Name: Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in Polyethylenglykol-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Lernen Sie die schnelle Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in PEG-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen. Diese kostengünstige Methode erfordert keine spezialisierte Ausrüstung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch Startkapital finanziert, das Dr. Silviya P. Zustiak von der Saint Louis University zur Verfügung gestellt wurde, sowie durch ein Anschubstipendium des Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience an der Saint Louis University, das Dr. Silviya P. Zustiak gewährt wurde.

Herstellung mit anschließender 3D-Verkapselung von Tumorsphäroiden in PEG-Hydrogelen

<ol><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+formation+on+non-adhesive+surfaces+by+liquid+overlay+technique%3A+Considerations+and+practical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417(2018).</li>
<li>Li, Y., Kumacheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microenvironments+for+cancer+spheroid+growth+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drug screening.</a> Science Advances. 4 (4), eaas8998(2018).</li>
<li>Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+synthetic+biomaterials+for+engineering+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids.</a> Polymers. 12 (11), 2506(2020).</li>
<li>Wang, C., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+3D+brain+tumor+model+to+elucidate+the+effects+of+matrix+stiffness+on+glioblastoma+cell+behavior+using+PEG-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).</li>
<li>Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biomimetic+hyaluronic+acid+hydrogels+to+investigate+glioblastoma+stem+cell+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+scaffolds+for+3D+culture+demonstrate+extracellular+matrix-mediated+mechanisms+of+chemotherapy+resistance+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma.</a> Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).</li>
<li>Pedron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid-functionalized+gelatin+hydrogels+reveal+extracellular+matrix+signals+temper+the+efficacy+of+erlotinib+against+patient-derived+glioblastoma+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens.</a> Biomaterials. 219, 119371(2019).</li>
<li>Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+matrix+presence+and+composition+influence+drug+responses+of+encapsulated+glioblastoma+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).</li>
<li>Chen, J. -W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+microglia+and+patient-derived+glioblastoma+cells+inhibit+invasion+in+a+three-dimensional+gelatin+hydrogel+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346(2020).</li>
<li>Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials-based+approaches+to+tumor+spheroid+and+organoid+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980(2018).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-marine+collagen-agarose+composite+hydrogels+as+matrices+for+biomimetic+3D+cell+spheroid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation.</a> RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).</li>
<li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li>
<li>Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Templated+macroporous+polyethylene+glycol+hydrogels+for+spheroid+and+aggregate+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).</li>
<li>Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+size-controlled+glioma+spheroids+using+agarose+hydrogel+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells.</a> PLoS One. 14 (1), e0211078(2019).</li>
<li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+numbers+of+size-controlled+tumor+spheroids+using+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665(2013).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTimmins%2C+NE+%22Generation+of+Multicellular+Tumor+Spheroids+by+the+Hanging-Drop+Method%22">Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method</a>. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+printed+hanging+drop+dripper+for+tumor+spheroids+analysis+without+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19717(2019).</li>
<li>Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605(2017).</li>
<li>Gencoglu, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+multicellular+tumor+spheroid+formation+methods+and+implications+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).</li>
<li>Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+brain+tissue+based+on+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of brain tissue based on microstructure.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924(2021).</li>
<li>Alifieris, C., Trafalis, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+Pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment.</a> Pharmacology & Therapeutics. 152, 63-82 (2015).</li>
<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolytically+degradable+poly+%28ethylene+glycol%29+hydrogel+scaffolds+with+tunable+degradation+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hydrolytically degradable poly (ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties.</a> Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).</li>
<li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-hydrogel+interactions+in+tissue+engineering%3A+Mechanisms+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).</li>
<li>Kroger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+hydrolytically+degradable+polyethylene+glycol+crosslinkers+for+facile+control+of+hydrogel+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Design of hydrolytically degradable polyethylene glycol crosslinkers for facile control of hydrogel degradation.</a> Macromolecular Bioscience. 20 (10), 2000085(2020).</li>
<li>Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+engineered+PEG+hydrogels%3A+a+novel+model+system+for+proteolytically+mediated+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).</li>
<li>Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+spheroid+growth+and+chemotherapeutic+responses+in+single+and+dual-stiffness+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels.</a> Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shooting+for+the+moon%3A+using+tissue-mimetic+hydrogels+to+gain+new+insight+on+cancer+biology+and+screen+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Communications%22%5BJournal%5D)">Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics.</a> MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).</li>
<li>Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+polyethylene+glycol-based+hydrogel+microspheres+through+electrospraying%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Materials+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).</li>
<li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).</li>
<li>Lee, K. -H., Kim, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+multicellular+tumor+spheroid+generation+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening.</a> Biosensors. 11 (11), 445(2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hydrogel-basierte multizelluläre Tumor-Sphäroidmodelle werden zunehmend entwickelt, um die Entdeckungen der Krebstherapie voranzutreiben 11,13,29. Sie sind vorteilhaft, weil sie Schlüsselparameter der Tumormikroumgebung auf kontrollierte Weise emulieren und trotz ihrer Komplexität einfacher und kostengünstiger zu verwenden sind als In-vivo-Modelle, und viele sind mit Hochdurchsatz-Screening-Technologien kompatibel. Die Hydrogel-...

Tumorsphäroide haben sich als nützliche In-vitro-Werkzeuge bei der Untersuchung der Ätiologie, Pathologie und des Ansprechens auf Medikamente bei Krebserwiesen 1. Traditionell wurden Sphäroide unter Bedingungen wie Platten mit geringer Adhäsion oder Bioreaktoren kultiviert, bei denen die Zell-Zell-Adhäsion gegenüber der Zell-Oberflächen-Adhäsion bevorzugt wird2. Es ist jedoch inzwischen anerkannt, dass In-vitro-Sphäroidmodelle sowohl Zell-Zell- als auch Zell-Matrix-Interaktionen erfassen sollten, um die Tumormikroumgebung originalgetreuer zu rekapitulieren. Dies hat mehrere Gruppen dazu veranlasst, Gerüste wie Hydrogele zu entwickeln, in denen Sphäroide eingekapselt werden können 3,4. Solche Hydrogel-basierten Sphäroidmodelle ermöglichen die Aufklärung von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen auf verschiedene Zellverhaltensweisen, wie z. B. Lebensfähigkeit, Proliferation, Stammzellen oder Therapieansprechen3.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verkapselung von Glioblastom-Sphäroiden in Polyethylenglykol (PEG)-Hydrogelen. Es gibt mehrere Literaturberichte über die Verkapselung von Glioblastomzellen mit Sphäroiden in Hydrogelen. Zum Beispiel wurden Sphäroide durch Verkapselung von U87-Zellen in PEG-Hydrogelen gebildet, die mit einem RGDS-Adhäsivliganden dekoriert und mit einem enzymatisch spaltbaren Peptid vernetzt wurden, um die Wirkung der Hydrogelsteifigkeit auf das Zellverhalten zu bestimmen5. U87-Zellen wurden auch in anderen PEG-basierten oder Hyaluronsäure-basierten Hydrogelen gebildet, um die Krebsstammzellpopulationzu erweitern 6 oder um matrixvermittelte Mechanismen der Chemotherapieresistenz zu erforschen 7,8,9. Glioblastom-Sphäroide wurden auch in Gelatine-Hydrogelen eingekapselt, um die Wechselwirkung zwischen Mikroglia und Krebszellen und ihre Wirkung auf die Zellinvasion zu untersuchen10. Insgesamt haben solche Studien den Nutzen von Hydrogel-basierten In-vitro-Modellen für das Verständnis der Glioblastompathologie und die Entwicklung von Behandlungen gezeigt.
Darüber hinaus gibt es verschiedene Verfahren zur Herstellung von Tumorsphäroiden und zur Hydrogelverkapselung11. Zum Beispiel könnten dispergierte Zellen in Hydrogele ausgesät werden und im Laufeder Zeit Sphäroide bilden 5,12. Ein Nachteil einer solchen Methode ist die Polydispersität der gebildeten Sphäroide, die zu unterschiedlichen Zellreaktionen führen könnte. Um einheitliche Sphäroide herzustellen, könnten Zellen in Mikrogele eingekapselt und über längere Zeiträume kultiviert werden, bis sie in das Gel13 eindringen und es umgestalten, oder Zellen könnten in vorgefertigten Gelen mit kugelförmigen "Löchern" abgelagert und aggregiert werden14. Der Nachteil dieser Methoden ist ihre relative Komplexität, die Notwendigkeit eines Tröpfchengenerators oder anderer Mittel, um Mikrogele oder die "Löcher" im Gel zu bilden, und die Zeit, die Sphäroide benötigen, um zu wachsen und zu reifen. Alternativ könnten Sphäroide in Mikrovertiefungen9, 15, 16 oder in hängenden Fallplatten17, 18 vorgeformt und dann in einem Hydrogel eingekapselt werden, ähnlich der hier beschriebenen Technik. Diese Methoden sind einfacher und können mit höherem Durchsatz durchgeführt werden. Interessanterweise wurde gezeigt, dass die Methode der Sphäroidbildung das Verhalten von Sphäroidzellen beeinflussen kann, wie z. B. die Genexpression, die Zellproliferation oder das Ansprechen auf Medikamente19,20.
Hier konzentrieren wir uns auf das Glioblastom, da es sich um einen soliden Tumor handelt, dessen natürliche Umgebung die weiche, nanoporöse Gehirnmatrix21 ist, die von einem weichen, nanoporösen Hydrogel nachgeahmt werden kann. Das Glioblastom ist auch der tödlichste Hirntumor, für den es keine verfügbare Heilung gibt22. Das hier beschriebene Protokoll kann jedoch für die Verkapselung von Sphäroiden verwendet werden, die einen soliden Tumor darstellen. Wir haben uns für die Verwendung von PEG-Hydrogelen entschieden, die durch eine Additionsreaktion vom Michael-Typ gebildet werden23. PEG ist ein synthetisches, nicht abbaubares und biokompatibles Hydrogel, das inert ist und als Gerüst und physikalische Zellunterstützung dient, aber keine Zellanhaftung unterstützt23. Die Zelladhäsion kann separat durch Tethering ganzer Proteine oder adhäsiver Liganden24 hinzugefügt werden, und die Abbaubarkeit kann durch chemische Modifikationen der PEG-Polymerkette oder hydrolytisch oder enzymatisch abbaubare Vernetzer 25,26 hinzugefügt werden. Dadurch können biochemische Eigenschaften unabhängig von mechanischen oder physikalischen Hydrogeleigenschaften eingestellt werden, was bei der Untersuchung von Zell-Matrix-Wechselwirkungen von Vorteil sein könnte. Die Gelierungschemie vom Michael-Typ ist selektiv und findet unter physiologischen Bedingungen statt; Daher ermöglicht es eine Sphäroidverkapselung durch einfaches Mischen der Sphäroide mit der Hydrogel-Vorläuferlösung.
Insgesamt weist die hier vorgestellte Methodik mehrere bemerkenswerte Merkmale auf. Erstens ist die Herstellung von Tumorsphäroiden in einer Multiwell-Baugruppe effizient, schnell und die Kosten für die erforderlichen Materialien sind niedrig. Zweitens werden die Sphäroide in großen Chargen in einer Vielzahl von Größen mit geringer Polydispersität hergestellt. Schließlich werden nur handelsübliche Materialien benötigt. Der Nutzen der Methodik wird durch die Untersuchung der Auswirkungen der Substrateigenschaften auf die Lebensfähigkeit von Sphäroidzellen, die Zirkularität und die Zellstammzellen veranschaulicht.

<table><tbody><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>LC22210-4</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conicals</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte Ultra Low Attachment Platten</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischale</td><td>Amazon</td><td>706011</td><td></td></tr><tr><td>4-armiges Poly(ethylenglykol)-acrylat (4-armiges PEG-Ac; 10 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-10K-5g</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conicals</td><td>Fisher Scinetific</td><td></td><td></td>3181345107</tr><tr><td>6-fach AggreWell 400&nbsp;</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Kanada</td><td>34421</td><td>Quadratische pyramidenförmige Mikrovertiefungen&nbsp;</td></tr><tr><td>Spüllösung gegen Adhärenz</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Kanada</td><td>Katze #: 07010</td><td></td></tr><tr><td>Asparaginsäure-Arginin-Cystein-Glycin-Valin-Prolin-Methionin-Serin-Methionin-Arginin-Glycin-Cystein-Arginin-Asparaginsäure (DRCG-VPMSMR-GCRD) Peptid</td><td>Genic Bio, Shanghai, China</td><td>n/a</td><td>Kundenspezifische</td></tr><tr><td>Synthese Chemischer Abzug</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basalmembran-Matrix, LDEV frei&nbsp;</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Basalmembran-Matrix-Waschmittel</td></tr><tr><td>- Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>Nichtionisches Tensid</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Einwegpipetten (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td><td>Fisher Scinetific</td><td>1 mL: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml(FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37% Lösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Glasplatten</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>Glastransferpipetten</td><td>Fisher Scinetific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>Glycin-Arginin-Cystein-Asparaginsäure-Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Serin (GRCD-RGDS) Peptid</td><td>Genic Bio, Shanghai, China</td><td>n/a</td><td>Kundenspezifische Synthese</td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobe Lösung - Silan abstoßen&nbsp;</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanin-Perchlorat)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D1125</td><td></td></tr><tr><td>Leica Confocal SP8</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licht- und Leuchtstoffmikroskop (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 mL: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Software</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Nestin Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-23927</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7,4</td><td>HyClone</td><td>SH30256,01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (1&ndash; 200 & Mikro; L, 101&ndash; 1000 &Mikro; L)</td><td>Fisher Scinetific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Einweg-Transferpipetten</td><td>aus Kunststoff Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Wägeschiffchen (100 mL)</td><td>Amazon&nbsp;</td><td>mdo-azoc-1030</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol)-dithiol (PEG-diSH; 3,4 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>SH-PEG-SH-3400-5g</td><td></td></tr><tr><td>Polydimehylsiloxan (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td><td>Polydimethylsiloxan</td></tr><tr><td>puderfreie Untersuchungshandschuhe</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid, 1 mg/mL wässriger Soln.&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td></td><td></td>AAJ66584AB</tr><tr><td>RPMI-1640 Medium (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Abstandhalter - Silikonfolie, 0.5 mm dick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td>SOX2 Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365823</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturhaube</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamin, &ge; 99,0% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG humane Glioblastomzellen</td><td>American Type Culture Collection&nbsp;</td><td>HTB-14</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung und verkapselung von tumorsphäroiden in polyethylenglykol-hydrogelen zur untersuchung von sphäroid-matrix-wechselwirkungen

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

Die dreidimensionale (3D) Verkapselung von Sphäroiden ist entscheidend, um die Tumormikroumgebung für ein optimales Zellwachstum angemessen zu replizieren. Hier haben wir ein In-vitro-3D-Glioblastommodell für die Sphäroidverkapselung entwickelt, um die extrazelluläre Mikroumgebung des Tumors nachzuahmen. Zuerst bildeten wir quadratische pyramidale Mikrotiterformen mit Polydimethylsiloxan. Diese Mikrotiterformen wurden dann zur Herstellung von Tumorsphäroiden mit streng kontrollierten Größen von 50-500 μm verwendet. Sobald sich Sphäroide gebildet hatten, wurden sie geerntet und in Hydrogele auf Polyethylenglykol (PEG)-Basis eingekapselt. PEG-Hydrogele sind eine vielseitige Plattform für die Sphäroidverkapselung, da Hydrogeleigenschaften wie Steifigkeit, Abbaubarkeit und Zelladhäsion unabhängig voneinander eingestellt werden können. Hier verwendeten wir ein repräsentatives weiches (~8 kPa) Hydrogel, um Glioblastom-Sphäroide einzukapseln. Schließlich wurde eine Methode zum Färben und Abbilden von Sphäroiden entwickelt, um mittels konfokaler Mikroskopie qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten. Aufgrund des dichten Sphäroidkerns und der relativ spärlichen Peripherie kann die Bildgebung schwierig sein, aber die Verwendung einer Clearing-Lösung und konfokaler optischer Schnitte hilft, diese Bildgebungsschwierigkeiten zu lindern. Zusammenfassend zeigen wir eine Methode zur Herstellung einheitlicher Sphäroide, zur Verkapselung in PEG-Hydrogele und zur Durchführung einer konfokalen Mikroskopie an den verkapselten Sphäroiden, um das Sphäroidwachstum und verschiedene Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu untersuchen.

Sphäroidbasierte Wirkstoff-Screening-Plattformen zur Untersuchung chemotherapeutischer Wirkungen werden zunehmend nachgefragt, da der Schwerpunkt auf der Modulation der Tumormikroumgebung bei der Sphäroidverkapselung in Biomaterialien liegt, die natives Gewebe replizieren. Hier haben wir eine Methode zur multizellulären Tumorsphäroidpräparation und anschließenden Verkapselung und Bildgebung in einem 3D-Hydrogel entwickelt. Die Sphäroide werden in Mikrotiterformen hergestellt (Abbildung 3A, <...

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine schnelle, robuste und kostengünstige Herstellung von Tumorsphäroiden mit anschließender Hydrogelverkapselung ermöglicht. Es ist weit verbreitet, da es keine spezielle Ausrüstung erfordert. Es wäre besonders nützlich für die Erforschung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen und die Erstellung von In-vitro-Gewebephysiologie - oder Pathologiemodellen.

Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in Polyethylenglykol-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth.  Here, we ...

Unser Labor konzentriert sich auf die Entwicklung von In-vitro-Hydrogelmodellen für die Glioblastom-Steroidverkapselung, um die extrazelluläre Mikroumgebung des Tumors nachzuahmen. Das effektive Substrat, die mechanischen und biochemischen Eigenschaften auf die Lebensfähigkeit von Steroidzellen, die Zirkularität, die Stammzellen und die Ausbreitung werden mit solchen Modellen untersucht. Die aktuellen experimentellen Herausforderungen bei der Entwicklung von Tumormodulen drehen sich um den Wunsch nach Komplexität, um alle Aspekte der Tumormikroumgebung für physiologische Relevanz nachzuahmen, sowie um den Wunsch nach Einfachheit, um das Modell zugänglich, robust, kostengünstig und einfach zu bedienen und mit Multiplex-Screening-Ansätzen kompatibel zu machen.Wir stellen ein Protokoll vor, das eine schnelle, robuste und kostengünstige Herstellung von Tumorsteroiden und die Verkapselung in Hydrogelen ermöglicht, die die Tumormikroumgebung nachahmen. Das Modell erfordert keine spezielle Ausrüstung. Es wird besonders nützlich sein, um Steroidmatrix-Wechselwirkungen beim Aufbau von In-vitro-Gewebephysiologie- oder Pathologiemodellen zu untersuchen.Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Glioblastom-Krebszellen und ihrer Mikroumgebung kann die Entwicklung neuer Therapien zur besseren Behandlung dieses Krebses fördern. Darüber hinaus kann die Entwicklung eines In-vitro-Modells für Glioblastom-Krebs die Entwicklung dieses Modells für andere Krebserkrankungen verbessern.

tumor-spheroid-fabrication-encapsulation-polyethylene-glycol

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Quelle: Guyon, J., et al. Ein 3D-Sphäroidmodell für Glioblastome. J. Vis. exp. (2020)Das Video zeigt die Erstellung eines dreidimensionalen Sphäroidmodells der Tumorzellinvasion. Sphäroide werden aus menschlichen Hirntumorzellen gebildet und in eine Kollagenmatrix eingebettet. Die Tumorzellen an der Peripherie der Sphäroiden nehmen einen invasiven Phänotyp an, sezernieren Proteasen, um das Kollagen abzubauen, und dringen vor, um in die umgebende Matrix einzudringen.

Generierung eines dreidimensionalen Sphäroidmodells der Tumorzellinvasion

Partikel-Tracking Mikrorheologie können zerstörungs quantifizieren und räumlich zuordnen Veränderungen in der extrazellulären Matrix mechanische Eigenschaften im 3D-Tumormodelle verwendet werden.

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von elastischen 3D makroporöse Microcryogels durch die Integration von Microfabrication mit Cryogelation Technologie. Beim Laden mit Zellen, entstehen 3D Microtissues, die kann leicht injizierte in Vivo , regenerative Therapie zu erleichtern oder zu Arrays für in-vitro- Hochdurchsatz-Drogen-Screening montiert.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

Wir entwickelten eine heterogene Brust-Krebs-Modell, bestehend aus verewigt Tumor und Fibroblasten-Zellen eingebettet in ein Bioprintable Alginat/Gelatine Bioink. Das Modell der in Vivo Tumor Mikroumgebung rekapituliert und erleichtert die Bildung von mehrzelligen Tumor Sphäroide, Einblick in die Mechanismen fahren Tumorgenese nachgeben.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

Die Mikroumgebung von Tumoren ist ein wesentlicher Bestandteil des Krebswachstums und-einmarsches. Um die Fortschreibung des Karzinoms zu imitieren, wird eine biologisch relevante menschliche Matrix benötigt. Dieses Protokoll führt eine Verbesserung für den in vitro dreidimensionalen spheroizider Invasionsuntergang ein, indem es eine menschliche, auf Gelotem basierende Matrix verwendet. Das Protokoll führt auch eine computergestützte Zellinvasion ein.

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Hier beschreiben wir einen einfach zu bedienenden Invasionstest für Glioblastom. Dieser Test eignet sich für glioblastom-Stammzellen. Ein Fidschi-Makro zur einfachen Quantifizierung von Invasion, Migration und Proliferation wird ebenfalls beschrieben.

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Der vorgestellte Ansatz bewertet gleichzeitig die Krebszellinvasion in 3D-Sphäroid-Assays und t-Zell-Zytotoxizität. Sphäroide werden in einem gerüstfreien Agarose-Multi-Mikrowell-Guss erzeugt. Co-Kultur und Einbettung in Typ I Kollagenmatrix werden innerhalb des gleichen Geräts durchgeführt, das Krebszellinvasion und T-Zell vermittelte Zytotoxizität zu überwachen ermöglicht.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Es fehlen umfassende In-vitro-Modelle , die die relevante menschliche Krankheit getreu rekapitulieren. Die aktuelle Studie präsentiert die dreidimensionale (3D) Tumorsphäroidbildung und -kultur, ein zuverlässiges In-vitro-Werkzeug zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion beim menschlichen hepatozellulären Karzinom.

Ein dreidimensionales Sphäroidmodell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Wechselwirkung bei hepatozellulären Karzinomen

Die vorliegende Studie beschreibt Methoden zum Kultivieren, Einfrieren, Auftauen, Verarbeiten, Färben, Markieren und Untersuchen ganzer Sphäroide und Organoide unter verschiedenen Mikroskopen, während sie in einem Hydrogel in einem Mehrzweckgerät intakt bleiben.

Kultivierung, Einfrieren, Verarbeitung und Bildgebung ganzer Organoide und Sphäroide noch in einem Hydrogel

Dieser Artikel demonstriert eine standardisierte Methode zur Konstruktion dreidimensionaler Tumorsphäroide. Eine Strategie zur Sphäroidbeobachtung und bildbasierten Deep-Learning-Analyse unter Verwendung eines automatisierten Bildgebungssystems wird ebenfalls beschrieben.

Generierung von 3D-Tumorsphäroiden für Wirkstoffevaluierungsstudien

Lernen Sie die schnelle Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in PEG-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen. Diese kostengünstige Methode erfordert keine spezialisierte Ausrüstung.

Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in Polyethylenglykol-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen (Video) | JoVE Journal

Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in Polyethylenglykol-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen

Weitere Videos entdecken