Name: Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Modellierung der Blut-Hirn-Schranke mit der MicroSiM-Plattform unter Verwendung menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Sepsis-Effekten auf die Gehirnfunktion.

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J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. und L.W. wurden durch den NIH-Zuschuss R33 HL154249 finanziert. J.L.M. wurde durch R44 GM137651 finanziert. M.M. wurde durch den Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester, gefördert. M.T. wurde von RF1 AG079138 finanziert. K.C. wurde von der International Foundation for Ethical Research finanziert.

Analyse von Blut-Hirn-Schrankenmodellen mittels Immunfluoreszenzfärbung

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J.L.M. ist Mitbegründer von SiMPore und hält eine Kapitalbeteiligung an dem Unternehmen. SiMPore vermarktet ultradünne siliziumbasierte Technologien, einschließlich der in dieser Studie verwendeten Membranen.

Obwohl Membranchips auf Stabilität ausgelegt sind, können sie bei unsachgemäßer Handhabung während der Montage reißen oder brechen. Daher ist es wichtig, den Chip in den Kerben der Chippinzette zu greifen und vorsichtig in die Vorrichtung zu legen. Beim Umgang mit den Geräten im Allgemeinen müssen besondere Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um die Geräte nicht anzustoßen oder fallen zu lassen. Während der Verklebung des Membranchips mit der Vorrichtung A1 muss der Chip flach und zentriert auf die Säule der Vorrichtung A1 gelegt werden, um Membranrisse während der Verklebung mit Bauteil 1 zu vermeiden. Darüber hinaus muss jeder Kontakt mit den freiliegenden PSA-Schichten nach dem Abnehmen der Schutzmasken vermieden werden. Bei der Handhabung von Bauteil 2 nach dem Entfernen der Schutzmasken empfiehlt es sich, es an der Bauteilkante festzuhalten und mit einer Pinzette die PSA-freie Dreiecksecke zu greifen.
Während Zellkulturprotokolle für mögliche BHS-Modelle beschrieben wurden, kann das hier beschriebene BMEC/Perizyten-Kokulturmodell der BHS je nach physiologischem Kontext und Fragestellungen ausreichend oder unzureichend sein. Zum Beispiel findet der Transport von Immunzellen hauptsächlich in den postkapillären Venolen des Gehirns statt41,42. In diesen Regionen trennt ein perivaskulärer Raum die BMEC/Perizyten-Barriere von den glialen Limitanen, die von Astrozyten gebildet werden. So besteht die neurovaskuläre Einheit (NVU) in postkapillären Venolen aus zwei physikalisch getrennten Barrieren in Reihe, und die astrozytären Endfüße berühren nicht direkt die BMEC/Perizyten-Blutschranke, die durch das aktuelle Modell gut repräsentiert wird. Wenn das Ziel ein NVU-Modell ist, das den Einfluss von Astrozyten-sezernierten Faktoren auf die Blutschranke berücksichtigt, könnte dem Gerät ein Astrozytenkompartiment hinzugefügt werden, das den Austausch löslicher Faktoren durch den perivaskulären Raum ermöglicht. Dieses Beispiel wurde bereits34 illustriert und könnte erweitert werden, um andere Zellen wie Mikroglia und Neuronen in einem 3D-"Gehirn"-Kompartiment einzubeziehen. Die modulare Architektur der Plattform ermöglicht es, einfache Montagestrategien zu verwenden, um diese Rekonfigurationen zu erreichen, so dass die Plattform so einfach oder komplex ist, wie es erforderlich ist, um die vorliegenden Hypothesen zu erfüllen. Jedes Zellkultur-Setup; muss jedoch für neue Zelllinien und Multikulturen optimiert werden. Aufgrund der Eigenschaften der Siliziumnitrid-Membranen müssen beispielsweise Beschichtungslösungen im Vergleich zu Gewebekulturplatten angepasst werden. Der Einschluss von Fibronektin hilft in der Regel bei der Zellanhaftung und dem Überleben. Darüber hinaus konnten Anwender Endothelzellen und Perizyten in entgegengesetzte Richtungen kultivieren. In diesem Fall kann es notwendig sein, z. B. die Art und Weise, wie die Permeabilitätsmessungen durchgeführt und interpretiert werden, zu ändern. Die Bereitstellung von Schritten für diese Art von Kultur würde jedoch den Rahmen dieses Artikels sprengen.
Eine weitere Herausforderung, auf die man bei der Zellkultur stoßen kann, ist die schnelle Verdunstung von Medien, da die Geräte im Vergleich zu Standard-Gewebekulturplatten und -kolben empfindlicher auf Veränderungen in der Umgebung reagieren können. Wenn eine übermäßige Verdunstung beobachtet oder das Zellwachstum verlangsamt wird, müssen alle kritischen Parameter des Inkubators gemessen werden, um genaue Einstellungen zu gewährleisten. Die Gewebekappe oder die kleine Petrischale, die sich in der Zellkulturkammer befindet, können mit mehr Wasser gefüllt werden, oder die Medien müssen häufiger ausgetauscht werden. Darüber hinaus können Blasen in den unteren Kanal eindringen und im Graben stecken bleiben. Sie können zwar entfernt werden, aber es ist am einfachsten, das Hinzufügen von Blasen von vornherein zu vermeiden. Dazu ist es wichtig, vor dem Pipettieren von Medien in die Bodenkammer zu überprüfen, ob sich keine Blasen in der Pipettenspitze oder Luft am Ende der Pipettenspitze befinden. Darüber hinaus kann die Medienverdunstung im Kanal zu einem Spalt zwischen der Medienoberfläche und der Anschlussoberseite führen. Ein kleines Medienvolumen kann in einen Anschluss pipettiert werden, bis das Medium die Oberfläche des gegenüberliegenden Anschlusses erreicht, woraufhin das Medium in diesem gegenüberliegenden Anschluss ausgetauscht werden kann. Während hECSR- und E6 + 10% FBS-Medien nicht im Wasserbad erwärmt werden sollten, können andere Medien vorgewärmt werden, um die Blasenbildung zu reduzieren. Wenn eine Blase in die untere Kammer gelangt, kann sie entfernt werden, indem schnell 100 μl durch den Kanal pipettiert werden. Diese Methode kann jedoch zu einer Kontamination zwischen den Kammern oder zu Medien führen, die über die Oberfläche des Geräts verschüttet werden. Es kann auch Zellschichten zerstören. Alternativ kann das Medium zuerst aus dem Kanal entnommen und dann mit einem Volumen von 50 μL wieder eingeführt werden. Wenn Sie das Medium zuerst entfernen, kann dies jedoch zu einer stärkeren Blasenbildung im Kanal führen. Wenn sich eine Blase nicht direkt unter dem Membranbereich befindet, kann sie ohne Auswirkungen auf die Zellkultur im Kanal belassen werden.
Die Anheftung und das Wachstum von Perizyten, wie in Abbildung 2 gezeigt, können eine Herausforderung darstellen. Die Verwendung einer optimierten Aussaatdichte ist essentiell für die Bildung einer Schicht mit einem physiologisch relevanten Perizyten-Endothelzell-Verhältnis. Da die Perizyten empfindlich auf Scherung reagieren, sollte der gesamte Medienaustausch im Kanal sehr langsam erfolgen, um die Zellen zu schützen. Bei BPLC-Kulturen kann eine verbesserte Anhaftung erreicht werden, indem die Bodenkammer mit 800 μg/ml Kollagen Typ IV oder 100 μg/ml Fibronektin beschichtet wird.
Die Immunzytochemie in den hier beschriebenen Geräten ermöglicht eine qualitative Analyse der Zellgesundheit und -funktion. Methoden zur Färbung in Gewebekulturplatten oder anderen Plattformen sollten direkt in die Plattform übersetzbar sein. Bei Zellkulturen, die sich nur in der oberen Kammer befinden, kann PBS nach der Fixierung in die untere Kammer gegeben und für die restlichen Schritte belassen werden, wobei die Blockierung und Färbung nur in der oberen Kammer erfolgt. Dies minimiert das Risiko, dass die Membranen brechen oder Blasen in die Bodenkammer gelangen. Für die Co-Kultur-Färbung empfehlen wir, in allen Schritten beide Kammern zu verwenden. Es ist wichtig zu beachten, dass sich die Viskosität des Fixiermittels und PBS von der des Mediums unterscheidet. Daher kann es einfacher sein, Blasen in die untere Kammer zu geben, und es sollte besonders darauf geachtet werden, die Pipettenspitzen am Ende der Spitze auf Luft zu überprüfen, bevor sie in die untere Kammer pipettiert werden.
Das für den niedermolekularen Permeabilitätsassay beschriebene Protokoll ermöglicht eine funktionelle und quantitative Bewertung der Barrierefunktion der im μSiM-Gerät kultivierten Endothelzellen. Ein Problem, das bei diesem Assay auftreten kann, ist das Ziehen von Luftblasen in die Pipette während der Probenentnahme aus dem unteren Kanal in Protokollschritt 4.1.7.4. Um dieses Problem zu vermeiden, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Spitze vor Beginn der Probenentnahme im Anschluss versiegelt ist und die Probe nicht zu schnell entnommen werden sollte. Wenn das Problem dadurch nicht behoben wird, ist die Größe der verwendeten Spitzen möglicherweise zu klein oder zu groß, um in die Anschlüsse zu passen. Verwenden Sie die Tipps, die in der Materialtabelle aufgeführt sind. Werden trotz einer gesund aussehenden konfluenten Monolage unerwartet hohe Permeabilitätswerte gemessen, muss die Integrität der Monoschicht während der Probenentnahme auf Störungen überprüft werden. Wir empfehlen, die Monoschicht immer sofort nach der Probenentnahme unter dem Mikroskop zu überprüfen. Scheint die Monoschicht noch intakt und gesund zu sein, kann die Probe fixiert und biologische Marker der Barrierefunktion bestimmt werden, zum Beispiel durch Immunfärbung der Verbindungsproteine. Umgekehrt ist bei der Messung unerwartet niedriger Permeabilitätswerte darauf zu achten, dass 50 μl Medien ohne Luftblasen aus dem Bodenkanal entnommen werden. Wenn Medium aus der Probenahmeöffnung austritt, sobald die Reservoirspitze platziert wird, muss dieses Medium aufgefangen werden, bevor die Pipette in die Probenahmeöffnung eingesetzt wird, da der größte Teil des fluoreszierenden kleinen Moleküls in dem anfänglichen 10-μl-Volumen vorhanden ist, das aus dem unteren Kanal entnommen wird. Das Zeichnen von Kreisen um die Anschlüsse mit einem hydrophoben Stift oder das Anbringen eines hydrophoben Bandes mit einem Loch um den Anschluss verhindert, dass sich passiv gepumpte Medien ausbreiten. Wenn während der Probenahme Blasen entfernt werden oder die volle 50-μl-Probe nicht entnommen wird, darf die Probe nicht verwendet werden. Alternativ kann das genaue Volumen ermittelt und in der Permeabilitätsberechnung verwendet werden; Dies sollte jedoch nur erfolgen, wenn das entfernte Volumen ≥40 μl beträgt, was einer Farbstoffrückgewinnung von ~98-99% entspricht34.

Lebende Gewebe werden von spezialisierten Zellen abgeschottet, die Barrieren bilden und aufrechterhalten und regulieren, welche Zellen und Moleküle von einem Kompartiment zum anderen transportiert werden. Die Fehlregulation von Barrierefunktionen kann sowohl die Ursache für akute als auch für chronische Erkrankungen sein. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist die restriktivste Gewebeschranke im menschlichen Körper1. Eine Funktionsstörung der BHS liegt einer Vielzahl von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) zugrunde, darunter Alzheimer2, Parkinson3,4 und Multiple Sklerose 5,6. Eine Verletzung der BHS ist auch mit einer langfristigen kognitiven Beeinträchtigung als Folge akuter Erkrankungen wie Sepsis7, COVID-198 und postoperativem Delir9 verbunden. Die Entwicklung von Medikamenten mit dem Potenzial zur Behandlung von Hirnerkrankungen war frustrierend schwierig, da es schwierig war, die BHS absichtlich zu durchbrechen, um bioaktive Moleküle an Ziele im Gehirn zu liefern10. Aus diesen Gründen sind Methoden zur Untersuchung der BHS-Funktion in vitro von größter Bedeutung für das Verständnis und die Behandlung von Erkrankungen des ZNS.
Die grundlegenden Methoden zur Messung der Barrierefunktion in vitro umfassen die Etablierung einer Monoschicht oder Co-Kultur auf einer semipermeablen Membran und die Messung des Widerstands, den Zellen entweder der Diffusion kleiner Moleküle oder kleinen elektrischen Strömen verleihen11,12,13,14. Während das Aufkommen mikrophysiologischer Systeme (MPS) eine Fülle von Möglichkeiten für die Modellierung der BHS in 3D15,16 hervorgebracht hat, macht es die Vielfalt der Systemgeometrien schwierig, Permeabilitätsmessungen zwischen MPS oder mit etablierten Literaturwerten zu vergleichen. Die Etablierung vertrauenswürdiger Ausgangswerte ist besonders wichtig in der BHS-Forschung, wo aufgrund der umfangreichen Barriereregulation durch vaskuläre Endothelzellen des Gehirns die Permeabilitätswerte in vitro genau unter die Lupe genommen werden12,17,18. Aus diesen Gründen werden Permeabilitätsmessungen über Monolagen, die auf 2D-Membranen etabliert wurden, auch in den kommenden Jahren ein fester Bestandteil von BHS-Studien bleiben. Dies gilt auch für andere Gewebebarrieren, einschließlich epithelialer Barrieren, bei denen absolute Werte der Baseline-Permeabilität zur Validierung und zum Vergleich von In-vitro-Modellen verwendet werden 19,20,21.
Mit dem Ziel, ein wertvolles neues Werkzeug für die BBB-Forschungsgemeinschaft zu etablieren, haben wir in den letzten 5 Jahren 22 vorgestellt und23,24,25,26 das Mikrogerätmit einer Sizilon membrane (μSiM)-Plattform für den Einsatz in der Barrieregewebemodellierung weiterentwickelt. Das grundlegende Merkmal der Plattform ist eine ultradünne (<100 nm dicke) Membran mit Hunderten von Millionen Nanoporen 27,28 oder einer Mischung aus Nanoporen und Mikroporen29. Die freistehenden Membranchips werden auf einem 300 μm Silizium-"Chip" hergestellt, der die ultradünnen Strukturen30 stabilisiert und es ermöglicht, sie mit einer Pinzette für die Vorrichtungsmontage zu handhaben. Aufgrund ihrer ultradünnen Beschaffenheit weisen die Membranen eine Permeabilität auf, die um zwei Größenordnungen höher ist als die herkömmlicher spurgeätzter Membranen, die in kommerziellen Membrankulturvorrichtungen verwendet werden31,32. In der Praxis bedeutet dies, dass die Behinderung der Membran für die Diffusion von Molekülen, die kleiner als die Nanoporen sind (<60 nm), vernachlässigbar ist33. Daher bestimmen für zelluläre Barrieren nur die Zellen und die von ihnen abgeschiedenen Matrizen die Geschwindigkeit des Transports kleiner Moleküle von den apikalen zu basalen Kompartimenten, die durch die Membran34 getrennt sind. Das Gerätedesign und die ultradünne Beschaffenheit der Membranen bieten auch für die optische Mikroskopie viele Vorteile. Dazu gehören 1) die Fähigkeit, lebende Kulturen mit Phasenkontrast oder Hellfeld-Bildgebung zu verfolgen, 2) die Fähigkeit, in situ fluoreszierend zu färben und abzubilden, ohne dass die Membran extrahiert und auf ein Deckglas übertragen werden muss, und 3) die Tatsache, dass die Membranen dünner sind als konfokale "Schichten", so dass direkte Co-Kulturen einen natürlicheren Abstand zwischen den Zelltypen haben, als dies mit 6-10 μm dicken spurgeätzten Membranen erreicht werden kann.
Zuletzt haben wir die Plattform zu einem modularen Format weiterentwickelt, um eine schnelle Montage34 und Anpassung35,36 zu ermöglichen. Wir nutzten das modulare Format, um Gerätekomponenten zwischen unseren biotechnischen und kooperierenden Laboren für die Hirnschranke zu verteilen. Anschließend entwickelten wir gemeinsam Protokolle für die Geräteassemblierung, Monokultur und Co-Kultur, Immunfluoreszenzfärbung und Permeabilität kleiner Moleküle und zeigten, dass diese Methoden zwischen Laboren reproduzierbar sind. Unter Verwendung dieser Protokolle haben wir auch gezeigt, dass die modulare Plattform eine validierte BHS unterstützt, die mit der erweiterten Endothelkulturmethode (EECM) entwickelt wurde, um mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) des Gehirns aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu erzeugen37. Ziel des vorliegenden Berichts ist es, diese Methoden genauer zu beleuchten und mit Hilfe des begleitenden Videos eine breitere Akzeptanz der Plattform in der BBB-Community zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 Polyklonaler Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32321</td><td></td></tr><tr><td>Claudin-5 Maus IgG Antikörper, 4C3C2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>Ziege &alpha;-Maus IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Ziege &alpha;-Kaninchen IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>NG2, Maus IgG2a, 9.2.27</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; </td><td></td>MAB2029</tr><tr><td>Occludin Maus IgG Antikörper, OC-3F10</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;, Kaninchen IgG Antikörper, 28E1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3169</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin Maus IgG2B Klon # 123413</td><td>R& D Systems</td><td>MAB9381</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Kaninchen-IgG-Antikörper, polyklonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>40-2200<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Methanol</td><td>VWR</td><td>101443-718</td><td>Kann durch ähnliche Produkte substituiert</td></tr><tr><td>werden 16% Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Kann durch ähnliche Produkte ersetzt werden</td></tr><tr><td>: Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>B27 Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen IV aus der menschlichen Plazenta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen, Typ I Lösung aus dem Rattenschwanz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Kann durch ähnliche Produkte</td></tr><tr><td>ersetzt werden DMEM/Schinken' s F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin aus Rinderplasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin menschliches Protein, Plasma</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>Kann durch ähnliche Produkte ersetzt werden</td></tr><tr><td>hESFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH Dilithiumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861502</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>500627</td><td>Kann durch ähnliche Produkte</td></tr><tr><td>ersetzt werden PBS ohne Calcium, Magnesium</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>Kann durch ähnliche Produkte ersetzt werden</td></tr><tr><td>Pericyte Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td>Verwenden Sie ein komplettes Kit (enthält Nahrungsergänzungsmittel)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin, 10 mg/mL</td><td>ScienCell</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td>Kann durch ähnliche Produkte ersetzt werden</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNasefreies destilliertes Wasser</td><td>Invitrogen&Handel;</td><td>10977015</td><td>Kann durch ähnliche Produkte substituiert werden</td></tr><tr><td>Experimentelle Modelle: Zelllinien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blut-Hirn-Schranke hCMEC/D3-Zelllinie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Gefäßperizyten des menschlichen Gehirns</td><td>ScienCell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 humane induzierte pluripotente Stammzellen</td><td>WiCell</td><td>RRID:CVCL_C437</td><td></td></tr><tr><td>Glas- und Kunststoffwaren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 mm TC-behandelte Zellkulturschale mit 20 mm Gitter</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Klemmen</td><td>VWR</td><td>MFLX06832-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Gewebekulturplatten (6 Well)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Flache 96 Well nicht bindende Mikrotiterplatten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Halterung für Mikroskop-Objektträger&</td><td>nbsp; SiMPore</td><td>USIM-SB</td><td>Abmessungen kompatibel mit Mikropskop-Objektträgerhaltern</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL Konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339653</td><td>Röhrchenkappen können mit Wasser für die Zellkultur befüllt werden</td></tr><tr><td>P20-200 Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>76322-516</td><td>Abweichende Marken dichten möglicherweise nicht so effektiv in den Anschlüssen</td></tr> von <tr><td>Transwell-Filtern (12 Well, 12 mm, 0,4 &mu; Mio. Porengröße, PC)</td><td>CoStar</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Objektiv (für Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD00105</td><td>Luft; WD: 4 mm; NA 0.45</td></tr><tr><td>10X Objektiv (für Nikon)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRP40102</td><td>Luft; WD: 6,2 mm; NA 0.25</td></tr><tr><td>40X Objektiv (LWD) (für Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD77410</td><td>Eintauchen in Wasser; WD: 590-610 mm; NA 1.15</td></tr><tr><td>Andor Konfokales Spinning-Disc-Mikroskop</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS2 Phasenkontrastmikroskop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Kann durch ähnliche Produkte ersetzt</td></tr><tr><td>werden TECAN Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td>Kann durch ähnliche Produkte ersetzt werden</td></tr><tr><td>Andere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced PAP Pen</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z672548</td><td>Spitze 2 mm wird empfohlen</td></tr><tr><td>Montagesatz mit Halterungen</td><td>SiMPore</td><td>USIM-JIGSET</td><td>Einschließlich Halterungen A1, A2, B1 und B2</td></tr><tr><td>Kameraadapter für Mikroskope</td><td>AmScope</td><td>CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR</td><td>&Phi; 23.2 - &Phi; 30 Adapter passend für Nikon Eclipse Ts2</td></tr><tr><td>Canon EOS Rebel SL3 DSLR Kamera</td><td>Canon</td><td>EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001</td><td>Kann durch ähnliche Produkte ersetzt werden</td></tr><tr><td>Zellsieb, 40 & Mikro; m</td><td>Millipore Sigma (Corning)</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Komponente 1</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C1</td><td></td></tr><tr><td>Komponente 2</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Membranchips</td><td>SiMPore</td><td>NPSN100-1L</td><td>Andere Chipformate sind verfügbar</td></tr><tr><td>SMD-Handhabungspinzette Doppelwinkel</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW003</td><td>"Chippinzette"</td></tr><tr><td>Edelstahl Stahl Präzisionspinzette Typ GG</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW534</td><td>"Gerade Pinzette"</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Für die Bildverarbeitung</td></tr><tr><td>Fusion</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td>Anleitung für Version 2.3.0.44</td></tr><tr><td>i-control</td><td>TECAN</td><td></td><td>Anleitung für Version 2.0</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Für die Bildverarbeitung. Anleitung für Version 9.9.0</td></tr></tbody></table>

nutzung der microsim (μsim) barrieregewebeplattform zur modellierung der blut-hirn-schranke

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

Das microSiM (μSiM) ist eine membranbasierte Kulturplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Im Gegensatz zu herkömmlichen membranbasierten Plattformen bietet das μSiM Experimentatoren neue Möglichkeiten, darunter die Bildgebung lebender Zellen, die ungehinderte parakrine Signalübertragung zwischen "Blut"- und "Gehirn"-Kammern und die Möglichkeit, Immunfluoreszenz direkt abzubilden, ohne dass Membranen extrahiert/wieder montiert werden müssen. Hier demonstrieren wir die grundlegende Verwendung der Plattform zur Etablierung von Monokultur- (Endothelzellen) und Kokulturmodellen (Endothelzellen und Perizyten) der BHS unter Verwendung ultradünner nanoporöser Siliziumnitrid-Membranen. Wir zeigen die Kompatibilität sowohl mit primären Zellkulturen als auch mit humanen induzierten pluripotenten Stammzellkulturen (hiPSC). Wir stellen Methoden zur qualitativen Analyse von BHS-Modellen mittels Immunfluoreszenzfärbung zur Verfügung und demonstrieren die Verwendung des μSiM zur quantitativen Bewertung der Barrierefunktion in einem niedermolekularen Permeabilitätstest. Die bereitgestellten Methoden sollen es den Nutzern ermöglichen, ihre Barrieremodelle auf der Plattform zu etablieren und so den Einsatz der Gewebechip-Technologie zur Untersuchung von menschlichem Gewebe voranzutreiben.

Die Montage einer Grabenabsperrvorrichtung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Vorrichtungen führen die Montage der Komponenten und des Membranchips. Komponente 1 besteht in erster Linie aus Acryl mit einer PSA-Oberfläche für die Verklebung mit dem Chip und einer Öffnung zur Bodenkammer und Öffnungen für den Pipettenzugang zur Bodenkammer. Bauteil 2 ist die Kanalschicht und enthält oben rechts ein nicht klebendes, PSA-freies "Dreieck" zum Greifen. Trench-Down-Geräte bieten eine flache Zellkulturwachstumsfläche in der oberen Kammer, während Trench-up-Geräte eine flache Oberfläche für die Zellkultur in der unteren Kammer haben.
Wir führten endotheliale Monokulturen und Co-Kulturen von hCMEC/D3 und HBVPs sowie von hiPSC IMR90-4-abgeleiteten EECM-BMEC-ähnlichen Zellen und BPLCs durch und nahmen Phasenbilder mit einem Nikon Eclipse Ts2 Phasenkontrastmikroskop und einem 10x-Objektiv auf (Abbildung 2). Gezeigt werden optimale Aussaatdichten für primäre Zellkulturen (Bilder 1 Tag nach der Aussaat) sowie unterausgesäte HBVPs (Abbildung 2A). Abschließende Bilder der Kokultur- und Monokulturphase (6-Tage-Endothelzellkultur) können schwer zu unterscheiden sein (Abbildung 2C), und die Bestätigung einer erfolgreichen primären Zell-Kokultur kann eine Immunfluoreszenzfärbung erfordern (siehe Protokollabschnitt 3). Niedrige, hohe und optimale hiPSC-abgeleitete BPLC-Seeding-Dichten sind ebenfalls dargestellt (Abbildung 2B). hiPSC-abgeleitete Kokulturen sind in der Phasenkontrastbildgebung im Vergleich zu primären Kokulturen klarer zu unterscheiden (Abbildung 2D). Eine niedrige BPLC-Aussaat führt zu einer schlechten Perizytenabdeckung und Perizytenverklumpung, während eine Übersaat dazu führt, dass sich die Perizytenschicht von der Membran ablöst. Darüber hinaus kann ein zu schneller Austausch des Mediums in der unteren Kammer zu einem Verlust von Perizyten führen, da diese Zellen sehr empfindlich auf Scherung reagieren. Die optimale Abdeckung durch Perizyten beträgt ~90% für ein BHS-Modell, ohne Lücken in der Endothelschicht.
Repräsentative Bilder einer immungefärbten hiPSC-abgeleiteten Kokultur sind in Abbildung 3 (6 Tage Endothelzellkultur) dargestellt. IMR90-4-abgeleitete BPLCs wurden für den Perizytenmarker PDGFRβ gefärbt, und IMR90-4-abgeleitete EECM-BMEC-ähnliche Zellen wurden für den adhärenten Verbindungsmarker VE-cadherin gefärbt. Hoechst wurde verwendet, um die Kerne zu färben. Die Bilder wurden auf einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop mit einem 40-fachen LWD-Objektiv mit 0,2 μm-Schichten aufgenommen und mit Imaris bearbeitet. Beide Zellschichten können sichtbar gemacht werden, obwohl die dünne Nanomembran nicht zu sehen ist.
Wir führten den Probenahme-basierten Permeabilitätstest für kleine Moleküle unter den gleichen experimentellen Bedingungen in zwei räumlich voneinander entfernten Labors an der Universität Bern, Schweiz, und der University of Rochester, NY, USA, durch, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen den Laboratorien zu demonstrieren (Abbildung 4)34. hiPSC IMR90-4-abgeleitete EECM-BMEC-ähnliche Zellen wurden im μSiM-Gerät für 2, 4 oder 6 Tage und 6 Tage auf Transwell-Filtern kultiviert. Der Assay wurde in beiden Labors mit 150 μg/ml Lucifer Yellow (457 Da) durchgeführt. Eine hohe Variabilität in der Permeabilität der Endothelzellen, die 2 Tage lang im Gerät kultiviert wurden, deutet darauf hin, dass 2 Tage Kultur für die Barrierereifung nicht ausreichten. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Permeabilität zwischen den Laboren bei der Reifung der Barriere - ab 4 Tagen. Wir zeigten auch, dass die Permeabilität der Endothelzellen, die in μSiM- und Transwell-Filtern für 6 Tage kultiviert wurden, mit den zuvor veröffentlichten40 übereinstimmte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig01.jpg"> Abbildung 1: Schritte der μSiM-Montage . (A) Bereiten Sie den Chip vor, indem Sie ihn auf die Halterung A1 legen. Platzieren Sie den Spänegraben nach oben, um eine endgültige Grabenablösung zu erhalten. Legen Sie den Spänegraben nach unten, um ein endgültiges Trench-up-Gerät zu erhalten. (B) Kleben Sie Bauteil 1 mit dem Chip, indem Sie die Schutzmasken von Bauteil 1 entfernen und mit der Vorderseite nach unten in FA1 legen. Verklebung durch Druck mit der Vorrichtung A2. (C) Verkleben Sie die Komponenten 2 und 1, indem Sie die Komponente 2 von ihrer Folie entfernen und die oberen Schutzschichten abziehen. Setzen Sie den Kanal nach oben in die Halterung B1 ein und legen Sie Komponente 1 mit der Vorderseite nach oben auf Komponente 2. Verklebung durch Druck mit der Vorrichtung B2. Abkürzungen: FAn = Fixture An; FBn = Fixture Bn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung der Kokultur und repräsentative Phasenkontrastbilder der Zellkultur in Geräten. (A) Ort der Aussaat von Perizyten- und Endothelzellen. (B) Schematische Darstellung der Zellpositionen entlang des Grabens des Membranchips. (C) Repräsentative Bilder niedriger und optimaler Aussaatdichten für primäre HBVP- und hCMEC/D3-Hirnendothelzelllinien. Die Bilder wurden 1 Tag nach der Aussaat (HBVP) und 2 h nach der Aussaat (hCMEC/D3) aufgenommen. (D) Repräsentative Bilder von niedrigen, hohen und optimalen Seeding-Dichten für hiPSC-abgeleitete Hirnperizyten-ähnliche Zellen. Die Bilder wurden 1 Tag nach der Aussaat aufgenommen. (E) Repräsentative Bilder der endgültigen HBVP- und hCMEC/D3-Kokultur und der hCMEC/D3-Monokultur. Die Bilder wurden 8 Tage nach der HBVP-Aussaat und 7 Tage nach der hCMEC/D3-Aussaat aufgenommen. (F) Repräsentative Bilder von fehlgeschlagenen und erfolgreichen BPLC- und EECM-BMEC-ähnlichen Zell-Kokulturen und EECM-BMEC-ähnlichen Zellmonokulturen. Die Bilder wurden 7 Tage nach der BPLC-Aussaat und 6 Tage nach der EECM-BMEC-Aussaat aufgenommen. Untersäte BPLC-Kulturen haben keine ausreichende Abdeckung, während übersäende BPLC-Kulturen überkonfluent werden und anfangen zu verklumpen/sich zurückzuziehen. Maßstabsbalken = 100 μm (C-F). Abkürzungen: HBVPs = Gefäßperizyten des menschlichen Gehirns; hiPSC = humane induzierte pluripotente Stammzelle; BPLCs = hiPSC-abgeleitete Perizyten-ähnliche Zellen des Gehirns. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Bilder von immungefärbten hiPSC-abgeleiteten Zell-Kokulturen in Geräten. Die Zellen wurden auf den Endothelzellmarker VE-Cadherin (grün), den Perizytenmarker PDGFRβ (rot) und die Kernfärbung (blau) gefärbt. In unmittelbarer Nähe sind zwei Zellschichten zu sehen, die nur durch eine dünne Siliziumnitrid-Nanomembran getrennt sind (weißer Pfeil markiert die Position der Membran im linken Bild). Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: hiPSC = humane induzierte pluripotente Stammzelle; PDGFRβ = Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor beta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig04.jpg"> Abbildung 4: Probenahme-basierter Permeabilitätstest für kleine Moleküle. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs. (B) Demonstration der Reproduzierbarkeit zwischen zwei räumlich entfernten Laboratorien an der Universität Bern (UniBe), Schweiz, und der University of Rochester (UR), NY, USA: hiPSC-abgeleitete Endothelzellen wurden 2, 4 oder 6 Tage lang im μSiM-Gerät und 6 Tage lang in Transwell-Filtern kultiviert. Der Permeabilitätstest wurde mit 150 μg/ml Luzifergelb (457 Da) durchgeführt. Der rote Balken zeigt die zuvor veröffentlichten Daten zur Permeabilität von Natriumfluorescein (376 Da) derselben hiPSC-abgeleiteten Endothelzellen, die 6 Tage lang in Transwellfiltern40 kultiviert wurden. N = 4-16 pro Gruppe. Es wurde eine Zwei-Wege-ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey verwendet, und Vergleiche wurden nur für relevante p &lt; 0,05 angezeigt. (C) Nachweis der Zytokinantwort unter Verwendung von hiPSC-abgeleiteten EECM-BMEC-ähnlichen Zellen, die 2 Tage lang in μSiM kultiviert wurden; 0,1 ng/ml TNFα + 2 IE/ml IFNγ) oder Medienkontrolle (nicht stimuliert, NS) wurde 20 Stunden lang in die obere Kammer gegeben, bevor der Permeabilitätstest mit 150 μg/ml Lucifer Yellow durchgeführt wurde. N = 3 pro Gruppe. Studentischer t-Test, p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Aussaatfläche der oberen Kammer</td>
			<td>Top-Well-Volumen</td>
			<td>Aussaatfläche der unteren Kammer</td>
			<td>Lautstärke des unteren Kanals</td>
		</tr><tr><td>~37 Millimeter2</td>
			<td>100 μl (fasst ≥115 μl)</td>
			<td>~42 Millimeter2</td>
			<td>10 μl (Pipette 20 μl, um Blasen zu vermeiden)</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Kritische μSiM-Oberfläche und -Volumina.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Ziel</td>
			<td>Fixiermittel</td>
			<td>Blockierende Lösung</td>
			<td>Verdünnung</td>
		</tr><tr><td>VE-Cadherin</td>
			<td>4 % PFA oder 100 % MeOH</td>
			<td>5 % GS + 0,4 % Tx-100 oder 10 % GS + 0,3 % Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>CD31-KARTON</td>
			<td>4 % PFA oder 100 % MeOH</td>
			<td>5% GS + 0,3-0,4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Claudin-5</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>ZO-1-KARTON</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Okkludin</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>PDGFRβ</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5 % GS + 0,4 % Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>NG2-KARTON</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5 % GS + 0,4 % Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Ziege α-Maus IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Ziege α-Maus IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Antikörper und Färbemethoden, die für die Kokultur-Immunzytochemie in μSiM-Geräten validiert wurden. Abkürzungen: PFA = Paraformaldehyd; MeOH = Methanol; GS = Ziegenserum.
Ergänzungsdatei 1: Vorlage zur Berechnung des Permeabilitätswertes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258_SupplementalFile_SamplingCalcTemplate_Updated.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieser Bericht enthält Protokolle für den Aufbau, die Zellkultur und die Assays auf der μSiM-Plattform für den Aufbau von Blut-Hirn-Schrankenmodellen.

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Wir entwickeln ein Gewebe-GI-Modell der Blut-Hirn-Schranke, um die Auswirkungen der Sepsis auf das Gehirn und den Beitrag von durch Blut übertragenen Faktoren zu verstehen. Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen. Wir planen, den Beitrag genetischer Faktoren zur Anfälligkeit bestimmter Patientenpopulationen zu untersuchen.Aktuelle experimentelle Herausforderungen innerhalb der Tissue-Chip-Community sind die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und die Übernahme von Techniken durch externe Labore. Einzigartige Tissue-Chip-Designs, kleine Volumina innerhalb von Tissue-Chips und das Fehlen von funktionellen Standardassays tragen zu diesen Herausforderungen bei und beschränken die Anwender oft auf fluoreszenzbasierte Assays als primären Output. Mikro-Simm-Geräte bieten Modularität für vielseitige In-vitro-Modellierung, eine Glaslichtoberfläche, die sich ideal für hochauflösende Lifestyle-Bildgebung eignet, und eine hochproduzierte Ultra-Syn-100-Nanometer-Nanomembran, die ein nahtloses Übersprechen löslicher Faktoren und präzise Permeabilitätsassays gewährleistet.Mit dem Mikro-Simm haben wir gesehen, dass bestimmte Zelltypen dazu neigen, mehr von den Matrixproteinen zu produzieren, die ein unterstützendes Gerüst um die Blutgefäße des Gehirns bilden. Jetzt können wir uns fragen, ob Entzündungen dazu führen, dass dieselben Zellen ihre Matrizen stärken oder abbauen und dadurch die Integrität der Barriere verändern. In Zukunft werden wir das Modell um ein weiteres Kompartiment mit grünen Zellen wie Astrozyten und Mikroglia erweitern, um zu untersuchen, wie diese Zellen bei systemischen Entzündungen wie Sepsis mit der Blut-Hirn-Schranke interagieren.Wir planen auch, weitere Ursachen systemischer Entzündungen wie postoperatives Delir zu untersuchen, das mit Demenz überlagert ist.

use-microsim-sim-barrier-tissue-platform-for-modeling-blood-brain

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Einrichtung von Menschenmodelle der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​kann die Forschung in Gehirn Bedingungen mit BBB Versagen profitieren. Wir beschreiben hier ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Kontakt BBB Modell, das Co-Kultur von Astrozyten und menschlichen Endothelzellen des Gehirns auf den gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran erlaubt.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

Hier beschreiben wir ein in vitro Mausmodell der Blut-Hirn-Schranke, das Impedanzzellspektroskopie verwendet, mit einem Schwerpunkt auf den Auswirkungen auf die Integrität und Permeabilität von Endothelzellen bei Interaktion mit aktivierten T-Zellen.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

Isolierte Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe dient als ein präklinischen Modell Barrierefunktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein optimiertes Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe zu isolieren.

Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll beschreibt die Einstellung einer in Cellulo BBB (Blut-Hirn-Schranke)-Minibrain aus Polyester poröse Membran Kultur einfügen System um den Transport von Biomolekülen oder infektiöse Erreger über eine menschliche BBB zu bewerten und ihre physiologische Wirkung auf die benachbarten Gehirnzellen.

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine multizelluläre neurovaskuläre Einheit, die die Homöostase des Gehirns streng reguliert. Durch die Kombination menschlicher iPSCs und Organ-on-Chip-Technologien haben wir einen personalisierten BBB-Chip entwickelt, der für die Krankheitsmodellierung und Diedurchlässigkeitsvorhersagen von CNS-Medikamenten geeignet ist. Für die Erzeugung und den Betrieb des BBB-Chips wird ein detailliertes Protokoll beschrieben.

Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Etablierung eines menschlichen Blut-Hirn-Schranken-Modells (BBB). Die Endothelzellen und Perizyten werden auf jeder Seite eines Einsatzfilters (Blutkompartiment) ausgesät, und Astrozyten werden in der unteren Vertiefung (Gehirnkompartiment) ausgesät. Das charakterisierte Modell wurde für Nanopartikeltransportexperimente verwendet.

Ein Dreifachkulturzellsystem, das die menschliche Blut-Hirn-Schranke modelliert

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer stabilen und gesunden Gehirnumgebung. Die BHS-Dysfunktion ist mit vielen neurologischen Erkrankungen verbunden. Wir haben ein 3D-Stammzellmodell der BHS entwickelt, um die zerebrovaskuläre Pathologie, die Integrität der BHS und die Veränderung der BHS durch Genetik und Krankheit zu untersuchen.

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

Dieses Protokoll beschreibt eine rekonfigurierbare membranbasierte Zellkulturplattform, die das Open-Well-Format mit Flüssigkeitsflussfunktionen integriert. Diese Plattform ist mit Standardprotokollen kompatibel und ermöglicht reversible Übergänge zwischen Open-Well- und mikrofluidischen Kulturmodi, um den Anforderungen von Ingenieur- und Biowissenschaftslabors gerecht zu werden.

Umwandlung von statischen Barrieregewebemodellen in dynamische mikrophysiologische Systeme

Erfahren Sie die Modellierung der Blut-Hirn-Schranke mit der MicroSiM-Plattform unter Verwendung menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Sepsis-Effekten auf die Gehirnfunktion.

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

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