Name: In-vitro - und In-vivo-Evaluierung photokontrollierter biologisch aktiver Substanzen - potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Krebspharmakologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung photokontrollierter Antikrebspeptide in 2D- und 3D-Zellkulturen sowie in vivo. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung der Zytotoxizität und der Photoisomerisierungseffizienz für die Krebsforschung.

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Die Autoren würdigen die EU-Finanzierung durch das H2020-MSCA-RISE-Programm durch die Projekte PELICO (#690973) und ALISE (#101007256). Diese Arbeit wurde durch das DFG-GRK 2039 (SA, TS und ASU), das NACIP-Programm der Helmholtz-Gemeinschaft (SA und ASU) und das VIP+ des BMBF (OB und ASU) unterstützt. Wir danken Dr. Serhii Koniev vom Karlsruher Institut für Technologie, der die Verbindung LMB002 synthetisiert, gereinigt und freundlicherweise für die Studie zur Verfügung gestellt hat. Die Autoren danken auch Chupryna Maksym, die das Video in der Ukraine gedreht und zusammengestellt hat, und allen mutigen Verteidigern der Ukraine, die die experimentelle Arbeit, das Schreiben und das Filmen dieser Publikation ermöglicht haben.

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IVK, OB, SA und ASU sind Erfinder der erteilten Patentfamilie: "Peptidomimetics possessing photocontrolled biological activity" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]), lizenziert an Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS und SA sind Gründer und Gesellschafter der Lumobiotics GmbH. IVK ist wissenschaftlicher Berater, HK, TM, IP und PB sind Mitarbeiter von Enamine LLC. Die Autoren haben keine anderen relevanten Verbindungen oder finanziellen Beteiligungen an Organisationen oder Organisationen, die ein finanzielles Interesse an oder einen finanziellen Konflikt mit dem in der Veröffentlichung behandelten Thema oder den in der Veröffentlichung behandelten Materialien haben, abgesehen von den offengelegten.

Photokontrollierte Verbindungen sind beispiellos in der Arzneimittelentwicklung; Es wurden jedoch keine Methoden für deren präklinische und klinische Bewertung etabliert. Das nächste Monotherapie-Analogon, die photodynamische Therapie (PDT), ist die Behandlungsmodalität für den klinischen Einsatz, die von vielen Ländern gegen Krebs eingesetzt wird und sich in der Entwicklung für andere Indikationen befindet19,20. Ähnlich wie bei der Photopharmakologie basiert auch die PDT auf der Verwendung von Licht zur Aktivierung der bioaktiven Substanz (Singulettsauerstoff). Daher können einige experimentelle Methoden, die für präklinische und klinische Studien in der PDT verwendet werden, für die Photopharmakologie übernommen werden. So sind beispielsweise Lichtquellen, Lichtverabreichungsansätze und Medizinprodukte für die PDT gut entwickelt und zugelassen. Sie können direkt für die Bewertung von photokontrollierten Medikamenten verwendet werden. PDT und Photopharmakologie unterscheiden sich jedoch stark voneinander4, was die Notwendigkeit rechtfertigt, spezifische Methoden für letztere zu etablieren.
Erstens ist die nicht aktivierte Substanz in PDT (Sauerstoff) in lebenden Geweben immer in ungiftigen Konzentrationen vorhanden. Im Gegensatz dazu können nicht aktivierte photokontrollierte biologisch aktive Verbindungen eine Restaktivität und unerwünschte Toxizität aufweisen. Daher sollten ideale photopharmakologische Arzneimittel in ihrer verabreichten Form eine minimierte biologische Aktivität aufweisen und in ihrer lichterzeugten Form hochaktiv sein, das "phototherapeutische Fenster"21 muss so groß wie möglich sein. Die Suche nach dem Hit und die Durchführung der Hit-to-Lead-Optimierung erfordern die Identifizierung geeigneter Verbindungen und das Screening relativ großer Bibliotheken bereits in frühen Stadien der Arzneimittelentwicklung. Hier schlugen wir eine automatisierte konfokale Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie vor, um effiziente photoschaltende Verbindungen zu identifizieren.
Die gewählte Methode zur Bewertung der Zytotoxizität ermöglicht eine einfache Umsetzung der wichtigsten Anforderung - der Aufrechterhaltung des PSS oder der Stabilität des sichtbar-lichtempfindlichen Photoisomers. Dies liegt daran, dass bei der Implementierung die Lichteinwirkung minimiert wird. Daher sollten bei der Auswahl alternativer Methoden automatisierte Methoden bevorzugt werden. Dieser Ansatz ist zuverlässig und informativ. Die Verwendung von 3D-Zellkulturen (Sphäroide) in diesem Stadium ermöglicht ein ganzheitliches Verständnis der Reaktion der Zelle auf die Behandlung in einer realistischeren gewebeähnlichen Mikroumgebung. Darüber hinaus können mit der Mikroskopie als direkte Methode wertvolle Einblicke in den Wirkmechanismus der Verbindungen gewonnen werden. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit geeignetem Färbeprotokoll ermöglicht die visuelle Beurteilung der Morphologie der Zellen und Sphäroide. Auch wichtige Details zum Zelltod und Veränderungen im Inneren der Zellen können detektiert werden.
Zweitens erfordert eine leichte Anwendung eine sorgfältige Auswahl der Lichtdosierung. Bei der PDT ist eine leichte Überdosierung extrem schädlich für das Gewebe22. Eine photopharmakologische Therapie kann bei übermäßiger Lichtbestrahlung vorteilhaft sein. Die Obergrenze der aktivierten Substanz wird durch die verabreichte Dosis der nicht aktivierten Substanz und deren Pharmakokinetik definiert. Die Lichtdosierung ist jedoch immer noch ein Problem in der Photopharmakologie. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Bestrahlungsleistungsdichte und die Einwirkzeit nicht geringer sind als die Anforderung an die Therapie. Prinzipiell kann die Bildung der aktivierten Substanz in vivo überwacht werden. Aus bioethischen Gründen schlugen wir jedoch ein Experiment mit einem Modellgewebe (frisches Hackfleisch) vor, das mit der nicht aktivierten Verbindung15 gemischt wurde. Dieses Experiment ist einfach und kann modifiziert werden, um verschiedene Lichtquellen zu verwenden. Es kann auch für die photophysikalische Abschätzung der Lichtdosis und die Messung thermischer Einflüsse angepasst werden. Auch hier ist es durch die Verwendung von Modellgeweben möglich, die Lichtexposition zu minimieren, z. B. im Vergleich zur genaueren Bestimmung der Photoschalteffizienz unter den In-vivo-Bedingungen , eine Alternative, die immer interessant sein kann.
Schließlich können die Verbindungen, die in den In-vitro-Toxizitätsscreens überlegene Eigenschaften aufweisen und mindestens 1-1,5 cm tief im Modellgewebe effizient photoschalten, für kostspielige, mühsame und langwierige In-vivo-Studien ausgewählt werden. In diesem Protokoll haben wir die gleiche Zelllinie (LLC) wie in der In-vitro-Bewertung verwendet, um das Allotransplantat-Krebsmodell zu generieren. Die Tumorwachstumsdynamik, die Mortalität und die Anzahl der Metastasen sind die Parameter, die am besten geeignet sind, um die Wirksamkeit gegen Krebs zu beurteilen. Im Vergleich zur konventionellen Chemotherapie wird bei der photopharmakologischen Behandlung ein zusätzlicher Faktor eingesetzt - das Licht. Daher werden zwei Kontrolltiergruppen benötigt: eine, die nur das Fahrzeug erhält, und die andere, die das Fahrzeug und die Bestrahlung erhält. Dieser Aufbau ermöglicht die Bewertung des Einflusses von Licht auf die gemessenen Parameter. In unserem Experiment erhielten die Tiere der beiden Versuchsgruppen die nicht aktivierte Verbindung, und die Tumore der Mäuse in einer Gruppe wurden bestrahlt. Das Bestrahlungsregime war für die Kontroll- und Behandlungsgruppe identisch. Ein Vergleich mit einer Benchmark-Chemotherapie ist zum jetzigen Zeitpunkt nicht erforderlich, da der Hauptzweck des Experiments darin besteht, die kombinierte Wirkung von Licht- und Wirkstoffanwendung zu demonstrieren. Die leistungsstärksten Verbindungen, die diesen Effekt aufweisen, können dann für weitere Studien auf ihre In-vivo-Toxizität und den Vergleich mit Benchmarks ausgewählt werden, um wichtige Entscheidungen über ihre Entwicklung zu treffen. Technisch kann das von uns beschriebene In-vivo-Experiment leicht an pharmakokinetische oder pharmakodynamische Studien angepasst werden, z. B. an einer Verbindung, die bereits als Leitstoff ausgewählt ist.

Photokontrollierte biologisch aktive Verbindungen haben sich in den letzten Jahrzehnten als vielversprechender Bestandteil sicherer Chemotherapien für menschliche Krankheiten und zur gezielten Eradikation bösartiger solider Tumore herausgestellt1. Diese Verbindungen enthalten reversibel photoisomerisierbare Fragmente (molekulare Photoschalter) und können bei Bestrahlung mit Licht unterschiedlicher Wellenlängen zwischen inaktiven und aktiven Photoisomeren umschalten.
Im Vergleich zu ihren nicht photokontrollierbaren Analoga können photogesteuerte Medikamente sicherer sein, da sie in weniger aktiver und im Wesentlichen ungiftiger Form systemisch in den Körper des Patienten eingeführt werden können und dann nur bei Bedarf durch Licht aktiviert werden, z. B. bei Tumoren, Geschwüren und Wunden. Obwohl in neueren wissenschaftlichen Arbeiten 2,3,4,5,6,7 mehrere spannende Demonstrationen solcher molekularen Wirkstoffprototypen zu finden sind, existiert das Gebiet der klinischen Photopharmakologie - eine Anwendung von zugelassenen Kombinationen aus Arzneimitteln/Medizinprodukten/Krankheiten - nicht. Die Photopharmakologie befindet sich noch in der Phase der Wirkstoffforschung, und systematische präklinische Studien sind nicht bekannt.
Erst kürzlich konnten wir den in vivo Sicherheitsvorteil für einige photokontrollierte Antikrebspeptide nachweisen, nämlich die Analoga des Peptidantibiotikums Gramicidin S8. Diese photokontrollierten Derivate enthalten einen Diarylethen-Photoschalter (DAE), der reversible photoinduzierte Transformationen zwischen den sogenannten rotlichterzeugten "ringoffenen" und UV-erzeugten "ringgeschlossenen" Photoformen durchläuft (dargestellt in Abbildung 1 für eines der Derivate, Verbindung LMB002).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig01.jpg"> Abbildung 1: Photokontrolliertes zytotoxisches Peptid LMB002 und seine Photoisomerisierung. Das Diarylethen-Fragment ist rot dargestellt. Abkürzung: DAE = Diarylethen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Das Auffinden von Treffern und die Durchführung einer Hit-to-Lead-Optimierung erfordern häufig ein In-vitro- und In-vivo-Screening geeigneter Substanzbibliotheken 9,10. Hier demonstrieren wir eine Methodik, die für das systematische Hochdurchsatz-Screening der Zytotoxizität photokontrollierter Verbindungen geeignet ist. Wir bestimmen auch die Photoisomerisierungseffizienz, schätzen die Lichtdosis in Modellgeweben ab und bewerten die In-vivo-Wirksamkeit der leistungsstärksten Kandidaten. Der Ansatz steht im Einklang mit bioethischen und tierpflegerischen Überlegungen.
In dieser Arbeit werden traditionelle präklinische Methoden modifiziert, um die unkontrollierte Photoisomerisierung der getesteten Substanzen zu vermeiden. Das übergeordnete Ziel der Anwendung dieser modifizierten Methoden besteht darin, eine allgemeine Strategie zu entwickeln, die unkompliziert und schnell ist und statistisch signifikante Daten liefert, um In-vitro-Aktivitäten zuverlässig zu vergleichen und die In-vivo-Wirksamkeitstests von photoschaltbaren Verbindungen für die Identifizierung und Weiterentwicklung von Leitstrukturen zu rationalisieren.
Die Strategie besteht aus drei aufeinander aufbauenden Schritten. Der erste Schritt umfasst die Bestimmung von IC 50 (apparent50 % cell viability) in seriellen Verdünnungen für die aktiven und inaktiven Photoformen ausgewählter photokontrollierter biologisch aktiver Verbindungen unter Verwendung von zweidimensionalen (2D, Monolayer) und dreidimensionalen (3D, sphäroid) Zellkulturen und konfokaler automatisierter Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie. Phototherapeutische Fenster werden in Bezug auf die IC50-Differenz zwischen den beiden Photoformen verglichen und die leistungsstärksten Kandidaten ausgewählt. Es gibt keinen spezifischen Vorteil bei der Toxizitätsbewertung durch automatisierte Mikroskopie und andere Zytotoxizitäts-Screening-Plattformen (Assays)11; Komplexere zellbasierte Tumormodelle12 könnten in diesem Stadium leicht implementiert werden.
Für die in Schritt 1 ausgewählten Verbindungen besteht der zweite Schritt darin, ihre Photoschalteffizienz innerhalb des Gewebes in Abhängigkeit von der Tiefe von der bestrahlten Gewebeoberfläche aus realistisch abzuschätzen, indem die Photoschalteffizienz der weniger aktiven Photoformen in einem Gewebesurrogat mittels UV-detektierter Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) von bestrahlten Probenextrakten quantifiziert wird. In vivo konnte die Effizienz der Photoschaltung untersucht werden, aber wir schlagen vor, ein einfaches Gewebesurrogat zu verwenden - Schweinehackfleisch. Wir haben die Validität dieses Ansatzes getestet. Wir haben die Umwandlung unserer photoschaltbaren Verbindungen in vivo an einem Krebsmodell einer Maus gemessen und ungefähr die gleiche Photokonversion in einer Tiefe beobachtet, die in früheren Experimenten mit Mäusen8 gemessen wurde. Jedes geeignete alternative künstliche Gewebe13, 3D-biogedrucktes Gewebe/Organ14, Biopsiematerialien oder ein anderes ausgenommenes tierisches Material könnte verwendet werden. Dieses Setup ist jedoch ein guter Kompromiss, da es wirtschaftlich, schnell und ethisch vertretbar ist.
Der dritte Schritt ist die Bestimmung der in vivo Krebswirksamkeit in einem murinen Krebsmodell. Für dieses Experiment werden die Verbindungen ausgewählt, die in den In-vitro-Experimenten überlegene Eigenschaften aufweisen und in einer Tiefe von mindestens 1-1,5 cm in den Modellgeweben effizient photoschalten.
Dieses Protokoll kann auf Verbindungen angewendet werden, die verschiedene Arten von Photoschaltern besitzen, vorausgesetzt, ihre Photoformen (oder ihre photostationären Zustände, PSS) sind für eine angemessene Zeit (einige Tage oder länger) stabil. Zur Veranschaulichung wird ein zuvor beschriebener DAE-abgeleiteter LMB00215 verwendet. Die LMB002-Fotoformen sind thermisch stabil und können bei −20 °C mindestens ein Jahr lang gelagert werden, ohne dass es zu einer wesentlichen Verschlechterung kommt. Lewis-Lungenkarzinom-Zellen (LLC) werden für diese In-vitro- und In-vivo-Demonstration ausgewählt, wobei dem Zelltyp keine Einschränkungen auferlegt werden. LLC-Zellen sind adhärent, leicht in 3D kultivierbar und werden zur Erzeugung von Tumoroiden verwendet (wie in Referenz16 beschrieben). Im lebenden Organismus LLC-Zellen werden zur Modellierung von Metastasierungsprozessen verwendet und können nach subkutaner Injektion leicht solide Tumore in immunkompetenten Mäusen erzeugen. Diese In-vivo-Methodik kann universell auf andere Krebsmodelle angewendet werden17,18. Die detaillierte Umsetzung dieser Strategie wird im Folgenden beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Agilent 1100 Serie Kapillar-LC-System</td><td>ALSI-Chrom (Agilent Distributor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis-Lungenkarzinom-Zelllinie</td><td>ECACC</td><td>90020104</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6NCrl Mäuse, weiblich, Inzucht</td><td>Charles River</td><td>Stammcode: 027</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture, CO2 Inkubator</td><td>Esco Micro</td><td>CCL-170B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basalmembran-Matrix</td><td>Merck</td><td>CLS354234</td><td></td></tr><tr><td>Corning, 384-Well-Sphäroide-Mikrotiterplatten</td><td>Merck</td><td>CLS3830</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Merck</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600044</td><td></td></tr><tr><td>Gramicidin S</td><td>Lumobiotika</td><td></td><td>Kundenspezifische Synthese</td></tr><tr><td>HyClone, DMEM/hoher Glukosegehalt</td><td>Cytiva</td><td>SH30003.04</td><td></td></tr><tr><td>IN Cell Analyzer 6500HS, Bildgebungssystem</td><td>Cytiva</td><td>29240358</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran Anästhesiegerät</td><td>ASA</td><td>S/N ASA 1305</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, 200 mM Lösung</td><td>Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LIKA-Chirurg, Laser</td> <td>für DiodenchirurgieFotonika</td><td></td> plus-LMB002 <td></td></tr><tr><td></td><td>Lumobiotika</td><td></td><td>Kundenspezifische Synthese</td></tr><tr><td>Penicillin&ndash; Streptomycin, lösungsstabilisiert</td><td>Merck</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate, 96-Well-Platten</td><td>PerkinElmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>Photometer PCE-LED 20</td><td>PCE Instruments</td><td>PCE-LED 20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, Propidiumiodid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J66764-MC</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau, 0,4%ige Lösung</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&ndash; EDTA, 10 x Lösung</td><td>Merck</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz Zellkulturflaschen mit belüfteten Verschlüssen, 75 cm2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200263</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz, Filter mit Flaschenaufsatz, PES, 0,22 &mu; m</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360882</td><td></td></tr><tr><td>Vydac 218TP, C18 HPLC-Säule (4,6 mm & mal 250 mm, 5 & Mikro; m)</td><td>Altmann Analytik (Avantor Distributor)</td><td>GR5103827</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro - und in-vivo-evaluierung photokontrollierter biologisch aktiver substanzen - potenzielle wirkstoffkandidaten für die krebspharmakologie

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

Photokontrollierte, biologisch aktive Verbindungen sind eine aufstrebende Klasse von "intelligenten" Wirkstoffkandidaten. Zusätzliche Sicherheit in der systemischen Chemotherapie bieten sie durch ihre präzise raumzeitliche Aktivierung, indem sie ein gutartiges, nicht ionisierbares Licht auf eine bestimmte Stelle im Körper des Patienten lenken. In dieser Arbeit wird eine Reihe von Methoden vorgestellt, um die in vitro Potenz und ex vivo Effizienz der Photoaktivierung von photokontrollierten, biologisch aktiven Verbindungen sowie die in vivo Wirksamkeit in frühen Stadien der Arzneimittelentwicklung zu bewerten. Die Methodik wird auf zytotoxische Peptide gegen Krebs angewendet, nämlich auf die Diarylethen-haltigen Analoga eines bekannten Antibiotikums, Gramicidin S. Die Experimente werden mit 2D- (adhärente Zellen) und 3D-Zellkulturen (Sphäroide) einer Krebszelllinie (Lewis-Lungenkarzinom, LLC), Lebendgewebe-Surrogate (Schweinefleischhack) und einem Allotransplantat-Krebsmodell (subkutane LLC) in immunkompetenten Mäusen durchgeführt. Die Auswahl der wirksamsten Verbindungen und die Abschätzung realistischer phototherapeutischer Fenster erfolgen mittels automatisierter Fluoreszenzmikroskopie. Die Photoaktivierungseffizienz bei unterschiedlichen Beleuchtungsregimen wird in unterschiedlichen Tiefen in einem Modellgewebe bestimmt, und die optimale Lichtdosis wird im abschließenden therapeutischen In-vivo-Experiment angewendet.

In dieser Arbeit wurden 2D- und 3D-Zellexperimente durchgeführt, um den IC50 für "ringgeschlossene" und "ringoffene" Formen von LMB002 (siehe Abbildung 1) zu unterschiedlichen Inkubationszeiten zu bestimmen. Diese Werte wurden mit denen verglichen, die für das prototypische Peptid Gramicidin S (als Positivkontrolle verwendet) ermittelt wurden. Ein typischer Satz von Bildern der Inkubation in 2D-gezüchteter LLC-Kultur nach der Färbung ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Co-Färbung mit Hoechst 33342 (blau) und Propidiumiodid (rot), die bei der Behandlung mit "ringoffener" Form im Vergleich zu "ringgeschlossenen" Formen zu unterschiedlichen violetten Farbtönen bei einem größeren Anteil der Zellen führt, deutet auf einen deutlichen Unterschied in der Zytotoxizität zwischen zwei Formen hin, der leicht quantifiziert werden kann. Das demonstrierte Beispiel eines erfolgreichen Experiments basiert auf den Daten, die mit dem 96-Well-Plattenformat gesammelt wurden, bei dem die Peptidvarianten in unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt wurden, wie in Abbildung 2 dargestellt. Ähnliche Daten können mit 384-Well- und High-Density-Platten erfasst werden. Da jedoch die Volumina pro Bohrung reduziert werden, nehmen technische und systematische Fehler und damit die Genauigkeit der IC50-Bestimmung mit zunehmender Bohrlochdichte ab.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Bilder des Zytotoxizitätstests in der einlagig gewachsenen LLC. Die Zellen wurden mit Hoechst 33342 (blau) und Propidiumiodid (rot) gefärbt. Die angegebenen Zeiten: 10 min, 60 min, 24 h und 72 h sind Inkubationszeiten mit Verbindungen. Maßstabsbalken = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Die Photokonversion von LMB002 durch Laserbestrahlung in einem Modellgewebe - frischem Schweinehackfleisch - wurde anhand einer Probe bestimmt, die aus Hackfleisch gemischt mit LMB002 "ring-geschlossene" (inaktive) Form, die in PBS gelöst war, vermischt war, und die Messung der Umwandlung dieser inaktiven Form in die LMB002 "ring-offene" (aktivierte) Form in Richtung der Strahlenausbreitung. Die Probe wurde in eine Spritze gegeben und von einer Seite mit einem flachen Laserstrahl für die Belichtungszeit von ~10 min (normalerweise in In-vivo-Experimenten verwendet) bestrahlt, wie in Abbildung 3 gezeigt. Nach der Belichtung wurde der Probenzylinder durch Drücken des Spritzenkolbens und Schneiden der gleich hohen Scheiben mit einem Skalpell in Teile geteilt. Die Konzentration von LMB002 "ringoffen" in den Extrakten aus den Schichten wurde mittels RP-HPLC bestimmt.
Abbildung 6 zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurven Abbildung 6A-D, die aus der Datenanalyse gewonnen wurden. Um den Prozentsatz der toten Zellen mit nukleärer Co-Färbung von Hoechst 33342 und PI-Farbstoffen zu identifizieren, haben wir ein integriertes Klassifikatorwerkzeug verwendet, das numerische Schwellenwerte für ausgewählte Messparameter festlegt, um alle Zellzahlen in mehrere Kategorien aufzuteilen. Wenn beispielsweise das Signal des roten Kanals (Propidiumiodid) in der Kontrolle den Schwellenwert (ca. 110-130 Einheiten) erreichte, konnten die Zellen als PI-positiv klassifiziert werden, d. h. als tot betrachtet, oder als PI-negativ, d. h. als von den Verbindungen nicht beeinflusst. Für LMB002 sind sigmoidale Abhängigkeiten des Prozentsatzes von Propidiumiodid-positiven Zellen von der Substanzkonzentration zu sehen. Aus diesen Daten können die IC50 Werte ermittelt werden.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig06.jpg"> Abbildung 6: Analyse der Zytotoxizität in 2D-Kultur. Sigmoid-Anpassungen, wie sie in der LLC-Kultur für (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 h und (D) 72 h-Zeitintervalle für die Inkubation mit Verbindungen erhalten wurden. Die Anpassung ermöglicht die genaue Bestimmung von IC50-Werten (nicht abgebildet). Fehlerbalken sind SEM. Abkürzungen: LLC = Lewis-Lungenkarzinom; PI = Propidiumiodid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Unter Berücksichtigung der erhaltenen IC50-Werte können wir schlussfolgern, dass die Toxizität aller drei Verbindungen mit der Inkubationszeit zunahm. Unser Experiment zeigte, dass die "ringoffene" Form von LMB002 etwa einen Verdünnungsschritt weniger toxisch ist als der Prototyp des Peptids Gramicidin S. Während die "ringgeschlossene" Form eine um drei bis vier Verdünnungsschritte geringere Toxizität aufweist, die mit der Inkubationszeit zunimmt. Die Differenz zwischen den beiden Verdünnungsschritten wird durch die Verlängerung der Inkubationszeit nicht beeinflusst und kann numerisch als experimentell bestimmtes phototherapeutisches Fenster6 zum Vergleich mit anderen Verbindungen in einem potentiellen Bibliotheksscreening verwendet werden. Der IC50-Wert für Gramicidin S wurde als Referenzpunkt festgelegt, um experimentelle Fehler oder differentielle Ergebnisse in biologischen Replikaten zu korrigieren.
Die 3D-Zellexperimente lieferten die gleiche Art von Rohdaten - die einzelzellaufgelösten Eins-pro-Well-Sphäroidbilder. Die Zugabe von Calcein als drittem Färbefarbstoff ermöglicht die Quantifizierung des Anteils metabolisch aktiver Zellen (beobachtet im grünen Kanal). Durch die Verwendung von 384-Well-Platten, die Erhöhung der Anzahl der technischen Replikate, den Ausschluss redundanter Co-Inkubationszeitpunkte und die Änderung der Verdünnungsfalte konnten wir mehrere Verbindungen in einem einzigen Testlauf (unter Verwendung einer einzelnen Platte) direkt vergleichen, wie in der Plattenkarte in Abbildung 7 dargestellt.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig07.jpg"> Abbildung 7: Plattenkarte für das 3D-Kulturexperiment mit zwei Verbindungen. Farbcodes für die Mischungen und die Kontrolle sind angegeben. Zahlen in Wells sind Konzentrationen in μM. 10 min, 24 h und 72 h sind Inkubationszeiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Abbildung 8 zeigt die Bilder ausgewählter technischer Replikate von LLC-Sphäroiden, die mit einer Dichte von 1 Sphäroide/Vertiefung in Gegenwart von getesteten Verbindungen und Kontrollsphäroiden gezüchtet wurden, die nach der Färbung aufgenommen wurden.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig08.jpg"> Abbildung 8: Repräsentative Bilder aus dem 3D-Kultur-Zytotoxizitätsassay. Die Bilder zeigen 48 h alte LLC-Sphäroide, die mit Hoechst 33342 (blau), Calcein AM (grün) und Propidiumiodid (rot) gefärbt wurden, nach 10 min, 24 h und 72 h Co-Inkubation mit LMB002-Photoformen und Gramicidin S. Maßstabsbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Mit Hilfe der Gerätesoftware wurden die Dosis-Wirkungs-Kurven, wie im 2D-Experiment, aus den z-gestapelten Bildstapeln gewonnen (Abbildung 9A). Darüber hinaus konnten kompakte und undeformierte Sphäroide in den 3D-Kulturen durch den gesamten Sphäroiddurchmesser charakterisiert werden (Abbildung 9B). Es wurde auch festgestellt, dass der Gesamtdurchmesser des Sphäroids mit der Verbindungskonzentration variiert.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig09.jpg"> Abbildung 9: Bewertung der Zytotoxizität mit 3D-Kulturen. (A) Konzentrationsabhängige Zytotoxizitätsanpassungskurven und (B) konzentrationsabhängige Sphäroid-Durchmesserdiagramme, die in den 3D-Kulturen von LLC erhalten wurden, die mit Gramicidin S für 10 min, 24 h und 72 h co-inkubiert und vor der Färbung erfasst wurden. Fehlerbalken sind SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Das Experiment für Schritt 2 ermöglicht die Bestimmung der LMB002-Konzentrationen in beiden Photoformen mittels UV-detektierter Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Die Effizienz der Photokonversion in Modellgeweben konnte mit diesem Aufbau leicht bewertet und quantifiziert werden (Abbildung 3). Die Daten wurden aus der quantitativen Analyse der Chromatogramme der Probenextrakte gewonnen. In diesen Testexperimenten wurden LMB002-Chromatogramme spektroskopisch bei 270 nm und 570 nm detektiert. Bei 270 nm wurden viele zusätzliche Signale beobachtet und den Verbindungen zugeschrieben, die aus dem Modellgewebe co-extrahiert wurden (verifiziert durch den Kontrollextrakt ohne die Verbindung). Beide Fotoformen unterschieden sich hinreichend in Retentionszeiten und Resorption. Das "Ring-Open"-Signal LMB002 war jedoch von diesen Hintergrundsignalen getrennt (siehe ein repräsentatives Chromatogramm in Abbildung 10A). Daher kann dieses Signal problemlos integriert werden. Bei 570 nm enthielten die Chromatogramme nur das "ringgeschlossene" Formsignal LMB002 (Abbildung 10B). Hier haben wir die Konzentrationsbestimmung mittels RP HPLC durchgeführt. Dennoch konnten mit LC/MS als Analysemethode noch höhere Genauigkeit und niedrigere Nachweisgrenzen erreicht werden.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig10.jpg"> Abbildung 10: Repräsentative Chromatogramme von LMB002, extrahiert aus Modellgeweben. (A) Probe in einem Abstand von 2 mm von der bestrahlten Oberfläche, aufgezeichnet bei 270 nm (LMB002 "ringoffene" Form ist integriert); (B) Probe in einem Abstand von 38 mm von der bestrahlten Oberfläche, aufgezeichnet bei 570 nm (der Peak von LMB002 "ringgeschlossen" ist integriert). Die angegebenen Werte für die Retentionszeit bestätigten zusätzlich die Identität der Verbindung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Die Daten, die nach der Integration der entsprechenden Signale aller gesammelten Proben gewonnen wurden, wurden verwendet, um die Konzentrations-Tiefen-Diagramme zu erstellen, wie in Abbildung 11 dargestellt. Anhand dieser Diagramme konnte die Effizienz der Photokonversion in verschiedenen Tiefen des Modellgewebes leicht bewertet werden. Es bestätigt, dass unsere Rotlichtquelle die "ringgeschlossene" LMB002-Photokonversion in einer Tiefe von bis zu 1 c im Gewebesurrogat Hackfleisch (bei ca. 103 mW/cm2) induziert.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig11.jpg"> Abbildung 11: Bewertung der Photokonversionseffizienz. Konzentration (A, mg/kg) von LMB002 "ringgeschlossene" (nicht aktivierte, blaue Punkte) und "ringoffene" Formen (aktiviert, orangefarbene Punkte) in unterschiedlichen Abständen von der bestrahlten Oberfläche des Modellgewebes (L, mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig11large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Die Ergebnisse des In-vivo-Experiments - Schritt 3 unserer Methodik, der nach dem in Abbildung 4 dargestellten Zeitplan durchgeführt wurde - wurden durch Diagramme dargestellt, die das Tumorwachstum in Abhängigkeit von der Zeit (Abbildung 12) und Kaplan-Meier-Überlebenskurven (Abbildung 13) zeigten.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig12.jpg"> Abbildung 12: Tumorwachstumsdynamik bei Tieren. Tiere, die mit LMB002 behandelt wurden, verglichen mit den mit Vehikel behandelten Tieren (subkutanes LLC-Allotransplantatmodell in C57BL/6NCrl-Mäusen, zusammengesetzte Dosis 7 mg/kg, i.v., 2 h 40 min Inkubation, dann Bestrahlung bei 650 nm, 100 mW/cm 2,20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig12large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig13.jpg"> Abbildung 13: Sterblichkeitskurven für Tiere. Tiere, die mit LMB002 behandelt wurden, verglichen mit den mit Vehikel behandelten Tieren (subkutanes LLC-Allotransplantatmodell in C57BL/6NCrl-Mäusen, zusammengesetzte Dosis 7 mg/kg, i.v., 2 h 40 min Inkubation, dann Bestrahlung bei 650 nm, 100 mW/cm 2,20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig13large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Dieses Protokoll stellt eine Reihe von Experimenten vor, die für die Evaluierung von photoschaltbaren Antikrebspeptiden verwendet wurden, die für das präklinische Screening solcher Verbindungen verwendet werden können. Dazu gehören die Bewertung der Zytotoxizität in 2D- und 3D-Zellkulturen, die Bewertung der Ex-vivo-Photoisomerisierungseffizienz (Modellgewebe) und der In-vivo-Wirksamkeit.

In-vitro - und In-vivo-Evaluierung photokontrollierter biologisch aktiver Substanzen - potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Krebspharmakologie

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic ...

Photokontrollierte, biologisch aktive Verbindungen enthalten reversibel photoisomerisierbare Fragmente, Photoschalter in ihren Molekülen. Verbindungen sind zyklische Peptide, die durch ein Diarylethen-Fragment modifiziert werden, das reversible, lichtinduzierte elektrozyklische Transformationen durchläuft. Sie können photoschalten, d.h. zwischen einer UV-erzeugten, biologisch inaktiven Form und einer durch rotes Licht erzeugten, biologisch aktiven Form umschalten.Es wird angenommen, dass photoschaltbare Medikamente sicherer sind als nicht photoschaltbare Medikamente. Das liegt daran, dass man dem menschlichen Körper eine ungiftige, deaktivierte Form verabreichen und sie nur dort lokal mit Licht aktivieren kann, wo man es braucht, also zum Beispiel bei Tumoren, Schnecken oder Wunden. Es gibt keine Standardmethoden oder -protokolle für die präklinische oder klinische Entwicklung solcher photopharmakologischen Medikamente, daher möchten wir Ihnen hier Experimente zeigen, die für diese frühe präklinische Forschung verwendet werden können.Kateryna Horbatok und Tetiana Makhnii werden die Verfahren demonstrieren. Die Tierpflege- und Versuchsverfahren wurden von der Bioethikkommission der Firma Bienta genehmigt. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Puffer mithilfe von Standardverfahren.Alternativ können Sie auch handelsübliche Lösungen verwenden. Bereiten Sie Stammlösungen von Verbindungen vor. Wiegen Sie für jede Verbindung zwei Chargen à 5,12 Milligramm der Masse in der ringgeschlossenen Fotoform in zwei 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen, eine mit klarer und eine mit schwarzen, undurchsichtigen Wänden.Wiegen Sie als Positivkontrolle 2,28 Milligramm des nicht photokontrollierten Mutterpeptids in einem zusätzlichen Röhrchen. Fügen Sie jeder Probe 100 Mikroliter reines DMSO hinzu und wirbeln Sie 30 Sekunden lang. Photoisomerisieren Sie die Stammlösung in der durchsichtigen Röhre, indem Sie die Lösung mit einem 650-Nanometer-Laser bestrahlen, Lichtleistungsdichte 6 Watt pro Quadratzentimeter, mit Wirbeln, um das Mischen zu gewährleisten.Fahren Sie fort, bis die Farbe von dunkelviolett zu hellbraun wechselt. Mit Alufolie vor Licht schützen. Säen Sie 5.000 bis 10.000 Zellen pro Well.Wir verwendeten ca. 8.000 Lewis-Lungenkarzinomzellen in 200 Mikrolitern DMEM in den zentralen 60 Wells einer 96-Well-sterilen Platte mit klarem Boden und schwarzen, undurchsichtigen Wänden. Füllen Sie die restlichen 36 Vertiefungen mit reinem DMEM. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer 5%igen CO2-Atmosphäre.Bereiten Sie am nächsten Tag serielle Verdünnungen von Verbindungen und die Positivkontrolle in autoklavierten Polypropylen-Klarsichtplatten vor. Beginnen Sie mit den Vorräten in DMSO und verdünnen Sie sie mit DMEM, aber überschreiten Sie nicht 1 % Volumen-DMSO in der höchsten Endkonzentration. Um eine unkontrollierte Photoisomerisierung der untersuchten Verbindungen zu verhindern, schalten Sie das Licht im Sterilschrank aus.100 Mikroliter der Verdünnungen werden in 56 Vertiefungen mit 100 Mikrolitern zuvor zugesetztem DMEM überführt, um die erforderliche Endkonzentration der Verbindungen in den Vertiefungen zu erreichen, typischerweise im Bereich von fünf bis 150 Mikromolaren. Als nächstes werden 100 Mikroliter DMEM in vier Vertiefungen gegeben, die als Negativkontrolle dienen. Decken Sie die Platten mit Alufolie oder einer undurchsichtigen Kunststoffabdeckung ab, um ein unkontrolliertes Umschalten zu verhindern.Legen Sie die Platten für die gewählte Inkubationszeit bei 37 Grad Celsius in einen Zellkultur-Inkubator. Geben Sie nach der Inkubation 50 Mikroliter Färbelösung pro Vertiefung auf die Platten. Verwenden Sie für dieses Experiment fünf Mikromolare Hoechst 33342 und Ein-Mikromolare Propidiumiodid als endgültige Färbelösungen.Erneut bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren. Führen Sie eine automatisierte Fluoreszenzbildgebung mit einer Objektivlinse mit 20-facher Vergrößerung durch. Die Laborabläufe für diesen Teil der Methode sind identisch mit denen, die für das 2D-Experiment beschrieben werden: Vorbereitung der Zellkultur, Inkubation mit den getesteten Verbindungen und Bildgebung.In diesem Fall werden die Zellen jedoch als kompakte, reife Sphäroide in einer 384-Well-U-Bodenplatte mit extrem geringer Adhäsion und schwarzen, undurchsichtigen Wänden hergestellt. Die Verwendung einer Platte dieser Größe ermöglicht es, zwei Verbindungen in einem Experiment zu vergleichen. In diesem Experiment haben wir zusätzlich Calcein AM als dritte Komponente der Multicolor-Färbelösung verwendet.Die Bilder der 2D- und 3D-Experimente werden mit der automatisierten Bildanalysesoftware des Instruments analysiert. Zellen, die mit Hoechst- und Propidiumiodid-Farbstoffen kogefärbt wurden, gelten als nekrotisch tot, und ihr Anteil in Abhängigkeit von der Konzentration wird zur Berechnung des IC50-Wertes verwendet. Montieren Sie den optischen Zug für die Probenbestrahlung.Es besteht aus einem optischen Kabel von der Laserlichtquelle, einer Linse mit variabler Brennweite, einer Spritze mit undurchsichtigem Deckel und einem flach geschnittenen Ende. Alle nachfolgenden Arbeiten müssen in einem abgedunkelten Raum mit minimaler Arbeitsplatzbeleuchtung durchgeführt werden. Bereiten Sie eine Modellgewebeprobe vor, die mit den inaktiven photoformalen Verbindungen beladen ist.In einem typischen Durchlauf werden fünf Gramm frisches Schweinehackfleisch mechanisch mit der PBS-Lösung der Verbindung vermischt, um die Endkonzentration von 50 Milligramm pro Kilogramm zu erreichen. Füllen Sie die Spritze mit der geladenen Probe. Bestrahlen Sie die Probe im optischen Zug für die erforderliche Belichtungs- und Lichtdosiszeit.Machen Sie nach der Belichtung vier Millimeter dicke Scheiben der Probe, indem Sie die Masse mit dem Kolben von der Spritze drücken und mit einem Skalpell schneiden. Wiegen und extrahieren Sie die Verbindung mit einem Gemisch aus Acetonitril, Wasser, TFA, 70 % Acetonitril und 01 % Trifluoressigsäure in einem 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen. Bei 20XG zweimal 30 Minuten lang zentrifugieren, um das unlösliche Material zu entfernen und den Überstand aufzufangen.Zeichnen Sie UV-detektierte Chromatogramme mit einer 570-Nanometer-Detektion ihrer geschlossenen Form und einer 270-Nanometer-Detektion der ringoffenen Form auf. Verwenden Sie die unbestrahlten und bestrahlten Kontrollproben, die ähnlich wie die Stammlösungen in den Zellexperimenten hergestellt wurden, um die spezifischen Retentionszeiten zu bestimmen und die Methode zu kalibrieren. Wiederholen Sie das Experiment dreimal, und tragen Sie den normalisierten Prozentsatz jeder Fotoform im Diagramm auf, den Prozentsatz über den Abstand von der bestrahlten Gewebeoberfläche.Am Tag Null werden die erwachsenen C57-Mäuse mit einem Gewicht von jeweils ca. 20 Gramm subkutan mit einer Suspension von ca. einer halben Million Lewis-Lungenkarzinomzellen in ca. 100 Mikrolitern DMEM- und Matrigel-Mischung im rechten Hinterbein geimpft. Dieses Verfahren wird unter 5%iger Isofluran-Sedierung durchgeführt. Die Tiere sind am fünften bis achten Tag bereit für die Behandlung, wenn die Tumore tastbar sind.Alle Operationen, bei denen getestet wird, sollten unter halbdunklen Bedingungen durchgeführt werden. Diese Bedingung gilt auch für die Behandlung der Tiere, nachdem sie die zusammengesetzte Dosis über einen Zeitraum von zwei Tagen erhalten haben. Stellen Sie nach dem Zufallsprinzip vier Gruppen von acht Tieren zusammen und entfernen Sie das Fell aus dem Tumorbereich.Die beiden Kontrollgruppen erhalten eine intravenöse Injektion des Vehikels. 100 Mikroliter Kochsalzlösung pro 20-Gramm-Tier, und die Tiere der beiden Versuchsgruppen erhielten die getestete Verbindung in der inaktiven Photoform in einer Lösung von einem Milligramm pro Milliliter Kochsalzlösung. Verabreichen Sie den zusammengesetzten Bolus mit fünf Millilitern pro Kilo in die Schwanzvene.Zwei Stunden und 45 Minuten nach der Injektion des Präparats wird das Tumorgebiet 20 Minuten lang unter Isofluran-Narkose mit einem 650-Nanometer-Laser mit einer Lichtleistungsdichte von 100 Milliwatt pro Quadratzentimeter bestrahlt. Beobachten Sie den Zustand der Tiere in den nächsten 30 Minuten sorgfältig. Beobachten Sie die Tiere täglich und messen Sie ihr Gewicht und die Größe ihrer Tumore.Messen Sie das Tumorvolumen und notieren Sie das Fortschreiten der Nekrose. Bestimmen Sie die Überlebensrate mit dem Standardverfahren. Die Ergebnisse unseres Protokolls für Schritt eins im Falle von 2D-Zellkulturexperimenten können als Bilder dargestellt werden, wie hier auf einem repräsentativen Bild für Lewis-Lungenkarzinomzellen, die mit LMB002 in unterschiedlichen Konzentrationen und für verschiedene Inkubationszeiträume inkubiert wurden.Die Cofärbung mit Hoechst und Propidiumiodid ermöglicht die Visualisierung von Zellkernen im Blaukanal und liefert so eine Gesamtzellzahl. Zellen mit beeinträchtigter Integrität der Plasmamembran wurden im roten Kanal beobachtet. Unter der Annahme, dass letzteres nekrotisch tot ist, kann die scheinbare Zytotoxizität einer untersuchten Verbindung als Prozentsatz der Propidiumiodid-positiven Zellen quantifiziert werden.Die Ergebnisse der Datenquantifizierung durch automatisierte Bildanalyse sind hier dargestellt. Für LMB002 sind sigmoidale Abhängigkeiten des Prozentsatzes von Propidiumiodid-positiven Zellen in der Verbindungskonzentration zu sehen. Aus diesen Daten können die IC50-Werte ermittelt werden.Unser Experiment zeigte, dass die offene Form von LMB002 etwa einen Verdünnungsschritt weniger toxisch ist als der Prototyp des Peptids Gramicidin S, während die geschlossene Form eine um drei bis vier Verdünnungsschritte geringere Toxizität aufweist, die mit der Inkubationszeit zunimmt. Die 3D-Zellexperimente lieferten die gleiche Art von Rohdaten, die einzelzellaufgelösten Sphäroidbilder pro Wand. Die Zugabe von Calcein als dritter Färbefarbstoff ermöglicht die Quantifizierung des Anteils metabolisch aktiver Zellen, der im grünen Kanal beobachtet wird.Die Dosis-Wirkungs-Kurven wurden, wie im 2D-Experiment, aus den Z-Stapeln von Bildern gewonnen. Abbildung A veranschaulicht solche Kurven und bestätigt die 2D-Ergebnisse. Wie in Abbildung B gezeigt, variiert der Gesamtdurchmesser des Sphäroids mit der Konzentration der Verbindung.Das Experiment für Schritt zwei ermöglicht die Bestimmung der LMB002-Konzentrationen in beiden Photoformen mittels UV-detektierter Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Beide Fotoformen unterschieden sich hinreichend in Retentionszeiten und Absorption, integriert auf den Tafeln A und B der Abbildung. Die erhaltenen Daten sind in der Abbildung zusammengefasst und bestätigen, dass unsere Rotlichtquelle die ringgeschlossene LMB002-Photokonversion in einer Tiefe von bis zu einem Zentimeter im Gewebeersatz, Hackfleisch mit etwa 103 Milliwatt pro Quadratzentimeter, induziert.Die Ergebnisse des In-vivo-Experiments, Schritt drei unserer Methodik, wurden durch Diagramme dargestellt, die das Tumorwachstum in Abhängigkeit von der Zeit in Kaplan-Meier-Überlebenskurven zeigten. Die hier vorgestellte Strategie zur Evaluierung photoschaltbarer Wirkstoffkandidaten ist praktikabel und eignet sich für Verbindungen mit Photoschaltern vom Diarylethen-Typ. Schritt eins, die Quantifizierung der Zytotoxizität, kann für das erste Screening der Bibliotheken der photokontrollierten Verbindungen verwendet werden.Schritt zwei: Die Bewertung der Effizienz von Fotoschaltungen ist sowohl einfach einzurichten als auch ethisch vertretbar. Es werden keine lebenden Tiere benötigt. Schritt drei, in vivo photopharmakologische Modelle, kann die Therapie auf Kleintiere angewendet werden.

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