Name: Aufbau von Hautmodellen für zahlreiche Anwendungen - von der zweidimensionalen (2D) Monokultur bis zur dreidimensionalen (3D) Multikultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Erfahren Sie kostengünstige Methoden zur Erstellung maßgeschneiderter 3D-Hautmodelle aus Keratinozyten, Fibroblasten und Melanozyten für realistische Zytotoxizitätstests.

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<meta charset="utf8"></head><body>Effiziente 3D-Hautmodelle für flexible Forschungsanwendungen

Die Haut ist eine kontinuierliche Struktur mit mehrzelligen Wechselwirkungen, die das reibungslose Funktionieren und die Homöostase dieses komplexen Organs offenbaren. Sie besteht aus morphologisch unterschiedlichen Schichten: der inneren Schicht - der Dermis - und der äußeren Schicht - der Epidermis. Neben der Epidermis unterscheiden wir zusätzlich das Stratum corneum (bestehend aus abgeflachten abgestorbenen Zellen - Korneozyten), das den größten Schutz gegen die äußere Umgebung bietet. Einige der wichtigsten passiven und aktiven Funktionen der Haut sind der Schutz des Körpers vor äußeren Einflüssen, die Teilnahme an den immunologischen Prozessen, die Sekretion, die Resorption, die Thermoregulation und die Wahrnehmung 1,2,3. Da es als eines der größten Organe des Körpers gilt, ist es unmöglich, den Kontakt mit verschiedenen Krankheitserregern, Allergenen, Chemikalien sowie ultravioletter (UV) Strahlung zu vermeiden. Daher ist es mit vielen Zelltypen mit spezifischen Funktionen strukturiert. Die wichtigsten Zelltypen in der Epidermis sind Keratinozyten (fast 90% aller Zellen mit strukturellen und immunologischen Funktionen in den tieferen Teilen der Epidermis, die aber später den Keratinisierungsprozess durchlaufen, um sich in der obersten Schicht der Epidermis in Korneozyten zu verwandeln), Melanozyten (nur 3%-7% der epidermalen Zellpopulation, die das UV-Schutzpigment Melanin produzieren) und die Langerhans-Zellen (aus dem Immunsystem). Im Falle der Dermis sind die Hauptzellen Fibroblasten (die Wachstumsfaktoren und Proteine produzieren), dendritische Zellen und Mastzellen (beides Zelltypen des Immunsystems)4,5,6. Darüber hinaus ist die Haut mit mehreren extrazellulären Proteinen ausgestattet (wie Kollagen Typ I und IV, Fibronektin und Laminin; Abbildung 1) und Proteinfasern (Kollagen und Elastin), die die spezifische Struktur der Haut gewährleisten, aber auch die Zellbindung, die Zelladhäsion und andere Wechselwirkungen fördern7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65773/65773fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Hautstruktur. Die Hautstruktur kennzeichnete vier Grundzelltypen, die in ihren einzelnen Schichten vorkommen und Proteine der extrazellulären Matrix unterschieden. Diese Abbildung wurde mit MS PowerPoint erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65773/65773fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Sicherheit von Kosmetika und pharmazeutischen Produkten ist ein sehr wichtiges Thema, und der Schutz der Gesundheit von Verbrauchern und Patienten hat Priorität8. Bis vor kurzem sollte dies durch zahlreiche Tests, auch an Tierversuchen, gewährleistet werden. Leider erforderten diese oft den Einsatz drastischer Methoden, die bei Tieren, die zu Forschungszwecken eingesetzt wurden (häufig Mäuse, Ratten und Schweine), Schmerzen und Leiden verursachten. Im Jahr 1959 wurden die Prinzipien der humanen Versuchstechnik (das 3R-Prinzip) eingeführt: (1 - Ersatz) Ersatz von Tieren in der Forschung durch In-vitro-, In-Sillico - oder ex vivo-Modelle , (2 - Reduzierung) Verringerung der Anzahl der für die Forschung verwendeten Tiere und (3 - Verfeinerung) Verbesserung des Wohlergehens der Tiere, die noch für die Forschung benötigt werden, und gleichzeitige Verbesserung der entwickelten Alternativmethoden9. Darüber hinaus sind kosmetische Tierversuche in der Europäischen Union (EU) gesetzlich geregelt. Am 11. September 2004 trat das Verbot von an Tieren getesteten Kosmetika in Kraft. Am 11. März 2009 hat die EU Tierversuche für kosmetische Inhaltsstoffe verboten. Der Verkauf von kosmetischen Mitteln, die aus neu an Tieren getesteten Inhaltsstoffen hergestellt wurden, war nicht erlaubt; Die Prüfung der Produkte an Tieren auf komplexe Probleme der menschlichen Gesundheit wie Toxizität bei wiederholter Verabreichung, Reproduktionstoxizität und Toxikokinetik war jedoch weiterhin akzeptabel. Seit dem 11. März 2013 ist es in der EU illegal, Kosmetika zu verkaufen, bei denen das fertige Produkt oder seine Inhaltsstoffe an Tieren getestet wurden10. Daher wird in der Kosmetik derzeit auf drei Ebenen geforscht: in vitro (Zellen), ex vivo (reale Gewebe) und in vivo (Freiwillige)11. Im Falle von Arzneimitteln besteht weiterhin die Notwendigkeit von Tierversuchen; Es wird jedoch deutlich reduziert und streng kontrolliert12.
Als Alternativmethoden zum Tierversuch und zur ersten Beurteilung der Wirksamkeit eines neuartigen Wirkstoffs werden die in vitro Hautzellkulturen eingesetzt. Die Isolierung verschiedener Arten von Hautzellen und ihre Kultivierung unter sterilen Laborbedingungen ermöglicht es, die Sicherheit und Toxizität von Wirkstoffen zu beurteilen. Hautzelllinien sind auch weithin anerkannte Modelle für die Forschung, da die Zellen von zertifizierten Unternehmen verkauft werden und die Ergebnisse in verschiedenen Labors vergleichbar sein können. Diese Tests werden in der Regel an einfachen 2D-Modellen der Monokulturen der menschlichen Hautzellen durchgeführt. Einige der fortschrittlicheren Modelle sind ihre Co-Kulturen (wie Keratinozyten mit Fibroblasten und Keratinozyten mit Melanozyten) sowie die dreidimensionalen Modelle, einschließlich gerüstfreier Kulturen (Kugeln) und gerüstbasierter Hautäquivalente der Epidermis, der Dermis oder sogar der Hautersatzstoffe in voller Dicke13. Es ist erwähnenswert, dass außer dem letzten Typ (Hautäquivalente) die übrigen nicht im Handel erhältlich sind und der Wissenschaftler sie bei Bedarf selbst herstellen muss.
Obwohl viele dieser Modelle gewartet wurden und heutzutage routinemäßig verkauft werden (Tabelle 1), werden ständig zusätzliche Modelle benötigt, um die meisten Ergebnisse zu validieren. Daher sollten die neu entwickelten Modelle die realen Interaktionen, die im menschlichen Körper stattfinden, besser nachbilden. Wenn eine Mischung von Zellen verschiedener Typen verwendet wird, um solche Modelle zu bilden, kann die Reproduktion des mehrzelligen Aspekts des Gewebes in vivo erreicht werden. Als Ergebnis entwickelt sich eine organotypische Kultur (Abbildung 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="2">Name</td>
			<td colspan="4">Beschreibung</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">Normale Haut</td>
			<td colspan="2">EpiSkin</td>
			<td colspan="4">Rekonstruierte menschliche Epidermis - Keratinozyten auf einer Kollagenmembran</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SkinEthic RHE</td>
			<td colspan="4">Rekonstruierte menschliche Epidermis - Keratinozyten auf einer Polycarbonat-Membran</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SkinEthic RHE-LC</td>
			<td colspan="4">Humanes epidermales Modell Langerhans-Zellen - Keratinozyten und Langerhans-Zellen auf einer Polycarbonat-Membran</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SkinEthic RHPE</td>
			<td colspan="4">Rekonstruierte menschliche pigmentierte Epidermis - Keratinozyten und Melanozyten auf einer Polycarbonatmembran</td>
		</tr><tr><td colspan="2">T-Haut</td>
			<td colspan="4">Rekonstruiertes humanes Hautmodell in voller Dicke - Keratinozyten auf einer Schicht von Fibroblasten, die auf einer Polycarbonatmembran gezüchtet wurden</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Modell Phenion FT Skin</td>
			<td colspan="4">Keratinozyten und Fibroblasten im Hydrogel</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Haut mit einer Krankheit</td>
			<td colspan="2">Melanom FT Hautmodell</td>
			<td colspan="4">Normale humane Keratinozyten und Fibroblasten mit humaner maligner Melanom-Zelllinie A375</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Psoriasis-Gewebemodell</td>
			<td colspan="4">Normale humane Keratinozyten und Fibroblasten</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Die beliebtesten kommerziellen Hautäquivalente für verschiedene Studien.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65773/65773fig02.jpg"> Abbildung 2: Komplexität verschiedener in vitro Modelle. Die Beziehung zwischen der Komplexität verschiedener In-vitro-Modelle , um einen Organismus nachzubilden, und den realen Wechselwirkungen, die direkt im menschlichen Körper stattfinden. Die Figur wurde aus dem Set "Mikrobiologie und Zellkultur" von Servier Medical Art by Servier (https://smart.servier.com/) modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65773/65773fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Eine der wichtigsten Einschränkungen der kommerziellen Äquivalente ist die Verfügbarkeit von nur sehr allgemeinen Forschungsmodellen mit wenigen Zelltypen (typischerweise 1-2, selten 3). Es gibt jedoch viel mehr Zellen in der Haut, und ihre Wechselwirkung miteinander kann eine bessere oder schlechtere Verträglichkeit verschiedener Inhaltsstoffe gewährleisten14. Das Fehlen einiger Immunkomponenten kann seinen Wert in verschiedenen Arten der Forschung, einschließlich der Immuntherapie, verringern. Dies ist ein ernstes Problem, da das Melanom aufgrund des frühen Auftretens von Metastasen und der häufigen Resistenz gegen die angewandte Behandlung ein lebensbedrohlicher Hautkrebs ist15. Um das Modell der künstlichen Haut zu verbessern, versuchen die Forscher, eine Co-Kultur von Immunzellen mit Zelllinien und Organoiden zu etablieren16, was als große Verbesserung der untersuchten Modelle angesehen wird. Zum Beispiel sind Mastzellen an vielen physiologischen (Wundheilung, Gewebeumbau) und pathologischen (Entzündung, Angiogenese und Tumorprogression) Prozessen in der Haut beteiligt17. Daher kann ihr Vorkommen im Modell die Reaktion des Modells auf die untersuchte Verbindung erheblich verändern. Schließlich fehlen noch viele hautbezogene Informationen, die nur durch Grundlagenforschung entdeckt werden können. Aus diesem Grund ist die Entwicklung und Verfeinerung verschiedener künstlicher Hautmodelle (Tabelle 2) ein so wichtiges Unterfangen. In diesem Artikel werden verschiedene Verfahren zum Erstellen erweiterter Hautmodelle vorgestellt, einschließlich Kugeln und Hautäquivalenten.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>In-vitro-Hautmodell</td>
			<td>Versuch, Wechselwirkungen im Gewebe nachzubilden</td>
			<td>Beispiele für die verwendeten Zellen</td>
		</tr><tr><td rowspan="12">2D- oder 3D-Zellkultur</td>
			<td rowspan="3">Epidermis</td>
			<td>Keratinozyten</td>
		</tr><tr><td>Melanozyten</td>
		</tr><tr><td>Keratinozyten + Melanozyten</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Lederhaut</td>
			<td>Fibroblasten</td>
		</tr><tr><td>Mastzellen</td>
		</tr><tr><td>Fibroblasten + Mastzellen</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">Haut</td>
			<td>Keratinozyten + Fibroblasten</td>
		</tr><tr><td>Keratinozyten + Mastzellen</td>
		</tr><tr><td>Melanozyten + Fibroblasten</td>
		</tr><tr><td>Melanozyten + Mastzellen</td>
		</tr><tr><td>Keratinozyten + Fibroblasten + Melanozyten</td>
		</tr><tr><td>Keratinozyten + Fibroblasten + Mastzellen</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Beispiele für Zelltypmischungen zur Nachbildung von Hautgewebe in 2D- und 3D-Kulturen.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Platte für adhärente Zellkultur</td><td>Biologix Europe GmbH</td><td>07-6024-35</td><td></td></tr><tr><td>%&ndash; 38% HCL</td><td>Chempur</td><td></td> <td>115752837-60</td></tr> <tr><td>mm Zellkultur Petrischale&nbsp;</td><td>Nest</td><td></td> <td>705001-Avidin</td></tr><tr><td>&minus; Sulforhodamin 101</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2348-5MG-Inverses</td><td></td></tr> <tr><td>Hellfeldmikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX41-Calciumchlorid</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Avantor</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>874870116-Zellkulturflasche T75 für adhärente Zellen</td><td>Genoplast</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>G77080033-Zentrifugenröhrchen 15 mL</td><td>GoogLab Scientific</td><td></td> <td>G66010522-CO2-Inkubator</td></tr><tr><td></td><td>Heal Force</td><td>Galaxy 170R-Col1A2</td><td></td></tr> <tr><td>Antikörper, hergestellt in Kaninchen</td><td>Novus</td><td>NBP2-92790-Corning</td><td></td></tr><tr><td>(R) Transwell(R) Polycarbonat</td><td>Corning</td><td>CLS3422-48EA-Cytokeratin</td><td></td></tr> <tr><td>14 Antikörper, hergestellt in Maus</td><td>Novus</td><td>NBP1-79069-DPX</td><td></td></tr> <tr><td>Eindeckmittel für die Histologie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>06522-100ML-</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>VWR Chemicals</td><td>L0102-500-Eosin</td><td></td></tr> <tr><td>Y</td><td>Kolchem-0,5</td><td></td> <td>% wässrige Lösung</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001-Eppendorf</td><td></td></tr> <tr><td>Tube 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.691-Ethylalkohol</td><td></td></tr> <tr><td>absolut 99,8%</td><td>Avantor</td><td>396480111</td><td>in Reinstwasser auf das erforderliche Maß verdünnt Konzentrationen&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td></td> <td>10270106-Fluoreszierendes</td></tr> <tr><td>inverses Mikroskop&nbsp;</td><td>Olympus</td> IX71-Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper<td></td><td></td></tr>, <tr><td>konjugiert mit FITC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0257-1 ml</td><td></td>,</tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, konjugiert mit FITC</td><td>Novus</td><td>NB7159-Harris</td><td>,</td></tr> <tr><td>Hämatoxylin</td><td>Kolchem-1</td><td></td> <td>mg/ml in 95 % Ethanol</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570-Laminar</td><td></td></tr><tr><td> Kammer</td><td>Heal Force</td><td>HFSafe-1200-Melan-A</td><td></td></tr> <tr><td>Antikörper, hergestellt in Maus</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-20032-Mikrotom</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microm</td><td>HM355S-NaOH</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Avantor</td><td></td><td></td></tr> 810981997-Paraffinpastillen <tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.07164-Paraformaldehyd</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td> <td>1581227-Penicillin</td><td></td></tr><tr><td>/Streptomycin-Lösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333-Pipettenspitze</td><td></td></tr><tr><td>, 1000 & Mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.305-Pipettenspitze</td><td></td></tr><tr><td>, 20 & Mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3021-Pipettenspitze</td><td></td></tr><tr><td>, 200 & Mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.303-Pluronic</td><td></td></tr> <tr><td>F-127</td><td>BASF</td><td></td> <td>50401036-Serologische</td></tr> <tr><td>Pipette 10 mL</td><td>GoogLab Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>G33270011-Serologische Pipette 25 mL</td><td>GoogLab Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>G33280011-Serologische Pipette 5 mL</td><td>GoogLab Scientific</td> <td>G33260011-Natriumbicarbonat</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-Natriumbicarbonat</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Chempur</td><td>118105307</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25% ige Lösung, phenolrot</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>25200072-Typ</td></tr> <tr><td>1 Kollagen</td><td>IBIDI</td><td>50201-U-Boden</td><td></td></tr> <tr><td>96-Well-Platte</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925500-Xylol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>534056</td><td>-</td></tr></tbody></table>

aufbau von hautmodellen für zahlreiche anwendungen - von der zweidimensionalen (2d) monokultur bis zur dreidimensionalen (3d) multikultur

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Aufbau von Hautmodellen für zahlreiche Anwendungen - von der zweidimensionalen (2D) Monokultur bis zur dreidimensionalen (3D) Multikultur

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

building-up-skin-models-for-numerous-applications-from-two

Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

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Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

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Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

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Generierung eines vereinfachten dreidimensionalen Skin-on-a-Chip-Modells in einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform

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