Generierung von braunfettspezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus-Single-Guide-RNA-Systems
24. März 2023
In diesem Protokoll beschreiben wir die technischen Verfahren zur Erzeugung von braunem Fettgewebe (BAT)-spezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus (AAV) Single-Guide RNA (sgRNA)-Systems. Die beschriebenen Schritte umfassen das Design der sgRNAs, die Herstellung der AAV-sgRNA-Partikel und die Mikroinjektion von AAV in die BAT-Lappen.
Dieses Protokoll erzeugt braunfettspezifische Knockout-Mäuse unter Verwendung eines Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus-Single-Guide-RNA-Systems. Es beinhaltet eine chirurgische Technik, um AAV sicher in das braune Fett zu verabreichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schnell gewebespezifische Knockouts erzeugen kann, ohne dass Mäuse selektiv gezüchtet werden müssen.
Der Ansatz zur Herstellung von gewebespezifischen Knockouts oder Knockdowns kann an andere Gewebe angepasst werden, wenn das chirurgische Verfahren zur Injektion von AAV auf der Grundlage des Zielorgans modifiziert wird. Verabreichen Sie das Analgetikum zunächst subkutan an die anästhesierte UCP1 Cre Cas9-Maus, um postoperative Schmerzen und Beschwerden zu minimieren und zu verhindern. Rasieren Sie dann das Fell im zwischenliegenden Bereich mit einem Rasierer und sterilisieren Sie den Operationsbereich mit mindestens drei abwechselnden Runden eines Peelings auf Jod- oder Chlorhexidinbasis, gefolgt von 70%igem Ethanol.
Machen Sie mit einem Skalpell einen zwei Zentimeter langen Schnitt in die Haut über dem braunen Fettgewebe zwischen den Schulterblättern, um das Zwischenkappelfett freizulegen. Nachdem Sie einen einzigen Schnitt gemacht haben, schneiden Sie das Fettgewebe an der Grenze zwischen der distalen Region des Fettgewebes und den Muskeln durch. Ziehen Sie dann mit der chirurgischen Schere in der dominanten Hand das Fettgewebe stumpf und vertikal ab, um das braune Fettgewebe freizulegen, während Sie das Fettgewebe, einschließlich des braunen Fettgewebes, mit der nicht dominanten Hand einklemmen.
Verwenden Sie die Sulzer-Vene als Orientierungspunkt, um die genaue Position des braunen Fettgewebes anzuzeigen. Als nächstes injizieren Sie für jede Maus langsam 20 Mikroliter Adeno-assoziiertes Virus oder AAV in jeden Lappen der beiden braunen Fettgewebe mit einer scharfen 32-Gauge-Nadel, die mit einer 100-Mikroliter-Hamilton-Spritze verbunden ist. Bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion, die durch keine Leckagen an der injizierten Stelle während der AAV-Verabreichung angezeigt wird.
Nachdem Sie die Homöostase sichergestellt haben, bringen Sie das freiliegende Fettgewebe wieder in seine normale Position, um den Rand des Fettgewebes und des Muskels mit einem resorbierbaren 5-0-Monofilamentfaden zu nähen. Zum Schluss die offene Haut mit 5-0 beschichteten VICRYL ungefärbten Geflechtfäden vernähen. Die genaue Lage des braunen Fettgewebes kann nicht identifiziert werden, ohne es freizulegen, jedoch eine übermäßige Expositionsschädigung des Gewebes.
Zu den potenziellen Fehlern, die zu erfolglosen Injektionen geführt haben könnten, gehörten die Injektion der AAV-Lösung in die falsche Region, das Eindringen der Nadel in das Gewebe und das Aufblähen des Gewebes aufgrund eines übermäßigen Volumens der AAV-Lösung. Die präzise Abgabe von AAV-Einzelleit-RNA an das braune Fettgewebe war entscheidend für den Erfolg des Protokolls. Der Schlüssel zum Erfolg bei der Freilegung des braunen Fettgewebes ist die chirurgische Scherentechnik, einschließlich der Richtung und Tiefe der Schere und der Position der Hamilton-Spritze.
Diese Technik verfügt über eine belastungserzeugende gewebespezifische Knockout-Maschine, um die molekularen Regulatoren des mit braunem Fett verbundenen Energiestoffwechsels zu verstehen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von braunem Fettgewebe-(BAT-)spezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung einer Kombination aus Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und adeno-assoziierten Virus-(AAV-)Einzel-RNA-Führungsstrang-Techniken. Mithilfe dieser Methoden können Forscher schnell gewebespezifische Knockouts erzeugen, ohne auf selektive Zucht angewiesen zu sein.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Genetik
- Zellbiologie
- Molekularbiologie
Hintergrund
- Braunes Fettgewebe ist entscheidend für den Energiestoffwechsel.
- Die Erstellung gewebespezifischer Knockouts hilft beim Verständnis biologischer Prozesse.
- Diese Methode könnte möglicherweise für andere Gewebe angepasst werden.
Verwendete Methoden
- Anwendung der Cre-LoxP- und CRISPR-Cas9-Methoden.
- Verwendetes Mausmodell: UCP1 Cre Cas9 Mäuse.
- Verabreichung von AAV-sgRNA mittels chirurgischer Mikroinjektion.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche gezielte Bearbeitung und Ausschaltung von braunem Fettgewebe.
- Nachgewiesene Wirksamkeit von AAV bei gewebespezifischer Genbearbeitung.
- Wesentliche chirurgische Techniken zur präzisen Applikation validiert.
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt eine schnelle Methode zur Erzeugung von Knockout-Modellen, die für den braunen Fettstoffwechsel relevant sind.
- Sie vertieft das Verständnis molekularer Regulatoren des Energiestoffwechsels.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Schnelle Erzeugung von mausmodellen mit einem bräunen fettgewebe-(bat-)spezifischen knock-out mithilfe kombinierter cre-loxp-, crispr-cas9- und aav-sgrna-technologien ermöglicht eine beschleunigte funktionelle genomik in der metabolischen forschung. Dieser ansatz beschleunigt die zielvalidierung und die mechanistische risikominderung für gene, die an der energieregulation beteiligt sind, und verkürzt die zykluszeiten im vergleich zur traditionellen züchtung. Die methode unterstützt portfolioentscheidungen, indem sie gewebespezifische erkenntnisse liefert, die für die frühe entdeckung und die translationale kontinuität entscheidend sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der Genfunktion in braunem Fettgewebe für eine klare Aufklärung der Wirkmechanismen.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem Genwirkungen in einem krankheitsrelevanten Gewebe isoliert werden.
- Befähigt zu einer vorhersagbaren Sicherheit bei der Auswahl von Zielstrukturen für Stoffwechselerkrankungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte Knockout-Modelle für die nachgeschaltete phänotypische Bildschirmung.
- Standardisiert genetische Hintergründe für reproduzierbare quantitative Auswertungen.
- Beschleunigt die Assay-Entwicklung, indem lange Züchtungszyklen umgangen werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung präklinischer Modelle mit menschlichen Stoffwechselerkrankungsmechanismen durch BAT-spezifische Genbearbeitung.
- Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem der Beitrag von Genen zum Energiestoffwechsel geklärt wird.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in der Stoffwechselforschung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode wird in den frühen Phasen der Entdeckung und Zielvalidierung integriert und schafft eine Brücke zum präklinischen Modellentwicklung für metabolische und endokrinologische Forschungsportfolios.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Aufklärung von Signalwegen bei der von braunem Fettgewebe (BAT) vermittelten Energie regulation.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare Knockout-Modelle für quantitative phänotypische Assays.
- Analytik: Ermöglicht die Messung gen-spezifischer Effekte auf metabolische Parameter in vivo.
- Translationale Forschung: Erleichtert die Anpassung präklinischer Modelle an die menschliche BAT-Biologie.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anpassbares Protokoll für andere Gewebe durch Modifikation der AAV-Abgabe, was eine breitere Nutzung in Forschung und Entwicklung unterstützt.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Zielvalidierung.
- Operativer Wert: Vereinfacht die Modellerstellung durch standardisierte, reproduzierbare Verfahren.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Go/No-Go-Entscheidungen und eine kapitaleffiziente Ressourcenallokation.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von metabolischen und endokrinen Zielstrukturen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrochirurgischer Injektion und anatomischer Lokalisation des braunen Fettgewebes.
- Benötigt Zugang zu Infrastruktur für die Herstellung von AAVs und die genetische Bearbeitung mittels CRISPR-Cas9.
- Setzt eine strenge, interdisziplinäre Standardisierung zur Reproduzierbarkeit voraus.
- Erfordert Anpassung des Protokolls, um andere Gewebe oder Organe gezielt anzusteuern.
- Der Erfolg hängt von einer präzisen AAV-Applikation und der Minimierung von Gewebeschäden ab.
