In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie

Die Zwei-Photonen-Bildgebung ist für die Immunologie nützlich, da sie es uns ermöglicht, die Migration einer einzelnen Zelle zu verfolgen, während sie auf ihre Umgebung trifft. Durch die Verfolgung der Migration im Thymus können wir mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie den Mechanismus der positiven und negativen Selektion charakterisieren.

Hallo, ich bin Ina Lottie aus dem Labor von Dr. Ellen Roby an der University of California in Berkeley. Und ich bin Paul Herzmark, ebenfalls aus Ellens Robby-Labor. Heute zeigen wir Ihnen, wie wir die In-situ-Bildgebung von Thymusgewebe durchführen, und ich werde Ihnen zeigen, wie wir unser Zwei-Photonen-Mikroskop zur Abbildung des Thymus verwenden können.

Und ich zeige Ihnen die Schritte, die zur Zwei-Photonen-Bildgebung führen. Dazu gehören die folgenden Verfahren: Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus dem Knochenmark, adoptive Übertragung von Knochenmarkzellen in Neugeborene, Dissektion und Bisektion des Thymus sowie Vorbereitung des Gewebes zur Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie. Beginnen wir also.

Bevor wir den Thymus für die Bildgebung vorbereiten können, müssen wir zunächst Knochenmarkzellen in eine neugeborene Maus übertragen. Diese Knochenmarkzellen wurden aus den Hinterbeinen transgener Mäuse isoliert, die ubiquitär GFP exprimieren. Dies ist eine Insulinspritze mit 50 µL Knochenmark.

Wir führen zwei bis vier Injektionen in Wirtstiere im Alter von drei bis sieben Tagen durch, wobei wir für jedes Jungtier jeweils Knochenmark von einem Spender verwenden. Hier haben wir ein fünf Tage altes Jungtier; ziehen Sie die Haut leicht nach hinten, um zu verhindern, dass sich das Tier während der Injektion bewegt, und um die Haut straff zu halten. Wählen Sie einen Injektionsort unterhalb der Lunge und des Brustkorbs, aber oberhalb des Darms und des Magens.

Während der Injektion lockern Sie den Griff auf die Haut, damit sie sich ausdehnen kann. Ziehen Sie abschließend die Spritze langsam heraus, um die Menge des verlorenen Knochenmarks zu minimieren. Diese Mäuse werden vier bis sechs Wochen lang entwickeln gelassen, danach kann der Thymus zur Bildgebung entfernt werden.

Nach vier bis sechs Wochen kann der Thymus entfernt werden. Für die Bildgebung verwende ich ein Paar große Pinzette und Schere sowie ein Paar kleine Pinzette und Schere. Diese Versuchstiere wurden gemäß unserem Protokoll für den Tierversuch geopfert und mit Ethanol besprüht.

Und ich werde die große Pinzette verwenden, um die Haut zu greifen und einen Schnitt in der Mittellinie vorzunehmen. Nun kann ich entweder die Schere verwenden, um entlang der Mittellinie zu schneiden, oder ich kann die Haut vom Peritoneum abreißen und die Haut feststecken, um die Brusthöhle freizulegen. Ich werde das Brustbein als Halt nutzen, während ich durch das Peritoneum schneide und durch das Zwerchfell in die Brusthöhle eindringe, um dann entlang der Seiten des Rippenbogens zu schneiden.

Und Sie können sehen, dass der Thymus direkt auf dem Herzen liegt. Ich werde sie wieder zurücklegen. Hier ist also der Thymus.

Ich werde vermeiden, es anzufassen. Sie verwenden die kleineren Pinzetten und halten weiterhin das Gewebe um den Thymus herum fest. Gut, jetzt werde ich es mit etwas PBS besprühen und damit beginnen, überschüssiges Gewebe zu entfernen.

Ich werde das Gewebe um den Thymus herum verwenden, um festzuhalten. Wenn ich den Thymus säubere, entferne ich vorsichtig das überschüssige Gewebe, indem ich es abschneide. Der Thymus besteht aus zwei Lappen, die wir ebenfalls während der Säuberung voneinander trennen müssen.

Doch zuerst werde ich all diese zusätzlichen Blutgefäße entfernen, die auf der Oberfläche des Thymus liegen. Ich achte sehr darauf, die Architektur des Thymus, den wir abbilden werden, nicht zu stören. Daher entferne ich nur das Gewebe, das sich direkt an der Oberfläche befindet.

Jetzt werde ich vorsichtig beginnen, die beiden Lappen zu trennen. Dies ist der ventrale und der dorsale Lappen, die wir voneinander lösen werden, indem wir das Gewebe vorsichtig schneiden und auseinanderziehen. Wir möchten vermeiden, dass das Gewebe austrocknet, daher werden wir etwas PBS darauf spritzen.

Jetzt habe ich die beiden Lappen getrennt. Dies ist der dorsale Lappen, der eine charakteristische Gitarrenform aufweist. Und dies hier ist der ventrale Lappen.

Ich werde das überschüssige Gewebe von jedem dieser Lappen entfernen, damit der Bildgebungs Bereich frei von überflüssigem Gewebe ist. Ich lasse jedoch ein kleines bisschen Gewebe zurück, an dem wir die Thys festhalten können. Beim Abbilden würden wir sonst durch dieses zusätzliche Gewebe hindurchgehen, was eigentlich nicht notwendig ist, und die Bildqualität wird durch dessen Entfernung verbessert.

Jetzt haben wir unsere beiden halbierten Lappen, die bereit sind, zum Abbilden auf einen Deckgläser aufgebracht zu werden. Um den halbierten Thymus für die Bildgebung vorzubereiten, benötigen Sie etwas veterinärmedizinisches Gewebekleber und 18 mal 18 Deckgläser. Ich verwende gerne eine Pipettenspitze, um einen Bruchteil eines Mikroliters Kleber auf das Deckglas aufzutragen.

Ich werde also einen Tropfen Klebstoff auftragen, der etwa die Länge des Thymus hat, den wir abbilden werden. Dann verteile ich ihn gerne etwas. Wenn er also die Breite des Thymus hat, werde ich erneut beide Lappen auf dasselbe Deckglas geben.

Ich werde also noch einen genau hierhin legen. Ich nehme nun das Läppchen vom überschüssigen Gewebe auf, lege es auf die Deckglasplatte und ziehe es in den Bereich, wo der Kleber ist. Ich mache dasselbe mit dem anderen Läppchen, berühre dabei erneut die Deckglasplatte an einer Stelle ohne Kleber, um meine Hand zu stabilisieren, und lege dann das andere thymische Gewebe auf die Deckglasplatte.

Nachdem wir beide thymische Globen an der Deckglasunterlage befestigt haben, werden wir diese an Paul zur Bildgebung weitergeben. Vielen Dank, Ina. Nehmen wir diese Probe und legen sie in das DME-Medium, das wir für die Bildgebung verwenden werden.

Das ist unser Aufbau für die Zweiphotonenmikroskopie. Die Zweiphotonenmikroskopie eignet sich sehr gut zur Abbildung von Immunzellen, da man tief in den Thymus hineinsehen und die fluoreszierenden Zellen in Bewegung beobachten kann. Sie verwendet einen gepulsten Infrarotlaser, um die Zellen zum Fluoreszieren anzuregen.

Und in unserem Heim-Belichtungs-Mikroskop haben wir vier verschiedene Kameras, die es uns ermöglichen, vier verschiedene Farben gleichzeitig zu visualisieren, sowie ein spezielles Objektiv mit 20-facher Vergrößerung. Es handelt sich um ein spezielles Objektiv, das in das DME-Medium eintaucht, in das wir den Thymus eingetaucht haben, wodurch es eine numerische Apertur von 0,95 aufweist, was sehr gut ist und unsere Zellen sehr hell erscheinen lässt. Um das Gewebe gesund zu halten, leiten wir 95 % Sauerstoff und 5 % CO2 durch das DMEM-Medium.

Von dort wird es in die Perfusionskammer gepumpt, wo es auf 37 Grad erwärmt wird, und dort werden die Thymuslappen untergetaucht. Mit diesem System können wir die Zellen im Thymus vier Stunden lang während der Bildgebung gesund erhalten. Ich habe Ihnen also gezeigt, wie man die Bildgebung am Zweiphotonenmikroskop einrichtet.

Sehen wir uns nun einige unserer Ergebnisse in diesem sich wiederholenden Film an. Sie können den Thymus sehen, den wir hier in vier verschiedenen Farben abgebildet haben. Rot zeigt die Blutgefäße des Thymus, und Gelb zeigt die dendritischen Zellen des Wirts, die unter Kontrolle eines dendritischenzell-spezifischen Promotors gelbes fluoreszierendes Protein exprimieren.

Die blauen und grünen Thymozyten, die Sie hier sehen, stammen von zwei verschiedenen Spendern, die wir verwenden, um ein neonatales Chimär mit einer adoptiven Transfer-Technik herzustellen, die Ena Ihnen zuvor gezeigt hat. Die grünen Zellen sind Thymozyten, die grünes fluoreszierendes Protein exprimieren, und die blauen Zellen sind Thymozyten aus dem Donut, die cyanfarbenes fluoreszierendes Protein exprimierten. Dies ist der gleiche sich wiederholende Film, den ich Ihnen bereits gezeigt habe, aber ich möchte Ihnen die dreidimensionale Struktur der Datensätze verdeutlichen, die wir erfassen, um diese Filme zu erstellen.

Wir fokussieren auf eine Ebene und nehmen ein Bild auf, fokussieren dann etwas tiefer und nehmen ein weiteres Bild auf sowie noch etwas tiefer ein weiteres Bild. Für diesen Film sind wir etwa 60 Mikrometer nach unten gegangen und haben diesen Bildvolumen dann ungefähr alle 30 Sekunden wiederholt, um das sich bewegende Volumen zu erhalten. Dieser Film wurde über einen Zeitraum von etwa 20 Minuten aufgenommen.

So können wir die Zellen im Laufe der Zeit dreidimensional verfolgen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie wir den Thymus mithilfe der Zweiphotonen-Mikroskopie abbilden. Die wichtigsten Aspekte dieses Verfahrens sind erstens, die Neugeborenen mit Knochenmark von Spendern zu injizieren.

Zwei, das Thymusorgan unter Erhaltung seiner Struktur dissezieren und präparieren. Drei, das Thymusgewebe fest auf einem Deckglas befestigen. Vier, die Bildgebung mittels eines Zwei-Photonen-Mikroskops durchführen. Mit der Bildgebung im Thymus können zahlreiche Fragen zur Entwicklung von Thymozyten und zur Generierung eines vielfältigen T-Zell-Repetoirs beantwortet werden.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.