Name: In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Lernen Sie die In-situ-Bildgebung des Thymus mit Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Untersuchung der T-Zell-Migration. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Positiv- und Negativselektion in vivo.

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Wir bedanken uns bei Matt Paul und Jimmy Wu für die technische Unterstützung.

Adoptiven Transfer Inject Neugeborenen mit 50-100 ul des Knochenmarks mit einer Insulin-Spritze 2-4 mal während der ersten 3-7 Tage des Lebens, mit einem letzten Donor-zu-Host-Verhältnis von 1:1. Ziel für eine Injektionsstelle unter dem Brustbein und Rippen, aber über dem Darm und Magen. Führen Sie die Nadel weit genug, um das Bauchfell, Achten Sie darauf, Punktion der Membran zu durchdringen. Es ist nicht ungewöhnlich für einen Teil der Knochenmark während der Injektion verloren zu sein. Sie können den Verlust durch Lösen Sie den Griff der Welpe zu reduzieren, wie Sie spritzen, um so lassen die Haut zu erweitern und dann langsam dem Entfernen der Nadel. Präparation des Thymus Machen Sie einen Schnitt durch die Mittellinie und schneiden oder reißen die Haut weg, um den Brustkorb zu offenbaren. Halten Sie das Brustbein und Durchtrennung des Bauchfells und des Zwerchfells. Cut die Seiten des Brustkorbs, die Brusthöhle zu offenbaren. Die Thymusdrüse liegt oben auf dem Herzen. So wie die Struktur des Thymus zu bewahren, auf das umliegende Gewebe, wie Sie aus sezieren die Thymusdrüse zu halten. Spülen Sie die Thymusdrüse mit PBS, um sie vor dem Austrocknen während der Präparation zu halten. Vorsichtig entfernt tease überschüssiges Gewebe auf der Oberfläche des Thymus Kapsel und halbieren die beiden Lappen. Vorbereitung Tissue for Imaging Verwenden Veterinär Gewebekleber zu kleben die Thymusdrüse nicht zu einem Quadrat Deckglas. Verwenden Sie einen pipetteman um den Bruchteil einer Mikroliter Kleber gesetzt. Verbreiten Sie den Kleber auf die ungefähre Länge und Breite des Thymus. Stetige Thymus gegen das Deckglas und ziehen Sie es an seinen Platz. Zwei-Photonen-Imaging Das Gewebe wird in DMEM ohne Phenolrot mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid durchströmt wird, und erwärmt auf 37 ° C unter Wasser Zwei-Photonen-Anregung wurde mit einer Spectra-Physics MaiTai Laser abgestimmt auf 900nm und CFP, GFP, YFP und Texas Red Lichtemission wurde abgetrennt mit A 495, 515, 560 dichroitische Spiegel und sammelte mit PMT Detektoren.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Zwei-Photonen-Imaging in den Thymus ermöglicht es uns, in lebendige, intakte Organe der Wechselwirkungen und Migrationen, die Auswahl Ereignisse im Thymus zugrunde zu untersuchen.

in situ imaging der maus thymus mit 2-photonen-mikroskopie

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM) ermöglicht es uns, Bild tief in den Thymus und dokumentieren die Ereignisse, die wichtig sind für die Thymozyten Entwicklung. Zu folgen, die Migration von Individuen in einer Menge von Thymozyten, generieren wir Neugeborenen Chimären, in denen weniger als ein Prozent der Thymozyten von einem Spender, dass transgene für ein ubiquitär ausdrückliche fluoreszierenden Proteins abgeleitet werden. Zur Erzeugung dieser partiellen hämatopoetischen Chimären sind neonatale Empfänger mit Knochenmark zwischen 3-7 Tage alt injiziert. Nach 4-6 Wochen wird die Maus getötet und die Thymusdrüse wird sorgfältig präpariert und bissected Erhaltung der Architektur des Gewebes, das abgebildet werden soll. Der Thymus ist auf einem Deckglas in der Vorbereitung für die Ex-vivo-Bildgebung von TPM geklebt. Während die Abbildung der Thymus ist in DMEM ohne Phenolrot mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid durchströmt wird, und erwärmt auf 37 ° C gehalten Mit diesem Ansatz können wir untersuchen, die Ereignisse für die Erzeugung von einem vielfältigen T-Zell-Repertoires erforderlich.

Wir präsentieren Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Erzeugung von Chimären Neugeborenen sowie die Präparation und Vorbereitung des Thymus für die Ex-vivo-Bildgebung durch 2-Photonen-Mikroskopie.

In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie

Die Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM) ermöglicht es uns, tief in den Thymus hineinzublicken und die für die Entwicklung von Thymozyten wichtigen Ereignisse zu dokumentieren. Um ... zu verfolgen ...

Die Zwei-Photonen-Bildgebung ist für die Immunologie nützlich, da sie es uns ermöglicht, die Migration einer einzelnen Zelle zu verfolgen, während sie auf ihre Umgebung trifft. Durch die Verfolgung der Migration im Thymus können wir mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie den Mechanismus der positiven und negativen Selektion charakterisieren.Hallo, ich bin Ina Lottie aus dem Labor von Dr. Ellen Roby an der University of California in Berkeley. Und ich bin Paul Herzmark, ebenfalls aus Ellens Robby-Labor. Heute zeigen wir Ihnen, wie wir die In-situ-Bildgebung von Thymusgewebe durchführen, und ich werde Ihnen zeigen, wie wir unser Zwei-Photonen-Mikroskop zur Abbildung des Thymus verwenden können.Und ich zeige Ihnen die Schritte, die zur Zwei-Photonen-Bildgebung führen. Dazu gehören die folgenden Verfahren: Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus dem Knochenmark, adoptive Übertragung von Knochenmarkzellen in Neugeborene, Dissektion und Bisektion des Thymus sowie Vorbereitung des Gewebes zur Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie. Beginnen wir also.Bevor wir den Thymus für die Bildgebung vorbereiten können, müssen wir zunächst Knochenmarkzellen in eine neugebore

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zwei-Photonen-Imaging hat Lymphozyten Motilität und zellulären Interaktionen im Lymphknoten unter basalen Bedingungen und während einer Immunantwort Antwort 1 aufgedeckt. Hier zeigen wir, adoptiven Transfer von T-Zellen, Isolierung von Lymphknoten und Imaging-Motilität der CD4 + T-Zellen in der explantierten Lymphknoten.

Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen

Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung wiederholt murine Mikroglia und zirkulierenden...

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Wir haben neuartige Labormethoden und Protokolle zur intravitale Bildgebung des Thymus entwickelt. Unsere Technik sollte bei der Identifizierung von „Nischen“ im Thymus helfen, in denen die Entwicklung von T-Zellen stattfindet.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Zeitraffer-Bildgebung am lebenden Tier liefert wertvolle Informationen über die strukturelle Reorganisation im intakten Gehirn. Hier stellen wir ein verdünntes Schädelpräparat vor, das die transkranielle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Strukturen in der lebenden Mausrinde mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Das Ziel des Protokolls ist längs intravitalen Echtzeitverfolgung der Thymozyten durch Laser-scanning-Mikroskopie in der zebrafischembryonen Implantate in die Vorderkammer des Auges Maus zeigen. Die Transparenz der Hornhaut und Vaskularisierung des Transplantats ermöglicht kontinuierlich aufzeichnen Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg.

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

Morphologische Veränderungen treten in immunreagierenden Fibroblastenzellen nach aktivierung auf und fördern Veränderungen bei der Zellrekrutierung. Verwendung von 2-Photonen-Bildgebung in Verbindung mit einem gentechnisch veränderten Fibroblasten-spezifischen Protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) Mauslinie und grün fluoreszierend markiert Lipopolysaccharid-FITC, können wir hochspezifische Aufnahme von Lipopolysaccharid in dermalen Fibroblasten und morphologischen...

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein interventionelles radiologisches Verfahren, das für die intrathymische Injektion bei Mäusen eingerichtet wurde, um das Risiko einer offenen Operation zu vermeiden und die Genauigkeit blinder perkutaner Injektionen zu verbessern.

Eine minimal-invasive, genaue und effiziente Technik zur intrathymischen Injektion bei Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem die transplantierte linke Lunge der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie intravital abgebildet werden kann. Dies stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen in Echtzeit nach einer Lungentransplantation von Mäusen zu untersuchen.

Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

Dieses Protokoll enthält eine ausführliche Beschreibung eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes für ein chronisches Schädelfenster- und mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell, das für die in vivo Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären optimiert ist.

Mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell für die In-vivo-Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären

Diese Studie präsentiert einen in-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebungsansatz zur Visualisierung der Strukturen von Axonterminals mit niedriger Schwelle von Mechanorezeptoren (LTMR) in der Vorderpfotenhaut von Mäusen. Durch wiederholte, hochauflösende Bildgebung einzelner Axone bietet diese Methode eine neue Grundlage, um die Struktur und Funktion des kutanen Sinneskreises während der Entwicklung und bei Erwachsenen zu untersuchen.

Intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung der Morphologie des berührungssensorischen Axons in der Maushaut

Lernen Sie die In-situ-Bildgebung des Thymus mit Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Untersuchung der T-Zell-Migration. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Positiv- und Negativselektion in vivo.

In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie

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