Name: Isolierung und Identifizierung von Limbus-Nischenzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Identifizierung von Limbus-Nischenzellen zur Behandlung von Limbus-Stammzellmangel. Diese Methode nutzt Single-Cell-Sequenzierung und Immunfluoreszenzfärbung für regenerative Medizin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vielen Dank an Wei Wang, Lingjuan Xu und Rong Liu für die Anleitung zu dieser Arbeit, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You und Li Guigang für die Bereitstellung eines Teils des Materials, Guanyu Su für das Schreiben des Manuskripts, Xiao Zhou, Yihong Xiong und Huatao Xie für die Korrektur des Manuskripts und Guigang Li für seine vollständige Anleitung. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82070936, 81470606, 81570819), dem wissenschaftlichen Forschungsprojekt für Gesundheit und Familienplanung der Provinz Hubei (Nr. WJ2017M073), Top Ten translationale medizinische Forschungsprojekte des Tongji-Krankenhauses (Nr. 2016ZHYX20), Ausbildungsprojekt junger medizinischer Pioniere in der Stadt Wuhan (Nr. 2015whzqnyxggrc10), Global Talents Recruitment Program (G2022154028L), Projekt der Nationalen Gesundheitskommission der Provinz Hubei im Jahr 2022 (WJ2021ZH0005) und Subject Construction Foundation of Finance Department of Hubei im Jahr 2022 (4200002815T000000102)

Limbusgewebe von Spendern im Alter zwischen 50 und 60 Jahren wurde von der Augenbank des Roten Kreuzes im Tongji-Krankenhaus (Wuhan, China) gewonnen. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der Tongji genehmigt und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt.
1. Isolierung
<ol><li>Gewinnen Sie Limbusgewebe aus einem mittelfristigen Hornhautspeichermedium und arbeiten Sie unter aseptischen Bedingungen auf einer ultrareinen Werkbank.</li>
	<li>Kratzen Sie die Iris und das Endothel um die Hornhaut herum mit einer sterilen chirurgischen Rundklinge ab und entfernen Sie sie.</li>
	<li>Schneiden Sie Limbusgewebe in zwölf gleich große Stücke mit einer chirurgischen Klinge, die auf beiden Seiten der Hornhaut und der Sklera noch 1 mm beträgt.</li>
	<li>Limbusgewebe auf eine 3,5 cm große Kulturplatte übertragen, 1 ml Kollagenase A (2 mg/ml, in DF-12-Medium) hinzufügen, um das gesamte Gewebe für die Verdauung einzutauchen.</li>
	<li>Die Platte in den 37 °C warmen Zellinkubator geben, das Limbusgewebe 18 h lang verdauen. HINWEIS: Nachsorgeuntersuchungen werden in der Regel am zweiten Tag durchgeführt.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 5%ige Basalmembranmatrix (Matrigel) beschichtete 6-Well-Kulturplatte vor.<ol><li>Schicht 5% Basalmembranmatrix (gelöst in MESCM [Tabelle 1]) am Boden der Bohrung.</li>
		<li>Bereiten Sie 200-μl- und 1-ml-Spitzen, ein 15-ml-Zentrifugalröhrchen und eine 6-Well-Platte in einem sterilisierten Beutel vor.</li>
		<li>Stellen Sie den sterilisierten Beutel (einschließlich Spitzen und Zentrifugalröhrchen) und eine neue 6-Well-Platte für 20 Minuten in eine Umgebung von -20 °C oder -80 °C. Die Kellermembranmatrix im Kühlschrank bei 4 °C auftauen.</li>
		<li>Nehmen Sie die vorgekühlten Spitzen, das Zentrifugalröhrchen und die 6-Well-Platte aus der Umgebung von -20 °C oder -80 °C heraus und führen Sie dann die folgenden Vorgänge auf der ultrareinen Werkbank durch.</li>
		<li>50 μl 5%ige Basalmembranmatrix mit einer 200-μl-Spitze auf 1 mL MESCM übertragen und vorsichtig und gleichmäßig mischen.</li>
		<li>5%ige Basalmembranmatrix (gelöst in MESCM) mit der vorgekühlten 1-ml-Spitze in eine Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte übertragen.</li>
		<li>Schütteln Sie die 6-Well-Platte vorsichtig und horizontal, legen Sie die 6-Well-Kulturplatte für ca. 1 h in den 37 °C-Zellinkubator und führen Sie dann den nächsten Schritt durch.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach 18-stündiger Verdauung Kollagenase A-verdautes Limbusgewebe entfernen, es bleiben nur einige sichtbare kleine Cluster und unverdautes Skleralgewebe zurück. HINWEIS: Die Mikroskopie mit hoher Vergrößerung zeigt einen Cluster, der aus vielen dicht gepackten Zellen (einschließlich LNCs) besteht.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze, um die Cluster unter dem Stereomikroskop von unverdautem Skleralgewebe zu lösen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Cluster auf die 3,5-cm-Kulturplatte und tauchen Sie sie in 0,25 % TE, und legen Sie die Platte dann für 15 Minuten in den Zellinkubator.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml MESCM mit 10 % Knockout-Serum hinzu, um die Zellverdauung zu stoppen, und pipettieren Sie vorsichtig nach oben und unten, um die Cluster mit einer 1-ml-Pipettenspitze in einzelne Zellen zu resuspendieren.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird in ein 15-ml-Zentrifugalröhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne die Zellausfällung zu stören, und fügen Sie dann 1 ml MESCM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren.</li>
	<li>Pipettieren Sie 2-3 Mal auf und ab, bis der Niederschlag der unteren Zelle gleichmäßig im MESCM mit einer 1-ml-Pipettenspitze suspendiert ist, und nehmen Sie 20 μl Zellsuspension zur Zellzählung.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer 1-ml-Pipettenspitze auf die mit einer Basalmembranmatrix beschichtete 6-Well-Platte und erhöhen Sie das MESCM-Volumen auf 2,5 ml.</li>
	<li>Schütteln Sie die 6-Well-Platte vorsichtig horizontal, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in den Kulturinkubator, nachdem sie abgebildet und aufgezeichnet wurden. Beobachten und fotografieren Sie die Zellen täglich und wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage.</li>
</ol>2. Identifizierung von LNC
<ol><li>Immunfluoreszenz-Färbung<ol><li>Die LNCs vom Boden der Platte werden mit 1 ml 0,25 % TE für 5 Minuten im 37 °C C-Zellinkubator aufgeschlossen.</li>
		<li>Beenden Sie den Aufschluss durch Zugabe von 1 ml MESCM (enthält Knockout-Serum), zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 200 x g und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL MESCM hinzu, um die Zellen in Suspension zu resuspendieren. Bereiten Sie 80 μl Zellsuspension (4 × 103 Zellen pro Objektträger) für 4 Objektträger (20 μl/Objektträger) vor und verwenden Sie ein Zentrifugensystem, um Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Objektträger abzuscheiden.</li>
		<li>Fixieren Sie die Zellen (die in Schritt 3 auf Objektträgern geklebt wurden) mit 4 % Paraformaldehyd für etwa 10 Minuten und permeabilisieren Sie dann die Zellen auf den Objektträgern mit 0,2 % Triton X-100 in PBS für 15 Minuten.</li>
		<li>Blockieren Sie die Zellen für 1 h mit 2% Rinderserumalbumin (BSA), bevor Sie sie mit primären Antikörpern (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) über Nacht bei 4 °C in einem Shaker inkubieren. Nach der Inkubation werden die ungebundenen Primärantikörper durch Waschen (5 min/Waschen, 3x) der Objektträger mit PBST (PBS + 0,1 % Tween 20) entfernt.</li>
		<li>Die entsprechenden Sekundärantikörper (Esels-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper TRITC [1:1000], Esel-Anti-Kaninchen-IgG-FITC [1:500], Esel-Anti-Maus-IgG 488 [1:300], Esel-Anti-Kaninchen-IgG 594 [1:400]) für 1 h mit geeigneten unspezifischen IgG-Antikörpern inkubieren. Entfernen Sie den ungebundenen Sekundärantikörper mit PBST (5 min/Waschen, 3x).</li>
		<li>Die Zellkerne werden mit 5 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol) gegengefärbt und die Objektträger versiegelt.</li>
		<li>Fluoreszenzbildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop durchführen (Vergrößerung: 400x; Belichtungszeit: 50 ms).</li>
	</ol></li>
	<li>Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)<ol><li>Nehmen Sie das RNA-Isolations-Kit ein, um die Gesamt-RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren.</li>
		<li>Verwenden Sie ein cDNA-Transkriptionskit mit hoher Kapazität, um 1-2 μg Gesamt-RNA in cDNA umzuschreiben.</li>
		<li>Die reverse Transkription (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) und qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 Zyklen) wird in einer 20-μl-Lösung durchgeführt, die cDNA (100 ng), TaqMan Genexpression Assay Mix (1 μl), universellen PCR Master Mix (10 μl) und ddH2O (bis 20 μl) enthält.</li>
		<li>Verwenden Sie die vergleichende CT-Technik (ΔΔCT)4,9, um die relative Genexpression zu untersuchen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Charakterisierung von LNC
<ol><li>Zellzählung (Hämozytometer)<ol><li>Die LNCs werden vom Boden der Platte mit 0,25 % TE für 5 Minuten im 37 °C heißen Zellinkubator aufgeschlossen.</li>
		<li>Beenden Sie den Aufschluss durch Zugabe von 1 ml MESCM (enthält Knockout-Serum), zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 200 x g und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml MESCM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und nehmen Sie dann 10 μl Zellsuspension in ein 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,4 % Trypanblau-Färbelösung hinzu.</li>
		<li>Geben Sie 10 μl gefärbte Zellsuspension auf den Zählbereich des Hämozytometers und decken Sie ihn zum Zählen mit einem Deckglas ab. HINWEIS: Die Anzahl der Zellen in den fünf mittleren quadratischen Bereichen ist als "A" definiert. Die Zellzahl in 1 ml wird als 5A × 104 × 2 berechnet.</li>
	</ol></li>
	<li>Untersuchung von LNC- und BMMSC-Markern mit Durchflusszytometrie15<ol><li>Nachweis der Expression von SCF, CD73, CD90 und CD105 in den LNCs und BMMSCs mit Durchflusszytometrie 15 (2-4 ×10 6 Ereignisse/Probe, 2.000 Zellen wurden aus jeder der Proben gewonnen, insgesamt 550.000 Zellen, die gleichzeitig angesteuert wurden).</li>
		<li>Die Zellen werden bei 20-30 °C für 15 Minuten in einem Blockierungspuffer (3 % BSA und 0,05 % Tween-20 in PBS) mit vormarkierten Antikörpern (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] und CD105 [1:50]) gemäß den Anweisungen des Kits gesammelt und gefärbt.</li>
		<li>Führen Sie eine Analyse der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) mit einem Durchflusszytometer durch. In dieser Studie wurden die Software FACS Diva und die Software FlowJo verwendet. Zeichnen Sie für jede Probe 10.000 Ereignisse auf und analysieren Sie lebende Zellen.</li>
	</ol></li>
</ol>

Ein Protokoll zur Isolierung, Kultivierung und Identifizierung menschlicher limbaler Nischenzellen

<ol><li>Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of limbal stem cell deficiency.</a> Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).</li>
<li>Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+from+limbal+stroma+of+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye.</a> Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+limbal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+potential+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+lacrimal+canaliculus+epithelial+stem+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).</li>
<li>Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+regenerative+potential+of+corneal+stromal+stem+cells+and+their+secretome+after+long-term+storage%3A+Implications+for+ocular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).</li>
<li>Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+isolation+of+limbal+niche+cells%3A+Maintenance+of+limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+and+three-dimensional+matrigel-induced+dedifferentiation+of+mature+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+biopsy-derived+stromal+stem+cells+prevent+corneal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring.</a> Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).</li>
<li>Acar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allogeneic+limbal+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+corneal+healing%3A+role+of+administration+route%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route.</a> Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).</li>
<li>Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+limbal+fibroblasts+and+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+to+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells.</a> Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).</li>
<li>Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+limbal+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells.</a> Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+attract+stromal+niche+cells+by+SDF-1%2FCXCR4+signaling+to+prevent+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation.</a> Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+niche+cells+are+a+powerful+regenerative+source+for+the+prevention+of+limbal+stem+cell+deficiency+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model.</a> Scientific Reports. 8, 6566(2018).</li>
<li>Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+therapy+for+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative therapy for the cornea.</a> Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).</li>
<li>Pineda, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPineda%2C+R+%22World+Corneal+Blindness.+Foundations+of+Corneal+Disease%22">World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease</a>. , Springer, Cham. 299-305 (2020).</li>
<li>Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li>
<li>Resnikoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+data+on+visual+impairment+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global data on visual impairment in the year 2002.</a> Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+bio-engineered+tissue+employing+3D+nanofiber-aerogel+scaffold+to+facilitate+LSCs+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration.</a> Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).</li>
<li>Aghamirsalim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+hydrogels+for+ocular+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">3D printed hydrogels for ocular wound healing.</a> Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).</li>
<li>Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+the+corneal+epithelium+using+limbal+stem+cells+or+alternative+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).</li>
<li>Rohaina, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+limbal+stem+cell+deficient+corneal+surface+with+induced+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+on+amniotic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane.</a> Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).</li>
<li>O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosa+tissue+equivalents+for+the+treatment+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency.</a> Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265(2020).</li>
<li>Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells.</a> Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).</li>
<li>Zeppieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+corneal+wound+healing+after+laser-induced+corneal+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice.</a> Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).</li>
<li>Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+cues+modulate+the+neurogenic+potential+of+bone+marrow+and+dental+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells.</a> Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+generation+of+multiple+ocular-like+cell+lineages+and+fabrication+of+functional+corneal+epithelial+cell+sheets+from+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells.</a> Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+are+a+potent+resource+of+adult+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+between+limbal+niche+progenitors+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).</li>
<li>González, S., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+native+limbal+stromal+cells+increases+the+expansion+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture.</a> Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).</li>
<li>Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6+expression+identifies+progenitor+cells+for+corneal+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes.</a> FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).</li>
<li>Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+limbal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the limbal stroma.</a> Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).</li>
<li>Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+limbal+progenitor+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).</li>
</ol>

Keiner der Autoren verfügt über relevante finanzielle Angaben.

Die Transparenz der Hornhaut wird in der Regel durch die regelmäßige Anordnung und Verteilung kleiner Fasern (25-30 nm Durchmesser) im Hornhautstroma aufrechterhalten, was für die normale Sehschärfe entscheidend ist16. Weltweit gibt es 253 Millionen sehbehinderte Menschen, von denen 36 Millionen blind sind17. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) betrachtet Hornhautblindheit als eine der schwerwiegendsten Gefahren für das menschliche Sehvermögen und macht 5,1 % aller Erblin...

Die Inzidenz von Hornhautepithelzellmangel (CESD), auch Limbusstammzellmangel (LSCD)1 genannt, und Hornhautepithelregeneration (CES) wird aufgrund von Hornhautinfektionen und -verletzungen immer dringlicher. Wenn CESD nicht richtig behandelt wird, kann sie zur Erblindung führen, die eine Hornhauttransplantation erfordert. Dadurch gewinnt die CES-Regeneration an Bedeutung. Es gibt eine Gruppe von unterstützenden Zellen, die als limbale Nischenzellen (LNCs) bezeichnet werden und eine wesentliche Unterstützung für die CES-Funktion bieten. Limba-Stroma-Stammzellen wurden zuerst von Polisetty et al.2 isoliert und von Xie et al.3 als LNCs identifiziert, die im Limbusepithel und Stroma des Limbus lokalisiert sind. LNCs sind die wichtigsten unterstützenden Stammzellen des Hornhautrandes und könnten mit der Funktion von MSC aus dem Knochenmark (BMMSCs) dazu gebracht werden, sich zu Hornhautepithelzellen und Hornhautstromazellen usw. zu entwickeln.3,4,5,6,7. Frühere Studien zeigten, dass die Stammzellqualitäten von LNCs primitiver sind als die von BMMSCs8, die in der Klinik bereits weit verbreitet sind. LNCs könnten sogar die nächste praktikable Option nach MSC werden, insbesondere für die Behandlung von CESD. Als wichtige Stützzellen für CES sind LNCs auch Stammzellen, die aus der "Nischen"-Struktur des Limbus stammen. LNCs könnten eine Schlüsselrolle bei der Dedifferenzierung reifer Hornhautepithelzellen (MCEC) zu CES9 spielen. Die Studien zu LNCs sind jedoch noch relativ unzureichend, und es gibt keinen Konsens über die Terminologie, die Isolierung, die Reinigung, die Identifizierung und die Eigenschaften von LNCs. Einige Forscher haben LNCs aus der Limbusbiopsie gewonnene stromale Stammzellen10, limbale mesenchymale Stammzellen 11, limbale Fibroblasten-Stammzellen 12 und limbale mesenchymale Stromazellen13 genannt. Da die Wachstumseigenschaften von LNCs noch nicht im Detail beschrieben wurden und aufgrund ihrer vielversprechenden wissenschaftlichen und klinischen Anwendungen in Zukunft eines der wichtigsten klinischen Werkzeuge sein könnten, ist es notwendig, die Isolierung, Aufreinigung, Identifizierung und Eigenschaften von LNCs zusammenzufassen.
Laut einer früheren Studie14 sind LNCs hauptsächlich am Limbusepithel und Stroma des Limbus vorhanden. Dieses Protokoll umfasst die Behandlung von Limbusgewebe mit Kollagenase A, die Gewinnung eines Clusters aus LEPC und LNCs und die Verdauung in einzelne Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA (TE). LNCs wurden dann selektiv in einem modifizierten embryonalen Stammzellmedium (MESCM) kultiviert, um gereinigt zu werden. Das Protokoll, über das in diesem Artikel berichtet wird, ist einfach und hat eine hohe Effizienz bei der Gewinnung menschlicher LNCs in großen Mengen.
Das detaillierte Verfahren der LNC-Isolierung, -Kultur und -Identifizierung wurde in dem Video für Wissenschaftler aufgezeichnet, die an einer LNC-Studie interessiert sind, und kann bei Bedarf bequem wiederholt werden.

<table><tbody><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>5&mu; g/mL</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>V900919</td><td>1,25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-CD73</td><td>Abcam</td><td>ab202122</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>MERCK</td><td>A1933-CD105</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Proteintech</td><td>67075-1-Ig</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD105</td><td>Abcam</td><td>ab114052</td><td>1:50</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Proteintech</td><td>66766-1-Ig</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Abcam</td><td>ab307736</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Zell-Inkubator</td><td>Shanghai Lishen</td><td>K1119K4644</td><td>HF90(HT)</td></tr><tr><td>Zentrifugensystem</td><td>StatSpin&nbsp;</td><td>StatSpin CytoFuge</td> <td>12-Kollagenase</td></tr> <tr><td>A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>2 mg/ml</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>LSM700-Kulturplatte</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>virya</td><td>3500356</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)&nbsp;</td><td>cytiva</td><td>SH30023.01</td><td>90%</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärer Antikörper</td><td>ThermoFisher</td><td>A16016</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärer Antikörper</td><td>ThermoFisher</td><td>31568</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>FACS Diva Software</td><td>BD Biosciences</td><td>Tree</td> <td>Star-Flow</td></tr> <tr><td>Zytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>Becton Dickinson LSRII</td><td>-</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>CX31&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>50 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>MERCK</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line</td></tr><tr><td>cDNA-Transkriptionskit mit hoher Kapazität</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Phasenkontrastmikroskop</td><td>&nbsp; UOP</td><td>DSZ2000X</td><td></td></tr><tr><td>ITS (Insulin, Transferrin, Natriumselenit)</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td>5 &mu; g/ml Insulin, 5 μ; g/mL Transferrin, 5 ng/mL Natriumselenit</td></tr><tr><td>KnockOut SR Serum Ersatz für ESCs/iPSCs</td><td>gibco</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BioCoat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>356234-Pan-CK</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>NoninBio</td><td>NBS0135</td><td>4,00%</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>MKBio</td><td>MM-1505</td><td>4%</td></tr><tr><td>PDGFR&Beta;</td><td>Abklonales</td><td>A1444</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Quantitatives Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Instrument</td><td>Applied Biosystems</td><td>Step One</td><td></td></tr> <tr><td>Plus-rekombinantes humanes FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>4 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner Leukämie-Hemmfaktor (Lif)</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>RNeasy Mini-RNA-Isolationskit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>-</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Bioss</td><td>bs-0545R</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Abcam</td><td>ab52603</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>ZEISS</td><td>SteREO Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Sterile chirurgische Rundklinge</td><td>Careforde</td><td>29500</td><td>Größe 10</td></tr><tr><td>TaqMan Genexpression Assay Mix</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4448489</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MERCK</td><td>X100</td><td>0,20 %</td></tr> <tr><td>Trypanblau</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>0,40 %</td></tr> <tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Genview</td><td>GP3108</td><td>0,25 %</td></tr> <tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>P9416-Ultra</td><td></td></tr> <tr><td>Clean Bench</td><td>LaiTe</td><td>LT20200705</td><td>SW-CJ-IFDG</td></tr><tr><td>Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Vim&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

isolierung und identifizierung von limbus-nischenzellen

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Hier berichten wir über ein Standardverfahren zur Isolierung und Identifizierung von limbalen Nischenzellen (LNCs). Limbusgewebe aus einer Augenbank wurde für die Isolierung von LNCs verwendet. Das Gewebe wurde unter aseptischen Bedingungen in 12 Stücke geteilt und 18 h bei 37 °C im Zellkultur-Inkubator unter Verwendung von Kollagenase A aufgeschlossen, um Zellcluster mit LNCs und limbalen Epithel-Vorläuferzellen zu erhalten. Die Zellcluster wurden 15 Minuten lang bei 37 °C unter Verwendung von 0,25 % Trypsin-EDTA verdaut, um Einzelzellen zu erhalten, und dann in modifiziertem embryonalem Stammzellmedium (MESCM) auf einer mit 5 % Matrigel beschichteten Kunststoffoberfläche kultiviert. Die Zellen wurden bei 70%iger Konfluenz durchgelassen und LNCs wurden mittels Immunfluoreszenz, quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) und Durchflusszytometrie identifiziert. Primäre LNCs wurden isoliert und mehr als 12 Mal durchquert. Die Proliferationsaktivität von LNCs von P4 bis P6 war am höchsten. LNCs exprimierten höhere Stammzellmarker als BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR und PDGFRβ). Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass P4-LNCs einheitlich VIM, CD90, CD105 und PDGFRβ exprimierten, jedoch nicht Pan-CK, was als Marker für die Identifizierung von LNCs verwendet werden könnte. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass etwa 95 %, 97 %, 92 % und 11 % der LNCs CD73, CD90, CD105 bzw. SCF exprimierten, während sie bei BMMSCs 68 %, 99 %, 20 % und 3 % exprimierten. Das Standardverfahren zur LNC-Isolierung und -Identifizierung könnte eine zuverlässige Laborgrundlage für den weit verbreiteten Einsatz von LNCs bieten.

Wachstum von LNC Die LNCs wurden erfolgreich gemäß der Methode des Verdaus von Kollagenase A (2 mg/ml) des korneoskleralen Randgewebes, wie oben beschrieben (Abbildung 1), isoliert. In Übereinstimmung mit einer zuvor berichteten Studie3 wurden nach dem Verdau von Kollagenase A raupenartige Cluster unter dem Mikroskop sichtbar gemacht (Abbildung 2). Der Anteil der Spindelzellen nahm mit der Zellpassage allmählich zu. Sp...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Identifizierung der menschlichen Limbus-Nischenzellen vor.

Isolierung und Identifizierung von Limbus-Nischenzellen

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Unsere Studien konzentrieren sich auf die Rekonstruktion der limbalen Nische zur Behandlung des limbalen Stammzellmangels und zur Wiederherstellung des Sehvermögens des Patienten. Wir versuchen zu beantworten, ob Limbus-Nischenzellen die Schlüsselzellen sind, die die Funktion limbaler Stammzellen unterstützen, und wenn ja, wie sie funktioniert. Neuere Studien berichteten, dass die subkonjunktivale Transplantation mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark den limbalen Stammzellmangel bei alkaliverbrannten Augen verhinderte.Eine der Technologien, die derzeit eingesetzt werden, um unsere Forschung voranzutreiben, ist die Einzelzellsequenzierung, mit der die wichtigsten Signalwegaktivitäten auf Einzelzellebene analysiert werden können, um limbale Nischenzellen zu charakterisieren. Obwohl LNC das Potenzial haben, in Zukunft ein wichtiges klinisches Werkzeug zu werden, sind ihre Wachstumseigenschaften noch nicht sehr detailliert erforscht. In Anbetracht ihrer vielversprechenden wissenschaftlichen und klinischen Anwendungen ist es notwendig, die Isolierung, Reinigung, Identifizierung und Eigenschaften von LNC zusammenzufassen.

isolation-and-identification-of-limbal-niche-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir berichten über ein Verfahren zur Herstellung von Mikrotaschen in elektro Membranen, bei denen auf das Zellverhalten zu untersuchen. Insbesondere beschreiben wir eine Kombination von Mikrostereo und Elektro zur Herstellung von PLGA (Poly (lactid-co-glycolid)) Hornhaut Biomaterial Geräten mit Mikromerkmalen ausgestattet.

Kombination von Mikrostereolithographie und Elektrospinnen auf Membranen Ausgestattet mit Nischen für die Hornhautregeneration Produzieren

In diesem Artikel beschreiben wir die Prinzipien für das Entwerfen und Durchführen eines mehrfarbigen Abstammungsverfolgungsexperiments mit R26R-Confetti-Mäusen. Wir bieten ein spezifisches Protokoll für die Verfolgung von Hornhautepithelzellen an, das für andere Gewebe von Interesse modifiziert werden kann.

Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Ein Beispiel für eine adenovirale Gentherapie bei menschlichen diabetischen Organkulturen wird vorgestellt, um die verzögerte Wundheilung und die deutlich reduzierte Expression von epithelialen Stammzellmarkern in diesen Hornhäuten zu normalisieren. Es wird auch die Optimierung dieses Prozesses in stammzellangereicherten limbalen Epithelkulturen beschrieben.

Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen

Der folgende Artikel stellt eine einfache und reproduzierbare Technik effektiv zu einer nachhaltigen Mausmodell der Limbusstammzellinsuffizienzen (LSCD) erstellen. Dieses Tiermodell ist nützlich bei der Prüfung und die Wirksamkeit von Behandlungen für Limbus-Stammzellen Krankheiten verglichen.

Eine einfache mechanische Verfahren Limbusstammzellinsuffizienzen in der Maus zum Erstellen

Die exponierte normale Okularoberfläche besteht aus Hornhaut und Bindehaut. Epithelzellen, Becherzellen und Immunzellen sind in der Bindehaut vorhanden. Hier wird eine nicht-invasive Technik der Impressionszytologie beschrieben, die eine Impressionszytologie-Vorrichtung und Durchflusszytometrie zur Analyse von Immunzellen in der Bindehaut verwendet.

Ein nicht-invasiver Weg, um Zellen aus der Conjunctiva zu isolieren und zu phenotypen

Dieses Protokoll stellt eine einfache zweistufige Methode zur Differenzierung von Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Xeno und Feeder zellfreie Kulturbedingungen. Die Zelle Kulturmethoden hier vorgestellten ermöglichen kosteneffiziente, groß angelegte Produktion von klinische Qualität Zellen auf Hornhaut Zelle Therapie Verwendung anwendbar.

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Die Tränendrüse (LG) hat zwei Zelltypen, die α-glatte Muskelaktin (αSMA) ausdrücken: Myoepithelialzellen (MECs) und Pericytes. MECs sind ektodermaler Herkunft, der in vielen Drüsengeweben zu finden ist, während die Periicyten vaskuläre glatte Muskelzellen endodermalen Ursprungs sind. Dieses Protokoll isoliert MECs und Periicytes von murinen LGs.

Isolierung von myepithelialen Zellen aus der Urmorine, Lacrimal und Submandibular Drüsen

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Amplifikation aerober und fakultativer anaerober Maus-Bindehaut-Kommensalbakterien unter Verwendung eines einzigartigen Augenabstrichs und eines kulturbasierten Anreicherungsschritts mit anschließender Identifizierung durch mikrobiologische Methoden und MALDI-TOF-Massenspektrometrie vorgestellt.

Bindehautkommusale Isolierung und Identifizierung bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Induktion einer genauen und reproduzierbaren Hornhaut- und Limbusalkaliverletzung in einem Mausmodell. Das Protokoll ist vorteilhaft, da es eine gleichmäßig verteilte Verletzung der stark gekrümmten Hornhaut und des Limbus der Maus ermöglicht.

Induktion von Hornhaut- und Limbusalkaliverletzungen mit einer Stanz-Trephin-Technik in einem Mausmodell

Wir haben ein Rattenmodell für schwere Hornhautentzündungen durch Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten entwickelt. Die Studie untersuchte Entzündungsmuster der Hornhaut, die epitheliale Proliferation und Veränderungen der limbalen Stammzellen unter entzündlichen Bedingungen.

Etablierung eines Modells für schwere Hornhautentzündungen bei Ratten auf der Grundlage einer Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Gewinnung hochwertiger Einzelzell-Suspensionen aus ganzen Maushornhäuten durch sequentielle Verdauung mit Kollagenase A und Trypsin. Diese Methode liefert lebensfähige Einzelzellen mit hoher RNA-Integrität, wodurch sie mit nachgelagerten Anwendungen wie der Einzelzell-RNA-Sequenzierung und FlowzytometrieY kompatibel sind.

Ein Protokoll zur Entnahme von Einzelzell-Suspension aus Maushornhäuten

Erfahren Sie die Isolierung und Identifizierung von Limbus-Nischenzellen zur Behandlung von Limbus-Stammzellmangel. Diese Methode nutzt Single-Cell-Sequenzierung und Immunfluoreszenzfärbung für regenerative Medizin.

Isolierung und Identifizierung von Limbus-Nischenzellen

Weitere Videos entdecken