Name: Generierung von Netzhautverletzungsmodellen bei Xenopus-Kaulquappen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Erfahren Sie, wie Netzhautverletzungsmodelle bei Xenopus-Kaulquappen zur Untersuchung von Regenerationsmechanismen und der Rolle von Müller-Glia-Zellen erstellt werden. Diese Methode liefert wertvolle Erkenntnisse für potenzielle Therapien bei menschlichen Netzhauterkrankungen.

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Diese Forschung wurde durch Stipendien an M.P. von der Association Retina France, der Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) und UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in Zusammenarbeit mit ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé) unterstützt.

Erzeugung von Netzhautdegeneration zur Untersuchung zellulärer Reparaturstrategien bei Xenopus

<ol><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>García-García, D., Locker, M., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+M%C3%BCller+glia+regenerative+potential+for+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).</li>
<li>Todd, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+stimulation+of+retinal+regeneration+from+M%C3%BCller+glia+in+adult+mice+using+combinations+of+proneural+bHLH+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors.</a> Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li>
<li>Langhe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reactivation+in+Xenopus+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration.</a> Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).</li>
<li>Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+chemogenetic+ablation+of+photoreceptor+cells+in+Xenopus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-specific+ablation+using+the+nitroreductase%2Fmetronidazole+system+to+investigate+regeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).</li>
<li>Zahn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Table+of+Xenopus+development%3A+a+new+graphical+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource.</a> Development. 149 (14), (2022).</li>
<li>McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Husbandry%2C+general+care%2C+and+transportation+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).</li>
<li>Parain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+models+of+retinitis+pigmentosa+reveal+differential+proliferative+response+of+M%C3%BCller+cells+between+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Cells. 11 (5), 807(2022).</li>
<li>Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+care+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).</li>
<li>Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+from+three+cellular+sources+and+ectopic+mini-retina+formation+upon+neurotoxic+retinal+degeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+the+Xenopus+laevis+tadpole%3A+a+new+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system.</a> Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).</li>
<li>Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+tadpoles+can+regenerate+neural+retina+lost+after+physical+excision+but+cannot+regenerate+photoreceptors+lost+through+targeted+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+homeobox+%28Rx%29+gene+is+necessary+for+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration.</a> Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Vor- und Nachteile verschiedener Netzhautverletzungsparadigmen bei Xenopus-Kaulquappen 
Mechanische Netzhautverletzung Bei Xenopus-Kaulquappen haben sich verschiedene chirurgische Verletzungen der neuralen Netzhaut entwickelt. Die neurale Netzhaut kann entweder vollständig entfernt werden 15,16 oder nur teilweise entfernt werden16,17.<sup class="x...

Millionen von Menschen weltweit leiden an verschiedenen degenerativen Netzhauterkrankungen, die zur Erblindung führen, wie z. B. Retinitis pigmentosa, diabetische Retinopathie oder altersbedingte Makuladegeneration (AMD). Bis heute sind diese Erkrankungen weitgehend unbehandelbar. Zu den derzeit untersuchten therapeutischen Ansätzen gehören Gentherapie, Zell- oder Gewebetransplantationen, neuroprotektive Behandlungen, Optogenetik und Prothesen. Eine weitere neue Strategie basiert auf der Selbstregeneration durch die Aktivierung körpereigener Zellen mit Stammzellpotenzial. Müller-Gliazellen, der wichtigste Gliazelltyp der Netzhaut, gehören zu den zellulären Quellen von Interesse in diesem Zusammenhang. Bei Verletzungen können sie dedifferenzieren, sich vermehren und Neuronen erzeugen 1,2,3. Obwohl dieser Prozess bei Zebrafischen oder Xenopus sehr effektiv ist, ist er bei Säugetieren weitgehend ineffizient.
Nichtsdestotrotz konnte gezeigt werden, dass geeignete Behandlungen mit mitogenen Proteinen oder die Überexpression verschiedener Faktoren den Wiedereintritt in den Zyklus der Müllergliazellen von Säugetieren induzieren und in einigen Fällen deren anschließende Neurogeneseverpflichtung auslösen können 1,2,3,4,5. Für die Behandlung ist dies jedoch nach wie vor weitgehend unzureichend. Daher ist es notwendig, unser Wissen über die molekularen Mechanismen, die der Regeneration zugrunde liegen, zu erweitern, um Moleküle zu identifizieren, die in der Lage sind, die Eigenschaften von Müller-Stammzellen effizient in neue zelluläre therapeutische Strategien umzuwandeln.
Zu diesem Zweck haben wir mehrere Verletzungsparadigmen in Xenopus entwickelt, die die Degeneration von Netzhautzellen auslösen. Hier präsentieren wir (1) eine mechanische Netzhautverletzung, die nicht zelltypspezifisch ist, (2) ein konditionelles und reversibles Zellablationsmodell mit dem NTR-MTZ-System, das auf Stäbchenzellen abzielt, (3) einen CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout , ein Modell der Retinitis pigmentosa, das eine progressive Stäbchenzelldegeneration auslöst, und (4) ein CoCl2-induziertes zytotoxisches Modell, das je nach Dosis spezifisch auf Zapfen abzielen oder zu einer breiteren Degeneration von Netzhautzellen führen kann. Wir beleuchten die Besonderheiten, Vor- und Nachteile der einzelnen Paradigmen.

<table><tbody><tr><td>1,2-Propandiol (Propyl&egrave; </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398039</td><td></td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol &ge; 99,8%</td><td>VWR chemicals</td><td>20821-365</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cleaved Caspase 3 Antikörper (Kaninchen)</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9661S</td><td>Verdünnung 1/300</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antikörper (Huhn)</td><td>Aveslabs</td><td>GFP-1020</td><td>Verdünnung 1/500</td></tr><tr><td>Anti-M-Opsin Antikörper (Kaninchen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5405</td><td>Verdünnung 1/500</td></tr><tr><td>Anti-Maus Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594 (Ziege)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11005</td><td>Verdünnung 1/1.000</td></tr><tr><td>Anti-Otx2-Antikörper (Kaninchen)</td><td>Abcam</td><td>Ab183951</td><td>Verdünnung 1/100</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 (Ziege)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11008</td><td>Verdünnung 1/1.000</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594 (Ziege)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11012</td><td>Verdünnung 1/1.000</td></tr><tr><td>Anti-Recoverin-Antikörper (Kaninchen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5585</td><td>Verdünnung 1/500</td></tr><tr><td>Anti-Rhodopsin-Antikörper (Maus)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN15</td><td>Verdünnung 1/1.000</td></tr><tr><td>Anti-S-Opsin-Antikörper (Kaninchen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5407</td><td>Verdünnung 1/500</td></tr><tr><td>Apoptotis-Detektionskit (fluorimetrisches TUNEL-System mit Sackgasse)</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Benzocain&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Stammlösung 10%</td></tr><tr><td>BisBenzimid H 33258 (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>Stammlösung 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Butanol-1 &ge; 99,5%</td><td>VWR Chemikalien</td><td>20810.298</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2, 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.02382</td><td>Verwendung bei 0,1 m</td></tr><tr><td>Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0646T</td><td></td></tr><tr><td>Clark Kapillarglas Modell GC100TF-10</td><td>Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>30-0038</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt(II)-chlorid-hexahydrat (CoCl2, 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td>Stammlösung 100 mM</td></tr><tr><td>Deckglas 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Dako REAL ab Verdünnungsmittel&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>S202230-2</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Elektronisches Rotationsmikrotom</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 340E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eosin 1% wässrig</td><td>RAL Diagnostik</td><td>312740</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Lysin Dextran & &nbsp;</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>D1822</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX 200</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Euromedex</td><td>EU0410-B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerinalbumin gem. Mallory</td><td>Diapath</td><td>E0012</td><td>Verwendung bei 3% in Wasser</td></tr><tr><td>Hämatoxylin (Mayer's Hemalun)</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Kaliumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Choriongonadotropin-Hormon</td><td>MSD Tiergesundheit</td><td>Chorulon 1500</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäurerauch, 37% (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich (SAFC)</td><td>1,00314</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteinhydrochlorid-Monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880</td><td>Verwendung bei 2% in 0,1x MBS (pH 7,8 - 8,0)</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4, 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>M3761</td><td>Einsatz bei 10 mM</td></tr><tr><td>Microloader-Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher (P-97 Flaming/Brown)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modell P-97</td><td>Programm : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500</td></tr><tr><td>Eindeckmedium zur Erhaltung der Fluoreszenz, FluorSave Reagenz</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium, Eukitt</td><td>Chem-Lab</td><td>CL04.0503.0500</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Ultra Mikrotomklinge</td><td>Epredia</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>Nadel Agani 25 G x 5/8''</td> <td>Terumo</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>Vernickelter Stifthalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Nylon-Filtergewebe (Sichtgewebe) NITEX, Maschenöffnung 1.000 & Mikro; m</td><td>Sefar</td><td>06-1000/44</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin-Histowax ohne DMSO</td><td>Histolab</td><td>00403</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Lösung (32%)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>EM-15714-S</td><td>Verwendung bei 4% in 1x PBS pH 7,4</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Einweg-Einbettformen</td><td>Epredia</td><td>2219</td><td></td></tr><tr><td>Stößel</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 100 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>SB93-101</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 55 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>BP53-06</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330-A</td><td></td></tr><tr><td>PicoSpritzer Mikroinjektionssystem</td><td>Parker Instrumentation Produkte</td><td>PicoSpritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Pins&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Polysaccharose (Ficoll PM 400 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td>Verwendung bei 3% in 0,1x MBS</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Pulverförmiges Frittierfutter : sera Micron Nature</td><td>sera</td><td>45475 (00720)</td><td></td></tr><tr><td>Schere zum Sezieren</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Slide Superfrost&nbsp;</td><td>&nbsp; KNITTEL Glas</td><td>VS11171076FKA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Diawärmer</td><td>Kunz instruments</td><td>HP-3</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat-Trinatriumsalz-Dihydrat (C6H5Na3O7, 2H2O)</td><td>VWR Chemikalien</td><td>27833.294</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.06329</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid 30%ige wässrige Lösung (NaOH)</td><td>VWR Chemikalien</td><td>28217-292</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen Omnifix-F Solo Einwegspritzen 1 mL</td><td>B-BRAUN</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>transaktivierende crRNA (tracrRNA)</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td></td><td></td>1072533</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 200DC Fluoreszenzbeleuchtung</td><td>X-Cite&nbsp;</td><td>200DC</td><td></td></tr><tr><td>Xylol &ge; 98,5%&nbsp;</td><td>VWR Chemikalien</td><td>28975-325</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung von netzhautverletzungsmodellen bei xenopus-kaulquappen

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Neurodegenerative Netzhauterkrankungen sind die Hauptursachen für Erblindung. Unter den zahlreichen therapeutischen Strategien, die erforscht werden, hat sich in jüngster Zeit die Stimulierung der Selbstreparatur als besonders attraktiv erwiesen. Eine zelluläre Quelle von Interesse für die Netzhautreparatur ist die Müller-Gliazelle, die Stammzellpotenzial und eine außergewöhnliche Regenerationsfähigkeit in Anamnioten birgt. Dieses Potenzial ist jedoch bei Säugetieren sehr begrenzt. Die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Netzhautregeneration in Tiermodellen mit regenerativen Fähigkeiten zugrunde liegen, soll Aufschluss darüber geben, wie die latente Fähigkeit von Säugetier-Müller-Zellen zur Regeneration der Netzhaut freigesetzt werden kann. Dies ist ein wichtiger Schritt für die Entwicklung therapeutischer Strategien in der regenerativen Medizin. Zu diesem Zweck haben wir mehrere Paradigmen für Netzhautverletzungen in Xenopus entwickelt: eine mechanische Netzhautverletzung, eine transgene Linie, die eine bedingte Ablation von Nitroreduktase-vermittelten Photorezeptoren ermöglicht, ein Retinitis pigmentosa-Modell, das auf einem CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout basiert, und ein zytotoxisches Modell, das durch intraokulare CoCl2-Injektionen gesteuert wird. Unter Hervorhebung ihrer Vor- und Nachteile beschreiben wir hier diese Reihe von Protokollen, die verschiedene degenerative Zustände hervorrufen und die Untersuchung der Netzhautregeneration bei Xenopus ermöglichen.

Mechanische Netzhautverletzung Netzhautschnitte von Kaulquappen, die der in Protokollabschnitt 1 beschriebenen mechanischen Verletzung ausgesetzt waren, zeigen, dass die Netzhautläsion alle Schichten des Gewebes umfasst, während sie auf die Punktionsstelle beschränkt bleibt (Abbildung 2A,B).
Bedingte Stäbchenzellablation mit dem NTR-MTZ-System Die Augen von anästhesierten Tg(rho:GFP-NTR)-transgenen ...

Wir haben mehrere Protokolle entwickelt, um Netzhautschäden oder Netzhautdegeneration bei Xenopus laevis-Kaulquappen zu induzieren. Diese Modelle bieten die Möglichkeit, die Regenerationsmechanismen der Netzhaut zu untersuchen.

Generierung von Netzhautverletzungsmodellen bei Xenopus-Kaulquappen

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

Mein Labor arbeitet an der Regeneration der Netzhaut. Wir verwenden den Xenopus-Frosch als Modellsystem. Diese Amphibie ist in der Tat sehr faszinierend, denn im Gegensatz zu Säugetieren, wie wir, kann sie ihre Netzhaut im Falle einer Verletzung sehr effizient regenerieren.Und wir untersuchen den zugrundeliegenden Mechanismus, denn in Zukunft könnte es nützlich sein, die Netzhautregeneration bei menschlichen Patienten auszulösen, die an neurodegenerativen Netzhauterkrankungen leiden. Wir haben kürzlich entdeckt, dass neben Stammzellen in der Peripherie der Netzhaut und dem retinalen Pigmentepithel auch Neurogliazellen für die Netzhautregeneration im Falle einer Verletzung rekrutiert werden können. Und so untersuchen wir nun die Zusammenhänge zwischen Neuroinflammation und der Regenerationsfähigkeit dieser Zellen.In der Tat scheint es, dass die neuroinflammatorische Nische eine Schlüsselrolle bei der Modulation der Regeneration der Netzhaut spielt. Um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die an der Regeneration der Netzhaut beteiligt sind, haben wir mehrere Paradigmen für Netzhautverletzungen in Xenopus entwickelt. Die erste ist eine mechanische Netzhautverletzung.Die zweite ist eine transgene Linie, die eine Nitroreduktase-vermittelte Photorezeptor-bedingte Ablation ermöglicht. Das dritte ist ein Retinitis pigmentosa-Modell, das auf einem CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout basiert, und zum Abschluss ein zytotoxisches Modell, das durch intraokulare Injektion von Kobaltchlorid oder CoCl2 gesteuert wird. Mein Gastlabor hat gezeigt, dass Xenopus zwar seine Netzhaut regenerieren kann, die Effizienz jedoch sehr variabel ist und von den Stadien der Kaulquappe oder von der Art Xenopus laevis oder tropicalis abhängt.Dies macht Xenopus zu einem fantastischen Modell, um die molekularen Mechanismen zu veranschaulichen, die die Netzhautregeneration auslösen oder begrenzen.

generating-retinal-injury-models-in-xenopus-tadpoles

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Xenopus laevis bietet ein ideales Modellsystem zur Untersuchung von Zell Schicksal Spezifikation und physiologische Funktion der einzelnen Zellen der Netzhaut in primären Zellkulturen. Hier stellen wir eine Technik zum Präparieren Netzhautgewebe und Erzeugen primären Zellkulturen, die für Calcium-Aktivität abgebildet und analysiert werden durch in situ-Hybridisierung.

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

Das Video demonstriert eine Methode zur Kultivierung primärer retinaler Ganglienzellen aus Zebrafischembryonen. Embryonen im Frühstadium werden dissektioniert, um die Augen zu isolieren, die anschließend mechanisch in eine Suspension aus retinalen Ganglienzellen dissoziiert werden. Diese Zellsuspension wird auf Deckgläsern kultiviert, die mit Klebeproteinen beschichtet sind, um die Axonentwicklung zu erleichtern.

Erzeugung von primären retinalen Ganglienzellkulturen aus Zebrafischembryonen

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Induktion von Netzhautdegeneration bei erwachsenen Zebrafischen mittels Laserverletzung. Der Laser zielt auf Photorezeptorzellen in der Netzhaut ab und löst den Zelltod und einen degenerativen Prozess aus. Diese Schädigung aktiviert Müller-Gliazellen (MG), was zu ihrer Dedifferenzierung in Stammzellvorläuferzellen führt, die die Regeneration der Netzhaut unterstützen.

Modellierung der Netzhautdegeneration und -regeneration im Zebrafisch mit Hilfe einer fokalen Laserverletzung

Mehrere leichte Schäden Protokolle, um Schäden Photorezeptoren beschrieben worden und folglich induzieren eine Netzhautregeneration Reaktion in erwachsenen Zebrafisch. Dieses Protokoll beschreibt ein verbessertes Verfahren, das in pigmentierten Tieren verwendet werden kann und dass Schäden, die überwiegende Mehrheit der lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen über die gesamte Netzhaut.

A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch

Xenopus laevis Kaulquappen schwimmen lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank. Dieses Verhalten wird von ihrer Vision geleitet. Basierend auf diesem Verhalten stellen wir eine einfache Test, um die visuelle Funktion der Kaulquappen zu testen.

Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in<em&gt; Xenopus laevis</em

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um zu sezieren, experimentell zu manipulieren und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Das Explantat-Kulturen sind nützlich, wenn hohe Erfolgsrate, Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit sind notwendig, um die Auswirkungen von Plasmiden für die Elektroporation und / oder Reagenz Substanzen, dh, enzymatischer Inhibitoren zu testen.

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

Retinalen Pigment Epithelzellen könnte als eine Zelle-Ersatz-Therapie für die fortgeschrittene Form der trockene altersbedingte Makuladegeneration dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen Modells der geografischen Atrophie und die subretinale Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment Epithelzellen auf dieses Modell der Krankheit.

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung eines transgenen Zebrafischmodells. Die Anpassung des Protokolls an die Modulation des Signalwegs unter Verwendung pharmakologischer Verbindungen ist ausführlich beschrieben. Eine MATLAB-Plattform zur Quantifizierung der RPE-Regeneration auf Basis von Pigmentierung wurde entwickelt und wird vorgestellt und diskutiert.

Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels

Erfahren Sie, wie Netzhautverletzungsmodelle bei Xenopus-Kaulquappen zur Untersuchung von Regenerationsmechanismen und der Rolle von Müller-Glia-Zellen erstellt werden. Diese Methode liefert wertvolle Erkenntnisse für potenzielle Therapien bei menschlichen Netzhauterkrankungen.

Generierung von Netzhautverletzungsmodellen bei Xenopus-Kaulquappen

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