Name: Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Erfahren Sie die magnetische Isolierung von lymphatischen Endothelzellen aus der Mäusedermis für physiologische In-vitro-Studien. Diese Methode bietet eine praktikable Alternative zur FACS-Sortierung und ermöglicht die Gewinnung hochreiner Zellen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Hellenic Foundation for Research and Innovation (00376), den National Institutes of Health, dem National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], dem Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) School of Pharmacy Office of the Sciences Grant (an C.M.M.) und durch die Anschubfinanzierung des College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe. die National Institutes of Health (NIH) über das National Institute of General Medical Science [Grant P20 GM103424-21] und das Research Competitiveness Subprogram (RCS) des Louisiana Board of Regents über den Board of Regents Support Fund (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (an G.M.). Die gängigen TTUHSC-Geräte wurden über die Grants RP190524 und RP200572 des Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) bezogen. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, bei der Entscheidung über das Verfassen oder bei der Erstellung des Manuskripts. Die grafische Zusammenfassung in Abbildung 1A wurde mit BioRender.com erstellt.

Isolierung von Endothelzellen aus dermalen Lymphkapillaren der Maus

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<li>Regina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+ageing+and+endothelial+cell+senescence%3A+Molecular+mechanisms+of+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).</li>
<li>Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+sprouting%2C+proliferation%2C+or+senescence%3A+tipping+the+balance+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Das Lymphsystem ist ein wichtiger Regulator der homöostatischen Funktion des Körpers, wobei die wichtigsten Funktionen die Aufrechterhaltung des flüssigen Plasmas, die Entfernung von Nebenprodukten des Zellstoffwechsels und toxischen Molekülen, die Lipidabsorption und der Transport von Immunzellen sind 1,19. Die Identifizierung geeigneter Marker hat zu einer Flut neuer Daten auf dem Gebiet der Lymphgefäße geführt, die neue Funktionen der lymphatischen Gefäße aufz...

Das Lymphsystem spielt eine zentrale Rolle in der menschlichen Physiologie. Es gilt als lebenswichtiger homöostatischer Faktor, der wichtige Funktionen wie die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen Gewebe und Plasmaflüssigkeit, die Immunüberwachung und die Lipidabsorption1 sowie kürzlich identifizierte Funktionen wie die Reparaturfähigkeit des Herzens2 und die Regenerationsfähigkeit des Knochens und die Hämatopoese3 erleichtert. Trotz der bedeutenden Rolle des lymphatischen Systems bleiben mehrere Aspekte der Rolle der Lymphgefäße sowie die molekularen Mechanismen, die bestimmte physiologische Parameter und Reaktionen steuern, schwer fassbar. Darüber hinaus sind lymphatische Gefäßdefekte auslösende oder verschlechternde Faktoren bei bestimmten pathophysiologischen Zuständen. Bekannte Beispiele sind die primären und sekundären Lymphödeme, abhängig von der genetischen bzw. nicht-genetischen Ursache der Krankheit, während die Rolle des lymphatischen Systems für das Wachstum des Primärtumors und die Metastasierung von zentraler Bedeutung ist, da es als Kanal für die Metastasierung und als Modulator der Immunfunktionen fungieren kann1.
Die Verzögerung in der Erforschung und dem Wissen über das lymphatische System im Vergleich zu den Blutgefäßen ist hauptsächlich auf die spätere Entdeckung des lymphatischen Systems im Vergleich zum Blutgefäßsystem und die Verzögerung bei der Identifizierung lymphatischer spezifischer molekularer Marker zurückzuführen. Dies hat sich in den letzten Jahrzehnten stark verbessert, was zu einer Veränderung des herkömmlichen Bildes der Lymphgefäße im stationären Zustand und unter kranken Zuständen führte1. Ähnlich wie die Angiogenese ist die Lymphangiogenese die Bildung neuer Lymphgefäße aus bereits bestehenden und spielt eine zentrale Rolle bei der Entwicklung eines breiten Spektrums von Krankheiten 4,5,6. Im Gegensatz zur Angiogenese beschränkte sich die Untersuchung der Lymphangiogenese jedoch bisher auf meist in vivo Modelle, die sich auf die Entwicklung der Gefäßbildung und strukturelle Defekte in pathologischen Modellen konzentrierten. Die Isolierung der lymphatischen Endothelzellen ist wichtig für in vitro Studien, und dies kann durch das vorgestellte Protokoll gewährleistet werden.
Es wurden mehrere Protokolle für die lymphatische endotheliale Isolierung von Mäusen entwickelt, die den Einsatz von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung erfordern7. Der Vorteil des Zellsortierers, sofern verfügbar, ist der höhere Reinheitsgrad im Gegensatz zur Bead-basierten Isolierung, wobei letztere eine höhere Ausbeute bietet. Das Protokoll nutzt die Expression des lymphatischen endothelialen Hyaluronan-Rezeptors 1 (LYVE-1), eines lymphatischen Endothelmarkers, der für den Zelltransport innerhalb der lymphatischen Gefäße wichtig ist 4,8. Da die Expression von LYVE-1 auf die lymphatischen Kapillaren und nicht auf die sammelnden Lymphgefäße beschränkt ist, eignet sich die Technik für die Isolierung von lymphatischen Endothelzellen spezifisch aus den lymphatischen Kapillaren, im Gegensatz zu anderen lymphatischen Markern wie Podoplanin, die in allen lymphatischen Endothelzellen einheitlich exprimiert werden9. Für das Protokoll wurden andere wichtige lymphatische Marker, die nicht transmembran waren, wie z. B. Prox1, ausgeschlossen.
Da das physiologische Ergebnis die Lymphangiogenese war, die normalerweise an den lymphatischen Kapillaren initiiert wird, wurde LYVE-1 aufgrund seiner Selektivität in diesen Zellen und der hohen Ausbeute des ausgewählten Antikörpers als Ziel ausgewählt. Bei den verwendeten Enzymen handelte es sich um Kollagenase Typ II, von der allgemein bekannt ist, dass sie bei der Kollagendissoziation wirksamer ist als Typ I10, und Dispase, eine breitere Protease, die regelmäßig für die Trennung von Dermis-Epidermis verwendet wird11; Es wurde jedoch auch über andere Enzyme für die Gewebetrennung berichtet12,13 und die verwendet werden können. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen aus lymphatischen Kapillaren adulter Mäuse mit hoher Ausbeute unter Verwendung der magnetischen Bead-Reinigung zu beschreiben, insbesondere an Orten, an denen eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung nicht ohne weiteres verfügbar ist. Die Methode eignet sich für Anwendungen, bei denen die Reinheit der lymphatischen Endothelzellen für nachgelagerte Anwendungen beeinträchtigt werden kann.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Gewebekulturschalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Gewebekulturschalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012921</td><td></td></tr><tr><td>Tierhaarschneider</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotisch-antimykotische Lösung 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Stumpfe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11992-20</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb 40 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagen I, hochkonzentriertes Rattenschwanz-Corning</td><td></td><td>354249</td> in <td>0,02 M verdünnte Essigsäure in H2O</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-995-073</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I-Lösung (2.500 U/ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td>90083</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-L Magnetpulverkonzentrator</td><td>Invitrogen</td><td>120-21D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td></td></tr><tr><td>Basisbasis für das Wachstum von Endothelzellen Ergänzung (LEC medium)</td><td>R& D Systems</td><td>CCM027</td><td></td></tr><tr><td>Euthanasiekammer</td><td>Euthanex Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere-Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-Maus F4/80 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>123107</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Magnetische Perlen</td><td>New England Biolabs</td><td>S1432S</td><td></td></tr><tr><td>LARC-A E-Z Anästhesie-Induktionskammer</td><td>Euthanex Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagnaBind Ziege Anti-Kaninchen-IgG-Perlen</td><td>Thermo Scientific</td><td>21356</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Lösung 4% in PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Maus LYVE-1</td><td>ReliaTech GmbH</td><td>103-PA50</td><td></td></tr><tr><td>Rotierender/Schüttel-Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter w 0,2 &mu; m Poren</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-300-120</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von dermalen lymphatischen endothelzellen der maus

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

Das lymphatische System ist an der Regulierung der Immunüberwachung, der Lipidabsorption und des Flüssigkeitshaushalts des Gewebes beteiligt. Die Isolierung von murinen lymphatischen Endothelzellen ist ein wichtiger Prozess für die lymphatische Forschung, da sie die Durchführung von in vitro und biochemischen Experimenten an den isolierten Zellen ermöglicht. Darüber hinaus hat die Entwicklung der Cre-lox-Technologie den gewebespezifischen Mangel an Genen ermöglicht, die nicht global anvisiert werden können, was zur genauen Bestimmung ihrer Rolle in den untersuchten Geweben führt. Die Aufschlüsselung der Rolle bestimmter Gene in der lymphatischen Physiologie und Pathophysiologie erfordert die Verwendung von lymphatischen Promotoren und damit die experimentelle Überprüfung der Expressionsniveaus der Zielgene.
Methoden zur effizienten Isolierung von lymphatischen Endothelzellen aus Wildtyp- oder transgenen Mäusen ermöglichen den Einsatz von ex vivo und in vitro Assays, um die Mechanismen zu untersuchen, die die lymphatischen Funktionen regulieren, und die Identifizierung der Expressionsniveaus der untersuchten Proteine. Wir haben ein Protokoll für die effiziente Isolierung von murinen dermalen lymphatischen Endothelzellen (DLECs) mittels magnetischer Bead-Aufreinigung auf Basis der LYVE-1-Expression entwickelt, standardisiert und vorgestellt. Das skizzierte Protokoll zielt darauf ab, den Forschern ein Werkzeug an die Hand zu geben, um wichtige Akteure der lymphatischen Endothelzellfunktionen besser zu verstehen und aufzuklären, insbesondere in Einrichtungen, in denen keine fluoreszenzaktivierten Zellsortiergeräte zur Verfügung stehen.

Die Methode wurde entwickelt, um die Proteinexpression einer kleinen GTPase, RhoA, zu identifizieren, deren kodierendes Gen in beiden Allelen gefloxt und unter der Wirkung des Tamoxifen-induzierbaren lymphatischen endothelspezifischen Promotors Prox1-CreERT2 18 deletiert wurde. Die isolierten LECs können bis zu vier Generationen lang kultiviert werden, danach werden sie seneszent. Sie wurden eingefroren, aufgetaut und erfolgreich mit Angiopoietin-2 stimuliert. Aufgrund der begr...

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

Die Forschung unserer Gruppe konzentriert sich auf die Beschreibung der Mechanismen, die die Physiologie der Endothelzellen regulieren. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von renalen Endothelzellen, insbesondere aus thermischen lymphatischen Kapillaren in Einrichtungen, in denen eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung nicht verfügbar ist. Das Protokoll ermöglicht die Isolierung von lymphatischen Endothelzellen aus transgenen Mäusen, um deren Physiologie in vitro zu untersuchen.Es eignet sich besonders dort, wo die Reinheit der lymphatischen Endothelzellen für Downstream-Anwendungen beeinträchtigt werden kann. Dieser Prozess sorgt für eine hohe Ausbeute an lymphatischen Endothelzellen, die aus den lymphatischen Kapillaren und nicht aus anderen Sammelgefäßen gewonnen werden. Es ist auch eine schöne Alternative, wenn keine Zellsortiereinrichtungen vorhanden sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Die Isolierung von Lymphknotenstromazellen ist ein mehrstufiges Verfahren, das enzymatische Verdauung und mechanische Disaggregation umfasst, um fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische und Blutendothelzellen zu erhalten. Bei dem beschriebenen Verfahren wird ein kurzer Verdau mit einer automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um den Oberflächenmarkerabbau lebensfähiger Lymphknotenstromazellen zu minimieren.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Das Ziel des Protokolls ist es, lymphatische Endothelzellen menschlicher Lymphmissbildung zystenartige Gefäße und Vorhaut mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert werden. Anschließende Zellkultur und Expansion dieser Zellen ermöglicht eine neue Stufe der experimentellen Raffinesse für genetische, Proteomik, funktionale und Zelldifferenzierung Studien.

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Das Verhalten von Fibroblasten liegt einem Spektrum klinischer Entitäten zugrunde, aber sie bleiben schlecht charakterisiert, hauptsächlich aufgrund ihrer inhärenten Heterogenität. Die traditionelle Fibroblastenforschung beruht auf In-vitro-Manipulation, um das Verhalten von Fibroblasten in vivo zu maskieren. Wir beschreiben ein FACS-basiertes Protokoll für die Isolierung von Hautfibroblasten der Maus, das keine Zellkultur erfordert.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Dieses Protokoll beschreibt die enzymatische Verdauung von Maushaut in nährstoffreichem Medium, gefolgt von einer Gradiententrennung, um Leukozyten zu isolieren.  Die so abgeleiteten Zellen können für vielfältige nachgelagerte Anwendungen eingesetzt werden. Dies ist eine effektive, wirtschaftliche und verbesserte Alternative zu Gewebedissoziationsmaschinen und härteren Trypsin- und Dispase-basierten Gewebeverdauungsprotokollen.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Isolierung myeloischer Zellen aus der Maushaut und der Drainage von Lymphknoten nach intradermaler  Injektion von Plasmodium-Sporozoiten. Die Durchflusszytometrie der gesammelten Zellen bietet einen zuverlässigen Assay zur Charakterisierung der Entzündungsreaktion der Haut und der Drainage von Lymphknoten auf den Parasiten.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Das Ziel dieses Protokolls ist, lymphatische Endothelzellen Populationen innerhalb der Leber mit den beschriebenen Markern zu identifizieren. Wir nutzen Kollagenase IV und DNase und eine sanfte Zerkleinerung des Gewebes, kombiniert mit Durchflusszytometrie, um eine verschiedene Bevölkerung der lymphatische endothelial Zellen zu identifizieren.

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Mikrovaskuläre Endothelzellen der Skelettmuskulatur (MMEC) prägen die Innenwand des Muskels Kapillaren und regulieren, Austausch von Flüssigkeiten/Moleküle und Migration (Immunzellen) zwischen Blut und Muskelgewebe. Isolierung der primären murinen MMEC, ermöglicht wie hier beschrieben umfassende in-vitro-Untersuchungen des Referats"Myovascular".

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs), ein kürzlich identifizierter intrakranieller Zelltyp, haben nur unzureichend verstandene Funktionen. In dieser Studie wird ein reproduzierbares Protokoll für die Entnahme von LLECs aus  Mäusen und die Etablierung von In-vitro-Primärkulturen vorgestellt. Dieses Protokoll soll es Forschern ermöglichen, sich mit den zellulären Funktionen und möglichen klinischen Auswirkungen von LLECs zu befassen.

Gewinnung und Primärkultur von leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen

Erfahren Sie die magnetische Isolierung von lymphatischen Endothelzellen aus der Mäusedermis für physiologische In-vitro-Studien. Diese Methode bietet eine praktikable Alternative zur FACS-Sortierung und ermöglicht die Gewinnung hochreiner Zellen.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

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