbkontrolle, Einzelfarbkontrolle und allen Farbkontrollröhrchen hinzu. Mischen Sie jedes Röhrchen einzeln, indem Sie kräftig pipettieren.</li>
		<li>Geben Sie 18,79 μl Transfektions-Mastermix in jedes der Poly-Transfektions-Mix-Röhrchen. Mischen Sie jedes Röhrchen einzeln, indem Sie kräftig pipettieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Geben Sie die Transfektionsmischungen in die Vertiefungen.<ol><li>Pipettieren Sie 65,97 μl jeder Transfektionsmischung für die Farblosigkeit, die Einzelfarbe und alle Farbkontrollen in die entsprechenden Vertiefungen.</li>
		<li>Pipettieren Sie 32,98 μl des Poly-Transfektions-Mixes 1 in die Poly-Transfektionsvertiefung und schwenken Sie die Platte schnell, aber vorsichtig in einem engen Achtermuster entlang einer ebenen Oberfläche, um die Komplexe effektiv zu verteilen. Pipettieren Sie dann 32,98 μl der Poly-Transfektionsmischung 2 in dieselbe Poly-Transfektionsvertiefung und schwenken Sie die Platte auf die gleiche Weise.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie die Platte für einen Zeitraum von 48 h bei 37 °C mit 5 % CO2 und ohne Schütteln in einen Inkubator. HINWEIS: Um die Zellviabilität zu erhöhen, kann das Zellmedium nach der Transfektion alle 6 Stunden ausgetauscht werden (obwohl dies nicht immer notwendig ist, und bei HEK293-Zellen und seinen Derivaten muss man darauf achten, die Zellen beim Medienwechsel nicht von der Platte zu lösen).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenz</td>
			<td colspan="3">Menge</td>
			<td colspan="3">Skalierung</td>
		</tr><tr><td>Reduziertes Serummedium für DNA-Gemisch</td>
			<td colspan="3">36 μL pro Kontrollröhrchen, 18 μL pro Polytransfektionsröhrchen</td>
			<td colspan="3">0,05 μl reduziertes Serummedium/ng DNA pro Röhrchen, mit 10-20 % zusätzlichem Volumen für das Pipettieren</td>
		</tr><tr><td>DNS</td>
			<td colspan="3">300-600 ng pro Tube</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>P3000</td>
			<td colspan="3">1,58 μl pro Kontrollröhrchen, 0,79 μl pro Polytransfektionsröhrchen</td>
			<td colspan="3">0,0022 μL P3000/ng DNA pro Röhrchen, mit 10-20% extra</td>
		</tr><tr><td>Reduziertes Serummedium für Lipo Mastermix</td>
			<td colspan="3">36 μL pro Kontrollröhrchen, 18 μL pro Polytransfektionsröhrchen</td>
			<td colspan="3">0,05 μl reduzierte Serummedium/ng Gesamt-DNA mit 10-20 % zusätzlichem Volumen für das Pipettieren</td>
		</tr><tr><td>Transfektions- und Enhancer-Reagenz</td>
			<td colspan="3">1,58 μl pro Kontrollröhrchen, 0,79 μl pro Polytransfektionsröhrchen</td>
			<td colspan="3">0,0022 μL Lipofectamin 3000/ng DNA, mit 10-20% extra</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Reagenzienskalierung für Transfektionen. Die Tabelle zeigt das richtige Verhältnis des einzuschließenden Reagenzes für die DNA-Menge, die in einer einzelnen Vertiefung enthalten ist. Dies kann verwendet werden, um Reaktionen effektiv zu skalieren und Mastermixe zu bilden. Die Reagenzmengen wurden so skaliert, dass sie einen Überschuss von 20 % enthalten.
3. Vorbereiten der Zellen für die Durchflusszytometrie
<ol><li>Mindestens 4,2 ml der DMEM-Lösung auf 37 °C vorwärmen. Mindestens 4,2 ml Trypsin und 4,2 ml PBS auf 37 °C vorwärmen. Halten Sie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierlösung (FACS) bis zur Verwendung bei 4 °C.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in der FACS-Pufferlösung (PBS ergänzt mit 1 % BSA, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA] und 0,1 % Natriumazid [NaN 3], um die Verklumpung zu reduzieren; siehe Materialtabelle) wie unten beschrieben.<ol><li>Saugen Sie die aktuellen Medien ab und entsorgen Sie sie in jedem Brunnen. Geben Sie 5 ml PBS in jede Vertiefung, um die Zellen zu waschen. Saugen Sie das PBS ab und entsorgen Sie es.</li>
		<li>Geben Sie 5 ml Trypsin in jede Vertiefung. Stellen Sie den Teller für 3 Minuten in einen Inkubator bei 37 °C oder bis die Zellen nicht mehr an der Schale haften. Legen Sie die Platte wieder in die Biosicherheitswerkbank zurück und verdünnen Sie die Zelllösungen, indem Sie 5 ml DMEM-Lösung in jede Vertiefung geben.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösung für jede Vertiefung, indem Sie sie mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren. Saugen Sie für jede Vertiefung alle Medien ab und geben Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 3 Minuten, um sie zu pelletieren. Saugen Sie die Medien ab und achten Sie darauf, die Zellen nicht abzusaugen und zu verwerfen. In jedem Röhrchen werden die Zellen in 5 ml FACS-Pufferlösung resuspendiert und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt.</li>
	<li>Jede Zellsuspensionslösung wird durch ein Sieb (um Klumpen zu entfernen) in separate konische Röhrchen für die Durchflusszytometrie gegeben. Lassen Sie diese Röhrchen nicht länger als 1 Stunde auf Eis und führen Sie so schnell wie möglich eine Durchflusszytometrie durch.</li>
</ol>4. Durchführung der Durchflusszytometrie
HINWEIS: Die Bedienung eines Durchflusszytometers erfordert eine angemessene Schulung und Kenntnis der erforderlichen Aufgaben. Da Software und Ausrüstung variieren können und Benutzer allgemein geschult werden sollten, bezieht sich dieser Abschnitt auf bestimmte Vorgänge, die sinnvoll ausgeführt werden können.
<ol><li>Untersuchen Sie zunächst die Zellen, die mit der Füllstoffplasmidkontrolle (keine Farbkontrolle) transfiziert wurden, um Zellmerkmale auszuwählen und Anomalien (einschließlich Aggregate, Trümmer usw.) zu vermeiden. Es gibt zwar viele Kombinationen von Parametern zur Unterscheidung von Zellen, aber verwenden Sie die folgenden drei allgemeinen Optionen als gute Möglichkeit, Unterscheidungsmerkmale zu visualisieren.<ol><li>Betrachten Sie den seitlichen Streubereich (logarithmische oder lineare Skala je nach Präferenz/Zellentyp) im Vergleich zum vorderen Streubereich (lineare Skala).</li>
		<li>Betrachten Sie die Höhe der seitlichen Streuung (logarithmische Skala) im Vergleich zur Breite der seitlichen Streuung (lineare Skala).</li>
		<li>Betrachten Sie die Breite der Vorwärtsstreuung (lineare Skalierung) im Vergleich zur Vorwärtsstreuungshöhe (lineare Skalierung).</li>
	</ol></li>
	<li>Sehen Sie sich als Nächstes die einzelnen Farbsteuerelemente an. Verwenden Sie den All-Color-Regler, um die Gerätespannungen so abzustimmen, dass die Signale von jedem fluoreszierenden Protein auf äquivalente beliebige Einheiten (a.u.) der Fluoreszenz normalisiert werden. Führen Sie als Nächstes die einzelnen Farbsteuerelemente für jedes fluoreszierende Protein aus, die zum Festlegen der Kompensationsmatrix verwendet werden, um eine Durchblutungskorrektur zu ermöglichen. HINWEIS: Idealerweise sollte der volle Dynamikbereich der Fluoreszenzwerte sichtbar sein. Eine weitere Normalisierung fluoreszierender Proteinsignale kann durch Umrechnung in standardisierte Einheiten (z. B. Moleküle mit äquivalentem Fluorescein [MEFLs; siehe Beal et al.15]) erfolgen. Um die MEFL-Konvertierung während der Analyse zu aktivieren, führen Sie Regenbogen-Kalibrierungsperlen aus. Eine solche Kalibrierung ist auch nützlich, um die Signalschwankungen von Gerät zu Gerät und von Tag zu Tag zu reduzieren16.</li>
	<li>Führen Sie das Poly-Transfektions-Probenröhrchen aus. HINWEIS: Wenn möglich, wird empfohlen, Zellen mit 1.000 x 10^ (^ = Mischungen) auszuführen, da höherdimensionale Polytransfektionen während der Analyse in mehrere Abschnitte unterteilt werden müssen und jeder Abschnitt genügend Zellen (idealerweise >10) benötigt, um statistisch signifikante Vergleiche anzustellen.</li>
</ol>5. Durchführen einer Analyse nach dem Experiment
<ol><li>Verwenden Sie zunächst Daten aus den Kontrollen (und ggf. den Perlen), um genaue Ergebnisse zu erzielen. Verwenden Sie eines der verfügbaren Software-Tools, um Live-Cell-Gating (unter Verwendung der oben beschriebenen Gates), Kompensation und Autofluoreszenzkorrektur durchzuführen. HINWEIS: Wir verwenden in der Regel entweder benutzerdefinierten MATLAB-Code (z. B. https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis oder Cytoflow17), der sowohl über eine grafische Benutzeroberfläche als auch über eine Python-Bibliothek verfügt, die für die Vorverarbeitungsphase und für die Polytransfektionsanalyse geeignet ist.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Methode</td>
			<td>Komplex</td>
			<td>ng Fluoreszierender Marker</td>
			<td>ng L7ae (Bruch)</td>
			<td>ng Reporter (Bruch)</td>
			<td>ng Füllstoff-DNA (Fraktion)</td>
			<td>Gesamt (ng)</td>
		</tr><tr><td>Poly-Transfektion 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>Poly-Transfektion 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>25 (1/6)</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>25(1/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: DNA-Mengen für die Polytransfektion, die im Protokoll demonstriert werden, und ein Beispiel für ein Folgeexperiment mit abgestimmten Plasmidverhältnissen. Die obere Hälfte der Tabelle zeigt die Zusammensetzung der Plasmide, die in einem einfachen Polytransfektionsexperiment verwendet werden. Die untere Hälfte zeigt die Zusammensetzung eines aktualisierten Experiments, das die Plasmidverhältnisse anpasst, um einen hypothetischen Konzentrationsraum besser abzutasten, in dem sich der Genexpressionsmodulator in einem optimaleren Verhältnis von 1:5 im Verhältnis zu seinem Reporter befindet, was mehr transfizierte Zellen ergibt, die um dieses Verhältnis herum beprobt werden können.

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<li>Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21+as+a+key+regulator+of+oncogenic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">miR-21 as a key regulator of oncogenic processes.</a> Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).</li>
<li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mining+of+prokaryotic+repressors+for+orthogonal+logic+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates.</a> Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).</li>
<li>Stanton, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+transfer+of+prokaryotic+sensors+and+circuits+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).</li>
</ol>

R.W. ist Mitbegründer von Strand Therapeutics und Replay Bio; R.W. und R.J. reichten ein vorläufiges Patent im Zusammenhang mit einem Zelltypklassifikator ein.

Rapid-Prototyping-Methoden wie Computer-Aided Design (CAD), Breadboarding und 3D-Druck haben die Disziplinen des Maschinenbaus, der Elektrotechnik und des Bauingenieurwesens revolutioniert. Die Fähigkeit, schnell nach vielen möglichen Lösungen für eine bestimmte Herausforderung zu suchen, beschleunigt den Fortschritt in einem Bereich erheblich. Wir glauben, dass die Polytransfektion eine analoge Technologie für die Biotechnik ist, die ein schnelles Prototyping genetischer Schaltkreise ermöglicht. Darüber hinaus erfordern...

Das Gebiet der synthetischen Biologie von Säugetieren hat sich rasant weiterentwickelt, von der Entwicklung einfacher Sense-and-Response-Teile in kultivierten Zelllinien bis hin zur Optimierung komplexer Netzwerke von Genen, um reale Herausforderungen in der Diagnostik und Therapie anzugehen1. Diese ausgeklügelten Schaltkreise sind in der Lage, biologische Eingaben von microRNA-Profilen über Zytokine bis hin zu niedermolekularen Medikamenten zu erfassen und logische Verarbeitungsschaltkreise wie Transistoren, Bandpassfilter, Kippschalter und Oszillatoren zu implementieren. Sie haben auch vielversprechende Ergebnisse in Tiermodellen für Krankheiten wie Krebs, Arthritis, Diabetes und viele mehr gezeigt 1,2,3,4,5. Mit zunehmender Komplexität einer Schaltung wird es jedoch immer schwieriger, die Pegel der einzelnen Komponenten zu optimieren.
Eine besonders nützliche Art von genetischem Schaltkreis ist ein Zellklassifikator, der so programmiert werden kann, dass er zelluläre Zustände erkennt und darauf reagiert. Die selektive Produktion von Protein- oder RNA-Outputs in bestimmten zellulären Zuständen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Differenzierung von Zellen und Organoiden zu steuern und zu programmieren, kranke Zellen und/oder unerwünschte Zelltypen zu identifizieren und zu zerstören und die Funktion therapeutischer Zellen zu regulieren 1,2,3,4,5 . Die Schaffung von Schaltkreisen in Säugetierzellen, die Zellzustände aus mehreren zellulären RNA- und/oder Proteinspezies genau klassifizieren können, war jedoch eine große Herausforderung.
Einer der zeitaufwändigsten Schritte bei der Entwicklung eines Zellklassifizierungsschaltkreises besteht darin, die relativen Expressionsniveaus einzelner Komponentengene, wie z. B. Sensoren und Verarbeitungsfaktoren, innerhalb des Schaltkreises zu optimieren. Um die Schaltungsoptimierung zu beschleunigen und den Aufbau anspruchsvollerer Schaltkreise zu ermöglichen, wurde in neueren Arbeiten die mathematische Modellierung von Zellklassifikatorschaltungen und deren Komponenten verwendet, um optimale Zusammensetzungen und Topologien vorherzusagen 6,7. Während dies bisher starke Ergebnisse gezeigt hat, ist die mathematische Analyse durch die Notwendigkeit begrenzt, das Input-Output-Verhalten von Komponentengenen in der Schaltung systematisch zu charakterisieren, was zeitaufwändig ist. Darüber hinaus kann in komplexen genetischen Schaltkreisen eine Vielzahl von kontextabhängigen Problemen auftreten, die dazu führen, dass sich das Verhalten eines vollständigen Schaltkreises Vorhersagen widersetzt, die auf der Charakterisierung einzelner Teile basieren 8,9.
Um komplexe Säugetierschaltkreise wie Zellzustandsklassifikatoren schneller zu entwickeln und zu testen, entwickelte unser Labor eine Technik namens Poly-Transfection10, eine Weiterentwicklung von Plasmid-Co-Transfektionsprotokollen. Bei der Co-Transfektion werden mehrere Plasmid-DNA-Spezies mit einem positiv geladenen Lipid- oder Polymerreagenz komplexiert und dann korreliert an die Zellen abgegeben (Abbildung 1A). Bei der Polytransfektion werden die Plasmide separat mit dem Reagenz komplexiert, so dass die DNA aus jedem Transfektionskomplex dekorreliert an die Zellen abgegeben wird (Abbildung 1B). Bei dieser Methode werden Zellen innerhalb der transfizierten Population zahlreichen Kombinationen von Verhältnissen von zwei oder mehr DNA-Nutzlasten ausgesetzt, die unterschiedliche Schaltkreiskomponenten tragen.
Um die Verhältnisse der Schaltungskomponenten zu messen, die an jede Zelle abgegeben werden, enthält jeder Transfektionskomplex innerhalb einer Polytransfektion einen konstitutiv exprimierten Fluoreszenzreporter, der als Proxy für die zelluläre Aufnahme des Komplexes dient. Füllstoff-DNA, die keine Elemente enthält, die in einer Säugetierzelle aktiv sind, wird verwendet, um die relative Menge der fluoreszierenden Reporter- und Schaltkreiskomponenten einzustellen, die in einem einzigen Transfektionskomplex an eine Zelle abgegeben werden, und wird in der Diskussion ausführlicher diskutiert. Ein Beispiel für Füllstoff-DNA, die im Weiss-Labor verwendet wird, ist ein Plasmid, das eine Terminatorsequenz enthält, aber keinen Promotor, keine kodierende Sequenz usw. Zellen mit unterschiedlichen Verhältnissen der Schaltkreiskomponenten können dann verglichen werden, um optimale Verhältnisse für die Funktion der Genschaltkreise zu finden. Dies wiederum liefert nützliche Vorhersagen für die Auswahl von Promotoren und anderen Schaltkreiselementen, um optimale Genexpressionsniveaus zu erreichen, wenn Schaltkreiskomponenten zu einem einzigen Vektor für die genetische Integration kombiniert werden (z. B. ein Lentivirus, ein Transposon oder ein Landeplatz). Anstatt also die Verhältnisse zwischen den Schaltungskomponenten auf der Grundlage von Intuition oder über einen zeitaufwändigen Trial-and-Error-Prozess zu wählen, wertet die Polytransfektion eine Vielzahl von Stöchiometrien zwischen genetischen Teilen in einer Eintopfreaktion aus.
In unserem Labor hat die Polytransfektion die Optimierung vieler genetischer Schaltkreise ermöglicht, darunter Zellklassifikatoren, Feedback- und Feedforward-Controller sowie bistabile Motive. Diese einfache, aber wirkungsvolle Methode beschleunigt die Designzyklen komplexer genetischer Schaltkreise in Säugetierzellen erheblich. Seitdem wurde die Polytransfektion verwendet, um mehrere genetische Schaltkreise zu charakterisieren, um ihre mehrdimensionalen Input-Output-Übertragungsfunktionen mit hoher Auflösungaufzudecken 10, eine alternative Schaltkreistopologie für die Zellzustandsklassifizierung 11 zu optimieren und verschiedene veröffentlichte12,13 und laufende Projekte zu beschleunigen.
Hier beschreiben und beschreiben wir den Arbeitsablauf für den Einsatz der Polytransfektion zur schnellen Optimierung eines genetischen Schaltkreises (Abbildung 2). Das Protokoll zeigt, wie qualitativ hochwertige Poly-Transfektionsdaten generiert und mehrere häufige Fehler im Poly-Transfektionsprotokoll und in der Datenanalyse vermieden werden können (Abbildung 3). Anschließend wird demonstriert, wie die Polytransfektion zur Charakterisierung einfacher Schaltungskomponenten eingesetzt werden kann und dabei die Ergebnisse der Polytransfektion mit der Co-Transfektion verglichen werden können (Abbildung 4). Schließlich zeigen die Ergebnisse der Polytransfektion eine Optimierung des Krebsklassifikatorschaltkreises (Abbildung 5).

<table><tbody><tr><td>Konische 15-ml-Corning Falcon-Röhrchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Petrischale</td><td>Jedes Unternehmen seiner Wahl</td><td></td> <td>(nicht pyrogen, steril, RNase-, DNase-, DNA- und pyrogenfrei)</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td> Jedes <td>Unternehmen seiner Wahl</td><td></td><td>Kann 15-ml-Falcon-Röhrchen 300 rcf</td></tr> <tr><td>aussetzenCountess 3 Automatisierter Zellzähler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Zellzählkammer Objektträger</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflow</td><td>Nichtkommerzielles Softwarepaket</td><td></td><td>https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>Verwenden Sie das richtige Medium für Ihren Zelltyp</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>HEK-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Verwenden Sie den entsprechenden Zelltyp für Ihre Experimente. HEK-Zellen neigen dazu, sehr effizient zu transfizieren.</td></tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-12401</td><td>Verwenden Sie den entsprechenden Zelltyp für Ihre Experimente.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 und P3000 Enhancer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000001</td><td>Verwenden Sie das richtige Reagenz für Ihren Zelltyp; Transfektions- und Enhancer-Reagenz</td></tr><tr><td>LSRFortessa Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL</td><td>Beliebiges Unternehmen Ihrer Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>reduziertes Serummedium</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Rainbow Kalibrierkügelchen</td><td>Spherotech</td><td>URCP-100-2H</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle entwicklung von schaltkreisen zur identifizierung von zellzuständen mit poly-transfektion

Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection

Genetische Schaltkreise von Säugetieren haben gezeigt, dass sie das Potenzial haben, eine Vielzahl von Krankheitszuständen zu erkennen und zu behandeln, aber die Optimierung der Ebenen von Schaltkreiskomponenten bleibt herausfordernd und arbeitsintensiv. Um diesen Prozess zu beschleunigen, hat unser Labor die Poly-Transfektion entwickelt, eine Hochdurchsatz-Erweiterung der traditionellen Transfektion von Säugetieren. Bei der Polytransfektion führt jede Zelle in der transfizierten Population im Wesentlichen ein anderes Experiment durch, bei dem das Verhalten des Schaltkreises bei unterschiedlichen DNA-Kopienzahlen getestet wird und die Benutzer eine große Anzahl von Stöchiometrien in einer Eintopfreaktion analysieren können. Bisher wurden Poly-Transfektionen demonstriert, die das Verhältnis von Drei-Komponenten-Schaltkreisen in einem einzigen Zelltopf optimieren. Prinzipiell kann die gleiche Methode für die Entwicklung noch größerer Schaltungen verwendet werden. Die Ergebnisse der Polytransfektion können leicht angewendet werden, um optimale Verhältnisse von DNA zu Co-Transfektion für transiente Schaltkreise zu finden oder um Expressionsniveaus für Schaltkreiskomponenten für die Erzeugung stabiler Zelllinien zu wählen.
Hier demonstrieren wir den Einsatz von Poly-Transfektion zur Optimierung einer Drei-Komponenten-Schaltung. Das Protokoll beginnt mit experimentellen Designprinzipien und erklärt, wie die Poly-Transfektion auf traditionellen Co-Transfektionsmethoden aufbaut. Als nächstes wird die Polytransfektion der Zellen durchgeführt und einige Tage später eine Durchflusszytometrie durchgeführt. Schließlich werden die Daten analysiert, indem Schichten der Einzelzell-Durchflusszytometriedaten untersucht werden, die Teilmengen von Zellen mit bestimmten Komponentenverhältnissen entsprechen. Im Labor wurde die Polytransfektion zur Optimierung von Zellklassifikatoren, Rückkopplungs- und Feedforward-Controllern, bistabilen Motiven und vielem mehr eingesetzt. Diese einfache, aber wirkungsvolle Methode beschleunigt Designzyklen für komplexe genetische Schaltkreise in Säugetierzellen.

In Abbildung 1 vergleichen wir die Co-Transfektion mit der Poly-Transfektion. Bei einer Co-Transfektion werden alle Plasmide in der gleichen Transfektionsmischung abgegeben, was zu einer hohen Korrelation zwischen der Menge jedes einzelnen Plasmids führt, die eine einzelne Zelle erhält (Abbildung 1A). Während die Anzahl der gesamten Plasmide, die an jede Zelle abgegeben werden, erheblich variiert, ist die Fluoreszenz der beiden Reporterproteine in den einzelnen ...

Komplexe genetische Schaltkreise sind zeitaufwändig zu entwerfen, zu testen und zu optimieren. Um diesen Prozess zu erleichtern, werden Säugetierzellen so transfiziert, dass mehrere Stöchiometrien von Schaltungskomponenten in einem einzigen Well getestet werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für die experimentelle Planung, Transfektion und Datenanalyse.

Schnelle Entwicklung von Schaltkreisen zur Identifizierung von Zellzuständen mit Poly-Transfektion

Mammalian genetic circuits have demonstrated the potential to sense and treat a wide range of disease states, but optimization of the levels of circuit ...

Unser Protokoll macht es einfacher und schneller, Beziehungen zwischen biologischen Teilen zu verstehen. Wir können das Verhalten vieler ratiometrischer Kombinationen von Teilen in einer einzigen Vertiefung testen. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, die komplexen Beziehungen zwischen Schaltungskomponenten umfassender und experimenteller effizienter zu charakterisieren als herkömmliche Ansätze.Diese Methode ist für die synthetische Biologie und für alle biologischen Fragestellungen anwendbar, um Verhaltensänderungen in einer Zelle als Reaktion auf verschiedene Konzentrationen transfizierter Gene zu untersuchen, wobei der Output mittels Durchflusszytometrie gemessen werden kann. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Röhrchen für jedes DNA-Aggregat, indem Sie 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen beiseite legen, die als keine Farbkontrolle, mKO2-Kontrolle, TagBFP-Kontrolle, Neongrün-Kontrolle, alle Farbkontrolle, Poly-Transfektionsmischung eins und Poly-Transfektionsmischung zwei gekennzeichnet sind. Geben Sie 36 Mikroliter reduziertes Serummedium in die No-Color-Control-, mKO2-Control-, TagBFP-Control-, Neongrün-Control- und alle Color-Control-Röhrchen und geben Sie dann 18 Mikroliter reduziertes Serummedium zu jeder Poly-Transfektionsmischung und jeder Poly-Transfektionsmischung zu zwei Röhrchen.Als nächstes geben Sie 600 Nanogramm Füllstoffplasmid in das Farbkontrollröhrchen ohne Farbe, 300 Nanogramm mKO2 und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid in das mKO2-Farbkontrollröhrchen und geben Sie 300 Nanogramm TagBFP und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid in das TagBFP-Farbkontrollröhrchen. Fügen Sie dem neongrünen Farbkontrollröhrchen 300 Nanogramm konstitutives Neongrün und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid hinzu, dann fügen Sie 100 Nanogramm jedes mKO2, TagBFP, konstitutiven Neongrün und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid in das Vollfarbkontrollröhrchen hinzu. Fügen Sie der Polytransfektionsmischung ein Röhrchen hinzu, fügen Sie 150 Nanogramm mKO2, 75 Nanogramm Reporter-Neongrün-Plasmid und 75 Nanogramm Füllstoffplasmid hinzu.Fügen Sie der Polytransfektionsmischung zwei Röhrchen 150 Nanogramm TagBFP, 75 Nanogramm L7Ae-Plasmid und 75 Nanogramm Füllstoffplasmid hinzu. Sobald Sie fertig sind, stellen Sie die Transfektions-Mastermischung in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen her, indem Sie 216 Mikroliter reduziertes Serummedium mit 9,48 Mikrolitern Transfektionsreagenz kombinieren. Mischen Sie gut, indem Sie es auf und ab pipettieren, bevor Sie es beiseite stellen.Fügen Sie 1,58 Mikroliter Enhancer-Reagenz zu No-Color-Control-, Single-Color-Control- und allen Color-Control-Röhrchen hinzu und fügen Sie 79 Mikroliter Enhancer-Reagenz zu jedem Poly-Transfektions-Mix-Röhrchen hinzu. Mischen Sie jedes Röhrchen einzeln, indem Sie kräftig pipettieren. Geben Sie 37,58 Mikroliter Transfektions-Mastermix in die No-Color-Control-, Single-Color-Control- und All-Color-Control-Röhrchen und mischen Sie sie durch kräftiges Pipettieren.Als nächstes geben Sie 18,79 Mikroliter Transfektions-Mastermix in jedes Poly-Transfektions-Mix-Röhrchen und mischen Sie jedes Röhrchen gut mit kräftigem Pipettieren. Dosieren Sie die Transfektionsmischungen in die Vertiefungen, indem Sie 65,97 Mikroliter jeder Transfektionsmischung für die farblose, einfarbige und alle Farbkontrollen in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren, dann 32,98 Mikroliter der Polytransfektionsmischung eins in die Polytransfektionsvertiefung geben und die Komplexe effektiv verteilen, indem die Platte schnell, aber schonend in einer dichten, Bilden Sie ein Muster entlang einer ebenen Oberfläche, pipettieren Sie dann 32,98 Mikroliter der Poly-Transfektionsmischung in dieselbe Poly-Transfektionsvertiefung und schwenken Sie die Platte auf die gleiche Weise. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang.Führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um die Fluoreszenz der Transfektionsmarker auszulesen und den Reporter für jede Zelle auszugeben. Eine gut durchgeführte Co-Transfektion, die sich von der im Video gezeigten Poly-Transfektion unterscheidet, zeigt eine enge Korrelation zwischen TagBFP und EYFP, wobei Plasmide exprimiert werden, die gemeinsam abgegeben wurden. Im Gegensatz dazu zeigt eine schlecht durchgeführte Co-Transfektion eine schlechte Korrelation zwischen den beiden Plasmiden.Die gut durchgeführte Polytransfektion zeigte eine gute Abdeckung des zweidimensionalen Raums und eine gute Kompensation des spektralen Durchschlagens zwischen fluoreszierenden Proteinen. Polytransfektionsdaten mit einer geringen Anzahl lebender Zellen ließen sich nur schwer in genügend Bins mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen in jedem Bins für die Analyse unterteilen. Eine Polytransfektion mit schlechter Transfektionseffizienz führte zu einer spärlichen Abdeckung des zweidimensionalen Raums für die Analyse.Das effektive DNA-Verhältnis bei der Output-Expression wurde getestet, indem ein Repressorprotein, L7Ae mit mKO2, und ein Output-Protein, neongrün mit TagBFP, in separate Transfektionsmischungen platziert wurden. Die neongrüne Expression wurde dann in verschiedenen Konzentrationen von mKO2 und TagBFP überwacht. Die Ergebnisse der Co-Transfektion und der Poly-Transfektion wurden für diese Schaltung verglichen.Die Ergebnisse von 11 einzelnen Co-Transfektionen, die die zuvor gezeigten DNA-Teile kombinierten, wurden in einem einzigen Datensatz zusammengefasst und mit den Poly-Transfektionsdaten verglichen. Der Vergleich der Dosis-Wirkungs-Kurven von L7Ae unter Unterdrückung des Output-Reporters zeigte, dass der mediane Output-Pegel pro Bin zwischen den Co-Transfektions- und Poly-Transfektionsdaten sehr ähnlich war. Eine erfolgreiche Anwendung der Polytransfektion zur Optimierung eines Zelltypklassifikators wurde demonstriert.Die Mikro-RNA-21, die in HeLa-Zellen und Nicht-HEK-Zellen vorhanden ist, unterdrückt die Expression von BM3R1, da BM3R1 die Produktion des Schaltkreisausgangs mKO2 unterdrückt. Wenn micro RNA 21 in einer Zelle vorhanden ist, wird die mKO2-Expression aktiviert. Die Menge an Gal4-VP16 stimmt die mKO2-Expression bei niedrigen Pegeln von BM3R1 ab.Jede Schaltungskomponente wurde mit einem anderen Fluoreszenzmarker geliefert. Diese Polytransfektion quantifiziert, wie viel von jeder Schaltungskomponente jede Zelle erhalten hat. mKO2 wird in MIR21 produziert und produziert HeLa-Zellen, aber nicht in HEK-Zellen.Die mKO2-Ausgabe wurde analysiert, nachdem diese Schaltungskomponenten in separaten Transfektionsmischungen mit unterschiedlichen Fluoreszenzreportern geliefert wurden, um die Menge jeder Schaltungskomponente anzugeben, die von einer bestimmten Zelle empfangen wurde. Diese Teilprobenahme prognostizierte, dass der co-transfizierte Schaltkreis bei diesem Verhältnis eine Spezifität von 91 %, eine Sensitivität von 62 % und eine Genauigkeit von 77 % bei der Klassifizierung von HEK293 im Vergleich zu HeLa-Zellen aufwies. Der häufigste Schmerzpunkt in diesem Protokoll ist das Fehlen einer engen Korrelation innerhalb jeder Transfektionsmischung.Denken Sie also daran, die Transfektionsröhrchen direkt nach der Zugabe des Enhancer-Reagenzes kräftig zu mischen und dann vorsichtig mit dem Mischen und Pipettieren der Transfektionsröhrchen umzugehen, nachdem die lipidhaltige Transfektionsmischung hinzugefügt wurde. Die genetischen Komponenten in diesem Verfahren können durch andere genetische Komponenten ersetzt werden, um Fragen zu ihrer Funktionsfähigkeit in verschiedenen Umgebungen zu beantworten. Diese Methode hat schnell genetische Schaltkreise entwickelt, wie z.B. Zellklassifikatoren, Rückkopplungs- und Feedforward-Controller, bistabile Motive und vieles mehr.

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Forschung

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Schnelle Entwicklung von Schaltkreisen zur Identifizierung von Zellzuständen mit Poly-Transfektion

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