Name: Lentivirale Vektorpräparation für die effiziente Gen- und microRNA-Modulation von geweberesidenten Makrophagen in der Bauchhöhle in vivo bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Lernen Sie die lentivirale Vektorpräparation zur stabilen Gentransfer in peritoneale Makrophagen in vivo bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht effiziente Gen- und microRNA-Modulation für Immunologie-Forschung.

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<meta charset="utf8"></head><body>Lentivirale Vektorvorbereitung für die in vivo Genmodulation

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<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L oder 0,02 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td> 0,22 μm<td></td></tr><tr><td>; m steriler Millex GP Filter</td><td>Merck</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m steriler Millex GP Filter</td><td>Merck</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL U-100 Insulinspritze mit Nadel, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)</td><td>BD</td><td>324892</td><td></td></tr><tr><td>1 Liter Behälter für scharfe Gegenstände</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2,4G2 Antikörper (TruStain FcX Anti-Maus CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Sieb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>AimV Medium (Forschungsqualität), AlbuMax Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31035025</td><td></td></tr><tr><td>Blockierungspuffer</td><td>im Haus</td><td></td><td></td>hergestellt</tr><tr><td>Brewer Thioglycolat Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2551</td><td>4% Stammlösung in Wasser hergestellt, autoklaviert und gefroren aufbewahrt.</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101222</td> Für <td>die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD</td><td>550993</td> Für <td>die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td> siehe Tabelle 1 Für die Verdünnung und Konzentration CD11c Biolegend <td>117317</td><td>Für die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117333</td> Für <td>die Verdünnung und Konzentration CD19 BD Siehe Tabelle 1 Für die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560375</td> Für <td>die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Biolegend</td><td>152410</td> Siehe <td>Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>CD226</td><td>Biolegend</td><td>128808</td><td>Siehe Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BD</td><td>560527</td><td>Siehe Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>Biolegend</td><td>152313</td><td>Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>100412</td><td>Verdünnung und Konzentration CD73 Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>CD73</td><td></td> Verdünnung <td>und</td> Konzentration in Tabelle <td>1 siehe Tabelle 1 Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>CD8a</td><td>eBioscience</td><td>48-0081-82</td><td>Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>Zellkulturkolben (T175 Flasche, 175 cm2, 550 mL)</td><td>Greiner Bio One 658175</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen, Röhrchen mit konischem Boden 25 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>358126</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugen</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Ultrazentrifuge und TC Zentrifuge</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Konische Zentrifugenröhrchen (15 mL und 50 mL)</td><td>Greiner Bio One</td><td>11512303 & 11849650</td><td></td></tr><tr><td>Kryoröhrchen</td><td>Greiner Bio One</td><td>123277</td><td>oder Kryoröhrchen</td></tr><tr><td>DMEM Medium (1x) + 4,5g/L D-Glukose, 400 & Mikro; M L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965-062</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Effectene Transfektionsreagenz</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123123</td><td>Verdünnung und Konzentration siehe Tabelle 1</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123133</td><td>Verdünnung und Konzentration siehe Tabelle 1</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123147</td> Die <td>Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>von FceR1</td><td>eBioscience</td><td>48-5898-80</td> Die <td>Verdünnung und Konzentration</td></tr> von <tr><td>fötalem Kälberserum (FCS)</td> finden Sie in Tabelle 1.<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>hitzeinaktiviert für 30 min bei 56 °; C und steril filtriert durch 0,22 &mu; m Filter</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; Attune NxT</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie (FACS) Puffer</td><td>wird im eigenen Haus</td><td></td><td></td>hergestellt</tr><tr><td>Fluoreszierendes Gewebekulturmikroskop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Benutzerpräferenz</td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution (HBSS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Zelllinie</td><td></td><td></td><td>mindestens eine Woche vor der Transfektion angebaut. Mykoplasmenfrei</td></tr><tr><td>HIV-1 Core Antigen</td><td>Beckman Coulter</td><td>6604667</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Hydrex chirurgisches Peeling, Chlorhexidingluconat 4% w/v Hautreiniger</td><td>Ecolab</td><td>3037170</td><td></td></tr><tr><td>I-A/I-E</td><td>Biolegend</td><td>107625</td> Siehe <td>Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>ICAM1</td><td>Becton Dickinson</td><td>554970</td><td>In Tabelle 1 finden Sie die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>der Jurkat-T-Zelllinie</td><td></td><td></td><td>, die mindestens eine Woche vor der Anwendung gezüchtet wurde. Mykoplasmen-frei</td></tr><tr><td>LEBEND/TOT fixierbar Nah-IR-Färbekit für tote Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34975</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G</td><td>Biolegend</td><td>127615</td><td>In Tabelle 1 finden Sie die Verdünnung und Konzentration</td></tr>. <tr><td>Hier verwendete Mäuse</td><td></td><td></td><td>C57BL/6 Weibchen im Alter von 8-12 Wochen (Charles Rivers), sofern nicht anders angegeben</td></tr><tr><td>Mikrokapillarpipetten (Volumenbereich 0,5-1.000 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific & Starlab</td><td>11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1</td><td>Biolegend</td><td>108724</td><td>Siehe Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>von Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td>, <td>hergestellt auf 2 % w/v in PBS</td></tr><tr><td>pCMV-& Delta; R8.91 Verpackungsplasmid</td><td></td><td>Zuffrey, R., et al. 1997</td><td>kodiert für das Gag-Pol HIV-Protein, das vom Cytomegalievirus-Promotor angetrieben wird. Ampicilin-Resistenz.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x, 10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>pHR'SIN-cPPT-SEW Plasmid</td><td></td><td>Rosas, M. et al. 2014</td><td>modifiziert für shRNA- und miR-Expressionsstudien. Kodiert den EGFP-Marker, den stromabwärts gelegenen SFFV-Promotor und stromaufwärts des hepatitiven Woodchuck-Virusverstärkers. Ampicilin-Resistenz.</td></tr><tr><td>Das pMD2.G-Plasmid</td><td></td><td>Naldini, L. et al. 1996</td><td>kodiert für das vesikuläre Stomatisvirus-Glykoprotein (VSV-G)-Hüllkurve. Ampicilin-Resistenz.</td></tr><tr><td>Ratten-IgG1 & Kappa; Isotypkontrolle</td><td>Becton Dickinson</td><td>550617</td><td>Siehe Tabelle 1 für die Verdünnung und Konzentration</td></tr><tr><td>Rattenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9759-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Rotes Blut ACK Lysepuffer</td><td>hergestellt im Haus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (1x) + 400 μM L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF</td><td>BD</td><td>562681</td> Für <td>die Verdünnung und Konzentration siehe Tabelle 1</td></tr><tr><td>Natriumhypochlorit-Tabletten (Bleichmittel, 2.000 ppm)</td><td>Guest Medical</td><td>H8818</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 24-Well-Zellkulturplatte</td><td>Greiner Bio One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Steril Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ und Ca2+ - frei</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Sterile EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Sterile VWR Einweg-Transferpipetten (23,0 mL, 30 cm)</td><td>VWR</td><td>612-4515</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>chirurgische Schere</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Spritzen mit Benutzerpräferenz</td></tr><tr><td>(50 mL und 1 0 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10084450 & 768160</td><td></td></tr><tr><td>Tim4</td><td>Biolegend</td><td>130007</td><td>In Tabelle 1 finden Sie die Verdünnung und Konzentration</td></tr> der <tr><td>96-Well-Zellkulturplatte</td><td>Greiner Bio One</td><td>650180</td><td></td> mit U-Boden</tr></tbody></table>

lentivirale vektorpräparation für die effiziente gen- und microrna-modulation von geweberesidenten makrophagen in der bauchhöhle in vivo bei mäusen

Lentiviral Vector Preparation for Efficient Gene and MicroRNA Modulation of Peritoneal Cavity Tissue&#45;Resident Macrophages In Vivo in Mice

Lentivirale Vektorpräparation für die effiziente Gen- und microRNA-Modulation von geweberesidenten Makrophagen in der Bauchhöhle in vivo bei Mäusen

Peritoneal tissue-resident macrophages have broad functions in the maintenance of homeostasis and are involved in pathologies within local and neighboring ...

lentiviral-vector-preparation-for-efficient-gene-microrna-modulation

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung...

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur effizienten Transfektion von murinen Makrophagen-Zelllinien mit siRNAs unter Verwendung des Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systems, zur Stimulation der Makrophagen mit Lipopolysaccharid und zur Überwachung der Auswirkungen auf die Produktion von entzündlichen Zytokinen.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Wir beschreiben hier ein einfaches Protokoll zur Isolierung von Maus-Peritonealmakrophagen. Diesem Verfahren folgt eine RNA-Extraktion, um eine Genexpressionsanalyse bei der Stimulation von Toll-like-Rezeptoren durchzuführen.

Isolierung von Murine Peritonealmakrophagen zur Durchführung Genexpressionsanalyse Nach Toll-like Rezeptoren Stimulation

Hydrodynamische Schweif Vene Injektion von Transposon-basierte Integration Vektoren ermöglicht stabile Transfektion von murinen Hepatozyten in-vivo. Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Protokoll für die Transfektion Systeme, die der langfristigen konstitutive Ausdruck von einem einzigen Transgen oder kombinierte konstitutiven und Doxycyclin-induzierbaren Ausdruck eines Transgen oder MiR-ShRNA in der Leber ermöglicht.

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Förderung der Transgen-Integration und Herstellung von Gründer Transgene Mäuse mit hoher Wirksamkeit durch eine einfache Injektion eines Lentivirale Vektors in den Perivitelline Raum einer befruchteten Eizelle.

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

In diesem Artikel liefern wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für den Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark dendritische Zellen und Makrophagen abgeleitet. Die Methode basiert auf der Transduktion des Knochenmarks Stammväter mit retroviralen Konstrukten gefolgt von Differenzierung in Makrophagen und dendritischen Zellen in Vitro.

Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen

Wir beschreiben eine Methode der Verwendung von Polyethyleneimine (PEI)-superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln für transfecting Makrophagen mit SiRNA beschichtet. Diese Nanopartikel können effizient SiRNA zu Makrophagen in Vitro und in Vivo und Stille Ziel Genexpression liefern.

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

Gezielte DNA Epigenom Bearbeitung stellt eine leistungsstarke Therapieansatz. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion, Reinigung und Konzentration der all-in-One Lentivirale Vektoren beherbergen das CRISPR-dCas9-DNMT3A Transgen für Epigenom-editing-Anwendungen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Neuronen abgeleitet.

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

Makrophagen, insbesondere primäre Makrophagen, sind eine Herausforderung zu transfetieren, da sie sich auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden.

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Herstellung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen (MSC)-abgeleiteten extrazellulären Vesikelbiomimetika für die Gentherapie einzuführen. Das Nanovesikel ist mit MSC-abgeleiteten Lipid-Doppelschichten eingeschlossen und kapselt rekombinante AAVs, die das relevante Gen im Lumen tragen. Dieses Nanovesikel bietet einen verbesserten Vektor für die Genlieferung in vivo .

Entwicklung mesenchymaler Stammzellmembran-umhüllte Nanovesikel zur verbesserten Genlieferung

Lernen Sie die lentivirale Vektorpräparation zur stabilen Gentransfer in peritoneale Makrophagen in vivo bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht effiziente Gen- und microRNA-Modulation für Immunologie-Forschung.

Lentivirale Vektorpräparation für die effiziente Gen- und microRNA-Modulation von geweberesidenten Makrophagen in der Bauchhöhle in vivo bei Mäusen (Video) | JoVE Journal

Lentivirale Vektorpräparation für die effiziente Gen- und microRNA-Modulation von geweberesidenten Makrophagen in der Bauchhöhle in vivo bei Mäusen

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