Name: Arteriovenöse Metabolomik zur Messung des In-vivo-Metabolitenaustauschs in braunem Fettgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 55 s
Description: Erfahren Sie die arteriovenöse Metabolomik zur Messung des In-vivo-Metabolitenaustauschs in braunem Fettgewebe mittels GC-MS im Mausmodell. Diese Methode ermöglicht schnellere Validierung genetischer Modelle und liefert Einblicke in den Energiehaushalt.

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Wir danken allen Mitgliedern der Choi- und Jung-Laboratorien für die methodische Diskussion. Wir danken C. Jang und D. Guertin für Ratschläge und Rückmeldungen. Wir danken M.S. Choi für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von NRF-2022R1C1C1012034 an S.M.J. finanziert; NRF-2022R1C1C1007023 bis D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 an S.M.J. und D.W.C. Diese Arbeit wurde von der Chungnam National University für W.T.K. unterstützt. Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden mit BioRender (http://biorender.com/) erstellt.

Alle Versuche wurden mit Genehmigung des Sungkyunkwan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt. Die Mäuse wurden in einer von der IACUC zugelassenen Tierhaltung untergebracht, die sich in einem Reinraum bei 22 °C und 45 % Luftfeuchtigkeit nach einem täglichen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus befand. Sie wurden in belüfteten Racks gehalten und hatten Zugang zu einer Standard-Chow-Diät ad libitum (bestehend aus 60 % Kohlenhydraten, 16 % Protein und 3 % Fett). Einstreu und Nistmaterial wurden wöchentlich gewechselt. Für diese Studie wurden männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 12 Wochen und einem Gewicht zwischen 25 g und 30 g verwendet. Diese Tiere wurden von einem kommerziellen Lieferanten bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Modulation der Stoffwechselaktivität des braunen Fettgewebes durch Temperaturakklimatisierung und pharmakologische Stimulation
ANMERKUNG: Die Temperaturakklimatisierung über mehrere Tage bis Wochen oder die pharmakologische Stimulation mit β-adrenergen Rezeptoragonisten sind häufig eingesetzte Methoden zur Modulation der BAT-Aktivität1. Daher wird im Folgenden ein kurzer Überblick über die Methode gegeben, damit die Leser je nach Bedarf den geeigneten Ansatz wählen können. Um metabolisch inaktive (weniger thermogene) BAT zu erhalten, wird für C57BL/6J-Mäuse eine warme Basistemperatur gewählt, die als Thermoneutralität (28-30 °C) bezeichnet wird. Dieser Bereich stellt sicher, dass die Mäuse keine zusätzliche Energie aufwenden müssen, um eine konstante Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Um metabolisch mäßig oder hochaktiv (thermogen) BVT zu erhalten, können milde Kälte (20-22 °C) bzw. starke Kälte (6 °C) gewählt werden. Für die Zwecke dieses Experiments wurden Mäuse unter Standard-Haltungsbedingungen bei 22 °C aufgezogen, die zwar für Mäuse leicht kalt waren, aber keine pharmakologischen Stimulationen beinhalteten.
<ol><li>Temperaturakklimatisierung<ol><li>Trennen Sie die Mäuse mindestens 1 Woche vor Beginn der Temperaturakklimatisierung, um 1 oder 2 Mäuse pro Käfig unterzubringen. Bereiten Sie Nagetier-Inkubatoren, die mit Belüftung, Temperatur- und Feuchtigkeitsregelung ausgestattet sind, mit den gewünschten Bedingungen vor.</li>
		<li>Bringen Sie die Käfige an den für die gewählte Art der Temperaturakklimatisierung geeigneten Tagen in ihre jeweiligen Nagetier-Inkubatoren.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Mäuse gleichmäßig auf alle Gruppen verteilt ist, mit entweder 1 oder 2 Mäusen pro Käfig. Ein einzelnes Gehäuse wird bevorzugt, da es im Vergleich zu Gruppengehäusen43 empfindlicher auf temperaturinduzierte physiologische Veränderungen reagiert. Hier sind die spezifischen Unterbringungsbedingungen für jede Gruppe:<ol><li>Thermoneutralitätsgruppe (30 °C): Halten Sie die Mäuse dieser Gruppe bis zu vier Wochen lang kontinuierlich bei einer Temperatur von 30 °C.</li>
			<li>Starke Kältegruppe: In dieser Gruppe werden die Mäuse zunächst bei 18 °C ohne Nistmaterial untergebracht. Sie werden einen allmählichen wöchentlichen Temperaturrückgang erleben, der in der vierten Woche 6 °C erreicht. Der Temperaturverlauf ist wie folgt: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.</li>
			<li>Mild kalte Gruppe (20-22 °C): Die Mäuse dieser Gruppe werden in Nagetier-Inkubatoren unter den gleichen Bedingungen wie die zuvor erwähnten Standard-Haltungsbedingungen untergebracht.</li>
			<li>Akute Kälteprobleme: Bei akuten Kälteproblemen setzen Sie 1-2 Mäuse pro Käfig ohne Nistmaterial aus und setzen Sie sie bis zu 8 Stunden lang einem Nagetier-Inkubator aus, der auf 6 °C eingestellt ist. ANMERKUNG: Diese Gehäusebedingungen und Temperaturschwankungen sind für die Untersuchung der Auswirkungen unterschiedlicher Temperaturumgebungen auf die BAT-Aktivität und den Stoffwechsel von wesentlicher Bedeutung.</li>
		</ol></li>
		<li>Wechseln Sie die Käfige und füllen Sie jede Woche Futter und Wasser auf. Akklimatisieren Sie die Käfige mindestens 24 Stunden vor der Supplementierung bei ihrer jeweiligen Temperatur (Nagetier-Inkubator). HINWEIS: Um die Störung des entsprechenden Temperaturreizes zu verhindern, ist es wichtig, keine Mäuseanreicherungen bereitzustellen, die zum Nestbau führen könnten. Als Reaktion auf starke Kälte verbrauchen Mäuse mehr Energie, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, was zu einer erhöhten Nahrungsaufnahme und höheren Ausscheidungsraten führt. Daher ist es wichtig, die Käfige mindestens zwei- bis dreimal pro Woche zu kontrollieren (gemäß den lokalen institutionellen Richtlinien), um sicherzustellen, dass die Mäuse ausreichend mit Futter und Wasser versorgt werden und dass die Käfige nicht übermäßig nass sind. Diese Überwachung ist unerlässlich, um das Wohlbefinden und die Gesundheit der Mäuse während der Studie zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Pharmakologische Stimulation1 mit dem β3-adrenergen Rezeptoragonisten CL316,243<ol><li>Um die stimulierende Wirkung zu maximieren, sollten die Mäuse vor der Injektion 2-4 Wochen lang bei Thermoneutralität (30 °C) vorgehalten werden.</li>
		<li>Nach der Akklimatisierungsphase 1 mg/kg CL316.243 intraperitoneal injizieren. HINWEIS: Bei chronischer Stimulation mit dem β3-adrenergen Rezeptoragonisten (z. B. von 3 Tagen bis zur 1,44,45. Woche) sind aufgrund der Arzneimittelstabilität tägliche Injektionen erforderlich. Verdünntes CL316.243 sollte aus Stabilitätsgründen am Tag der Injektion zubereitet werden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Arteriovenöse Blutentnahme
HINWEIS: Mäuse über 12-14 Wochen werden am besten für die arteriovenöse Blutentnahme empfohlen. Jüngere Mäuse haben möglicherweise keine ausreichend dimensionierten Sulzer-Venen, ein ausgeprägtes Blutgefäß, das spezifisch venöses Blut aus dem interscapularen BAT46 ableitet.
<ol><li>Betäuben Sie sanft mit dem kalibrierten Verdampfer mit 3 % Isofluran für die Induktion (in einer 205 x 265 x 200 mm großen Kammer) und 2 % Isofluran für die Aufrechterhaltung (mit einer Gasanästhesiemaske). HINWEIS: Die gesamte arteriovenöse Blutentnahme sollte sofort nach der Anästhesie durchgeführt werden. Ein wasserbeheiztes Wärmekissen kann während der Anästhesie verwendet werden, um die Körperkerntemperatur aufrechtzuerhalten. VORSICHT: Isofluran ist leicht flüchtig und giftig, wenn es eingeatmet wird. Daher muss die Primäranästhesie unter einem Abzug durchgeführt werden.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Reflexe des Tieres, wie z. B. das Zurückziehen der Pfote, um sicherzustellen, dass die Betäubung eine angemessene Tiefe erreicht hat.</li>
	<li>Entnahme von venösem Blut aus der Sulzer-Vene<ol><li>Positionieren Sie die Maus so, dass sie die Rückenhaut freilegt, und bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch einen Zehenkniff direkt vor dem Einschnitt. Befeuchten Sie die Rückenhaut mit reichlich 70%igem Ethanol, um eine Haarablösung zu verhindern, und machen Sie einen Schnitt entlang des Rückens vom unteren Teil des Brustkorbs bis zum Hals. HINWEIS: Der interskapuläre BAT befindet sich direkt unter der Haut und besteht aus zwei Fettpolstern, die von dünnem weißem Fettgewebe bedeckt sind. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Maus durch die Gasanästhesiemaske unter Narkose bleibt.</li>
		<li>Heben Sie den Interscapular BAT vorsichtig mit einer gebogenen Spitze an und schneiden Sie vorsichtig das anhaftende Gewebe, von dem die meisten Muskeln sind. Heben Sie das Fettpolster in Richtung Kopf an, fahren Sie fort, das anhaftende Gewebe zu schneiden und die Region vorsichtig zu öffnen, bis die Sulzer-Vene (ein großes Y-förmiges dunkelrotes Gefäß, das mit beiden Fettpolstern des interskapulären BAT verbunden ist) freiliegt. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Kapillargefäße des Muskelgewebes, die mit dem vorderen und seitlichen Bereich des interskapulären BAT verbunden sind, nicht zu durchtrennen, da dies die Menge und Qualität des Blutabflusses aus der Sulzer-Vene erheblich reduziert.</li>
		<li>Durchtrennen Sie vorsichtig die Sulzer-Vene und entnehmen Sie ca. 40 μl Blut mit 200-μl-Pipettenspitzen und einer P100-Pipette. Bewahren Sie das Blut in einem Blutentnahmeröhrchen auf und halten Sie das Röhrchen bis zur Serumentnahme auf Eis. HINWEIS: Es ist wichtig, Blut knapp unterhalb des Y-förmigen Teilungspunkts der Sulzer-Vene zu entnehmen, um eine Kontamination des Blutes aus der oberen Hohlvene47 zu verhindern. Wenn zu viel Blut entnommen wird, werden die Eigenschaften der Sulzer-Vene beeinträchtigt. Stellen Sie daher sicher, dass Sie die minimale Menge Blut aus der Sulzer-Vene entnehmen, die für die Analyse benötigt wird. Seien Sie vorsichtig bei der Auswahl von Blutentnahmeröhrchen, da Serum und Plasma unterschiedliche Metabolitenprofile ergeben 48,49,50. Für die Plasmagewinnung ist es notwendig, heparinbeschichtete Röhrchen zu verwenden. In diesem Experiment wurden mit Gerinnungsaktivatoren beschichtete Röhrchen ausgewählt, um Serum zu erhalten. Auf keinen Fall sollten EDTA-beschichtete Röhrchen verwendet werden, da EDTA die massenspektrometrischen Signale erheblich beeinflusst51,52.</li>
	</ol></li>
	<li>Entnahme von arteriellem Blut aus der linken Herzkammer<ol><li>Drehen Sie die Maus um, ohne den Kontakt zum Nasenkonus zu verlieren, um die ventrale Haut freizulegen. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch ein Einklemmen der Zehen, bevor Sie den Schnitt vornehmen. Befeuchten Sie die ventrale Haut mit reichlich 70%igem Ethanol, um eine Haarablösung zu verhindern, und öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig mit einer Schere, um das Herz freizulegen, ohne die innere Struktur zu beschädigen.</li>
		<li>Punktieren Sie den Scheitelpunkt der linken Herzkammer genau mit einer 1-ml-Spritze mit einer 29 G (1/2") Nadel. Führen Sie zwei Drittel einer 1/2-Zoll-Nadel 3-5 mm rechts horizontal von der Herzspitze ein (Abbildung 1B) und ziehen Sie die Spritze zurück, um Blut aus der linken Herzkammer zu entnehmen (50-100 μl). Das Blut aus der linken Herzkammer ist sauerstoffreiches arterielles Blut, das hellrot ist. Bewahren Sie das Blut in einem Blutentnahmeröhrchen auf und halten Sie das Röhrchen bis zur Serumentnahme auf Eis. HINWEIS: Für den Zugang zum Herzen sollte ein minimaler Schnitt in der Brusthöhle gemacht werden. Ein übermäßiger Schnitt kann zu lokalen Blutungen führen, die in der Folge zu niedrigem Blutdruck führen können. Dies könnte die Qualität des arteriellen Blutes, das aus der linken Herzkammer entnommen wird, beeinträchtigen. Vermeiden Sie es, das Herz zu drehen oder umzudrehen, da es dadurch schwierig wird, die genaue Position der linken Herzkammer zu bestimmen.</li>
		<li>Euthanasie durchführen und mit einer geeigneten Methode nach den Richtlinien der lokalen Institutionen sicherstellen. Zum Beispiel kann die Euthanasie durch eine Luxation des Gebärmutterhalses durchgeführt und durch das Aufhören des Herzschlags bestätigt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Blutproben werden bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Der Überstand sollte je nach Art des verwendeten Blutentnahmeröhrchens entweder Serum oder Plasma enthalten. Man kann hier aufhören und die Proben bei -20 °C bis zur Serumverarbeitung für die GC-MS-Analyse lagern. HINWEIS: Eine Hämolyse kann möglicherweise aufgetreten sein, wenn ein rot gefärbter Überstand beobachtet wird. Um eine Hämolyse zu vermeiden, wird die Probe vorgewirbelt, bevor die Gerinnung abgeschlossen ist. Einige mit roten Blutkörperchen angereicherte Metaboliten, einschließlich Glutamin und Laktat, könnten zu einer Fehlinterpretation der Daten führen, obwohl die meisten Metaboliten möglicherweise nicht signifikant von der Hämolyse betroffen sind. Es wird empfohlen, das Serum/Plasma innerhalb einer Woche zu analysieren.</li>
</ol>3. Metabolitenextraktion aus Serum und chemische Derivatisierung
<ol><li>Vorbereitung für die Extraktion ANMERKUNG: Alle Methoden, einschließlich Metabolitenextraktion, Derivatisierung und Datenanalyse, sind leicht modifizierte Versionen der zuvor beschriebenen Methoden53,54.<ol><li>Bereiten Sie den Extraktionspuffer vor, indem Sie 100 μM Lösung von DL-Norvalin, interner Standard (siehe Materialtabelle), zu Methanol in MS-Qualität geben.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass alle experimentellen Verfahren auf Eis durchgeführt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>10 μl Mäuseserum, das entweder aus der Sulzer-Vene oder dem linken Ventrikel extrahiert wurde, werden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 40 μl Extraktionspuffer überführt.</li>
	<li>Um Zelltrümmer und Proteine zu entfernen, werden die Serumproben kurz vortext, gefolgt von der Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit (18.000 x g) für 30 min bei 4 °C.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation werden 40 μl Überstand vorsichtig in ein Glasfläschchen überführt, gefolgt von einer 3-stündigen Trocknung in einer Vakuumzentrifuge bei 4 °C. HINWEIS: Anstelle von Kunststoffröhrchen wird ein Glaseinsatz (siehe Materialtabelle) empfohlen, da während des nachfolgenden Derivatisierungsschritts kunststoffreaktive Chemikalien verwendet werden.</li>
	<li>Die getrockneten Proben werden zwei aufeinanderfolgenden Derivatisierungsschritten für die GC-MS-Analyse der Serummetaboliten unterzogen. HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten aufgrund der Reizgefahr der Lösungsmittel unter einem Abzug durchgeführt werden.<ol><li>Resuspendieren Sie die getrockneten Serumextrakte in 30 μl 10 mg/ml Methoxyaminhydrochlorid (siehe Materialtabelle), das in Pyridin gelöst ist, und inkubieren Sie es bei 37 °C für 30 Minuten.</li>
		<li>Derivatisieren Sie Proben für die Silylierung von Metaboliten mit 70 μl N-Methyl-N-tert-butyldimethylsilylrifluoracetamid (MTBSTFA, siehe Materialtabelle) bei 70 °C für 1 h. HINWEIS: Aufgrund der Derivatisierungslösungsmittel, die mit Kunststoff reagieren, wird in den folgenden Schritten die Verwendung einer Glasspritze anstelle einer Kunststoffspitze empfohlen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Metabolomics-Analyse mittels GC-MS
HINWEIS: Eine einzelne vierfache GC-MS (siehe Materialtabelle) wurde verwendet, um die verschiedenen Serummetaboliten, einschließlich Kohlenhydrate, Aminosäuren und TCA-Zyklus-Zwischenprodukte, in derivatisierten Proben aus der Sulzer-Vene und dem linken Ventrikel zu messen. Alternativ können auch andere Säulen verwendet werden, wobei die experimentellen Einstellungen einschließlich des Temperaturprogramms je nach verwendetem Säulentyp variieren können.
<ol><li>Injizieren Sie 1 μl der derivatisierten Probe im splitless-Modus bei 280 °C (Eintrittstemperatur) unter Verwendung von Helium als Trägergas mit einer Durchflussrate von 1.500 ml/min (Sollwert) in den GC.</li>
	<li>Stellen Sie den Quadrupol auf 200 °C und die GC-MS-Schnittstelle auf 300 °C ein. HINWEIS: Das Ofenprogramm für alle Metabolitenanalysen beginnt bei 60 °C, wird 1 Minute lang gehalten und dann mit einer Geschwindigkeit von 10 °C/min erhöht, bis die Temperatur 320 °C erreicht.</li>
	<li>Erfassen Sie Daten durch Elektronenionisation (EI) bei 70 eV und erfassen Sie die Probendaten im Scanmodus (50-550 m/z)53. Alle in dieser Studie verwendeten Metaboliten wurden zuvor mit Standards zur Bestätigung von Massenspektren und Retentionszeiten validiert.</li>
	<li>Führen Sie die Peakflächenintegration mit einer handelsüblichen Analysesoftware durch (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Ordnen Sie die Verbindungen der Produktion jedes TBMDS-Derivats zu. Dann erhalten Sie das Extraktions-Ionenchromatogramm (EIC), indem Sie den m/z-Wert des Fragmentions in den entsprechenden Peakbereich integrieren, und exportieren Sie es dann. Die Fragmentionen sind in Tabelle 1 dargestellt. HINWEIS: Die EIC jeder Verbindung wurde durch die von DL-Norvalin in jeder Probe normalisiert. Die Daten werden durch die Log-2-Sulzer-Vene zum linken Ventrikel (Log2(SV/LV)) unter Verwendung jedes normierten EIC-Wertes dargestellt.</li>
</ol>

Erforschung des Metabolitenaustauschs im braunen Fettgewebe

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte zu melden haben.

Ein entscheidender Schritt zum Verständnis des metabolischen Potenzials von BAT im Energiehaushalt des gesamten Körpers besteht darin, zu definieren, welche Nährstoffe es verbraucht, wie sie metabolisch verarbeitet werden und welche Metaboliten in den Kreislauf freigesetzt werden. Dieses Protokoll führt eine spezielle arteriovenöse Probenahmetechnik ein, die den Zugang zum venösen Gefäßsystem von interscapularer BAT und systemischen arteriellen Gefäßen bei C57BL/6J-Mäusen ermöglicht, die kürzlich von Park et al. entwicke...

Braunes Fettgewebe (BAT) besitzt eine einzigartige Eigenschaft des Energieverbrauchs, die als nicht-zitternde Thermogenese (NST) bekannt ist und sowohl mitochondriale Entkopplungsprotein 1 (UCP1)-abhängige als auch UCP1-unabhängige Mechanismen 1,2,3,4,5 umfasst. Diese charakteristischen Merkmale deuten darauf hin, dass BAT an der Regulation des systemischen Stoffwechsels und der Pathogenese von Stoffwechselerkrankungen, einschließlich Adipositas, Typ-2-Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebskachexie, beteiligt ist 6,7,8. Neuere retrospektive Studien haben einen umgekehrten Zusammenhang zwischen der BAT-Masse und/oder ihrer Stoffwechselaktivität mit Fettleibigkeit, Hyperglykämie und kardiometabolischer Gesundheit beim Menschen gezeigt 9,10,11.
In jüngster Zeit wurde BAT als metabolische Senke vorgeschlagen, die für die Aufrechterhaltung der NST verantwortlich ist, da sie erhebliche Mengen an zirkulierenden Nährstoffen als thermogenen Brennstoff benötigt 6,7. Darüber hinaus kann BAT bioaktive Faktoren erzeugen und freisetzen, die als braune Adipokine oder BATokine bezeichnet werden und als endokrine und/oder parakrine Signale wirken, was auf seine aktive Beteiligung an der metabolischen Homöostase auf Systemebene hinweist 12,13,14,15. Daher sollte das Verständnis des Nährstoffstoffwechsels von BAT unser Verständnis seiner pathophysiologischen Bedeutung beim Menschen verbessern, die über seine herkömmliche Rolle als thermoregulatorisches Organ hinausgeht.
Metabolomische Studien mit stabilen Isotopen-Tracern in Kombination mit klassischen Nährstoffaufnahmestudien mit nicht metabolisierbaren Radiotracern haben unser Verständnis darüber, welche Nährstoffe bevorzugt von BAT aufgenommen werden und wie sie verwertet werden, erheblich verbessert 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. So haben beispielsweise Studien zu radioaktiven Tracern gezeigt, dass kaltaktivierte BAT Glukose, Lipoprotein-gebundene Fettsäuren und verzweigtkettige Aminosäuren 16,17,18,19,20,21,22,23,27 aufnimmt. Die jüngste Isotopenverfolgung in Kombination mit metabolomischen Studien hat es uns ermöglicht, das metabolische Schicksal und den Fluss dieser Nährstoffe in Geweben und kultivierten Zellen zu messen 24,25,26,28,29,30. Diese Analysen konzentrieren sich jedoch in erster Linie auf die individuelle Verwertung von Nährstoffen, so dass wir nur begrenzte Kenntnisse über die Rolle von BAT auf Systemebene beim Austausch von Organmetaboliten haben. Fragen zu den spezifischen Reihen zirkulierender Nährstoffe, die von BAT verbraucht werden, und zu ihren quantitativen Beiträgen in Bezug auf Kohlenstoff und Stickstoff sind nach wie vor schwer fassbar. Darüber hinaus steht die Untersuchung, ob BAT aus Metaboliten gewonnene BATokine (z. B. Lipokine) unter Verwendung von Nährstoffen erzeugen und freisetzen kann, erst am Anfang 12,13,14,15,31,32.
Die arteriovenöse Blutanalyse ist ein klassischer physiologischer Ansatz, um die spezifische Aufnahme oder Freisetzung von zirkulierenden Molekülen in Organen/Geweben zu beurteilen. Diese Technik wurde zuvor auf die interskapuläre BAT von Ratten angewendet, um Sauerstoff und verschiedene Metaboliten zu messen, wodurch BAT als Hauptort der adaptiven Thermogenese mit seinem katabolen Potenzial etabliertwurde 33,34,35,36,37. Kürzlich wurde eine arteriovenöse Studie mit interscapularer BAT der Ratte mit einem Trans-Omics-Ansatz gekoppelt, was zur Identifizierung unentdeckter BATokine führte, die durch thermogen stimuliertes BAT38 freigesetzt wurden.
Jüngste Fortschritte in der hochempfindlichen Gaschromatographie- und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS und LC-MS)-basierten Metabolomik haben das Interesse an arteriovenösen Studien zur quantitativen Analyse des organspezifischen Metabolitenaustauschs neu entfacht 39,40,41. Diese Techniken mit ihrem hohen Auflösungsvermögen und ihrer Massengenauigkeit ermöglichen die umfassende Analyse eines breiten Spektrums von Metaboliten mit kleinen Probenmengen.
In Übereinstimmung mit diesen Fortschritten wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie die arteriovenöse Metabolomik erfolgreich für die Untersuchung von BAT auf Mausebene angepasst, wodurch die quantitative Analyse der Metabolitenaustauschaktivitäten bei BAT unter verschiedenen Bedingungen ermöglichtwurde 42. In diesem Artikel wird ein BAT-gerichtetes arteriovenöses Metabolomik-Protokoll unter Verwendung von GC-MS in einem C57BL/6J-Mausmodell vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>0,5-20 & Mikro; L Filterspitzen</td><td>Axygen</td><td>AX. TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze mit aufgesetzter Nadel - 26 G 5/8"</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 5977B GC/MSD (massenselektiver Detektor)</td><td>Agilent</td><td>G7077B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7693A Autosampler</td><td>Agilent</td><td>G4513A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 8890 GC System</td><td>Agilent</td><td>G3542A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent J& W GC-Säule (Kapilar-Säule) HP-5MS UI</td><td>Agilent</td><td>19091S-433UI</td><td></td></tr><tr><td>Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative Analyse (Quant-My-way)</td><td>Agilent</td><td>G3335-90240</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Maus</td><td>DBL</td><td>C57BL/6JBomTac</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -50 &deg; C Kühlfalle (mit Edelstahldeckel)</td><td>LABCONCO&nbsp;</td><td></td><td></td>7811041</tr><tr><td>DL-Norvaline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7502-25G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Zentrifuge 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Röhrchen 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Glaseinsatz 250 &mu; L&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5181-1270</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS-Qualität)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q34966-1L</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyaminhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>226904-5G</td><td></td></tr><tr><td>Mikrovette&nbsp; 200 Serum, 200 & Mikro; L, Kappe rot, flacher Boden</td><td>Sarstedt</td><td>20.1290.100</td><td></td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>394882-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Pyridin (wasserfrei, 99,8%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970-100ML</td><td></td></tr><tr><td>gekühltes CentriVap Komplette Vakuumkonzentratoren</td><td>LABCONCO&nbsp;</td><td></td><td></td>7310041</tr><tr><td>Nagetierdiät</td><td>SAFE</td><td>SAFE R+40-10</td><td></td></tr><tr><td>Nagetier-Inkubator</td><td>Power Scientific</td><td>RIT33SD</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafeine Stiftnadeln - 29 g 1/2"</td><td>BD Biosciences</td><td>328203</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchenkappe 9 mm</td><td>Agilent</td><td>5190-9067</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchen, ambr scrw wrtn 2 mL</td><td>Agilent</td><td>5190-9063</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchen, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr></tbody></table>

arteriovenöse metabolomik zur messung des in-vivo-metabolitenaustauschs in braunem fettgewebe

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

Braunes Fettgewebe (BAT) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der metabolischen Homöostase durch einen einzigartigen Energieverbrauchsprozess, der als nicht-zitternde Thermogenese bekannt ist. Um dies zu erreichen, verwendet BAT ein vielfältiges Menü an zirkulierenden Nährstoffen, um seinen hohen Stoffwechselbedarf zu decken. Darüber hinaus sezerniert BAT aus Metaboliten gewonnene bioaktive Faktoren, die entweder als Stoffwechselbrennstoffe oder Signalmoleküle dienen können, was die BAT-vermittelte Kommunikation innerhalb von Geweben und/oder zwischen Geweben erleichtert. Dies deutet darauf hin, dass BAT aktiv am systemischen Metabolitenaustausch beteiligt ist, ein interessantes Merkmal, das allmählich erforscht wird. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vivo optimierte arteriovenöse Metabolomik auf Mausebene vor. Das Protokoll konzentriert sich auf relevante Methoden zur thermogenen Stimulation und eine arteriovenöse Blutentnahmetechnik unter Verwendung der Sulzer-Vene, die selektiv interskapuläres BAT-abgeleitetes venöses Blut und systemisches arterielles Blut ableitet. Als nächstes wird ein auf Gaschromatographie basierendes Metabolomik-Protokoll unter Verwendung dieser Blutproben demonstriert. Der Einsatz dieser Technik sollte das Verständnis des BVT-regulierten Metabolitenaustauschs auf der Ebene der Organe erweitern, indem die Nettoaufnahme und -freisetzung von Metaboliten durch BVT gemessen wird.

Abbildung 1 zeigt das experimentelle Schema der BAT-optimierten AV-Metabolomik. Wie im Abschnitt "Protokoll" erwähnt, werden Mäuse zur Gewinnung von differentiell stimuliertem braunem Fettgewebe einer Temperaturakklimatisierung mit Nagetier-Inkubatoren unterzogen oder erhalten eine pharmakologische Verabreichung wie β-adrenerge Rezeptoragonisten. Anschließend werden die Mäuse betäubt und Blutproben für die metabolomische Analyse entnommen (Abbildung 1A). Für die...

In diesem Protokoll werden Methoden beschrieben, die für die BAT-optimierte arteriovenöse Metabolomik mittels GC-MS in einem Mausmodell relevant sind. Diese Methoden ermöglichen es, wertvolle Einblicke in den BAT-vermittelten Metabolitenaustausch auf organismischer Ebene zu gewinnen.

Arteriovenöse Metabolomik zur Messung des In-vivo-Metabolitenaustauschs in braunem Fettgewebe

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

Unser Labor ist daran interessiert, Mechanismen zu identifizieren, durch die Signalwege und Stoffwechselwege zusammenarbeiten, um den Stoffwechsel und die Physiologie des Fettgewebes zu regulieren. Und mit diesem Ansatz wollen wir einen Weg finden, Stoffwechselkrankheiten, die durch Energieungleichgewichte verursacht werden, wie Fettleibigkeit und Diabetes, zu verhindern oder zu bekämpfen. Der Hauptvorteil unseres Protokolls besteht darin, dass wir vom konventionellen Rattenmodell auf ein Mausmodell für die arteriell-venöse Blutentnahme und Metabolomanalyse umgestiegen sind.Wir glauben, dass dieser Übergang es uns ermöglichen wird, unsere Ergebnisse mit den Goldstandard-Genmodellen für die Forschung zu braunem Fett schneller zu validieren.

arteriovenous-metabolomics-to-measure-vivo-metabolite-exchange-brown

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Das hier vorgestellte Verfahren verwendet 18 F-Fluorodeoxyglucose (18 F-FDG), Positronenemissionstomographie / Computertomographie (PET-CT) und Fett-Wasser getrennt, Magnetresonanztomographie (MRI), die jeweils folgende 2 h Einwirkung thermo (24 ° C gescannt ) und kalten Bedingungen (17 ° C), um braune Fettgewebe (BAT) bei erwachsenen menschlichen Patienten abzubilden.

Menschen braunes Fettgewebe Depots automatisch durch Positronenemissionstomographie / Computertomographie Segmentierte und Registrierte Magnetic Resonance Images

Mit kostenlose, Open-Source-Software, entwickelten wir einen analytischen Ansatz zur Quantifizierung der Gesamt- und regionalen braunen Fettgewebe (BAT) Volumen und Stoffwechselaktivität der Fledermaus mit 18F-FDG-PET/CT.

Ganzen Körper und regionale Quantifizierung der aktiven Menschen braune Fettgewebe mit 18F-FDG PET/CT

Dieses Verfahren beschreibt Echtzeit Aufnahme von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise in explantierten Maus retinalen Gewebe mit einer extrazellulären Flux-Analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

Funktionelle Bildgebung und Quantifizierung von thermogenen Fettdepots in Mäusen mit einem mikro-PET/MR-bildgebenden Ansatz.

Visualisierung und Quantifizierung von braunem und beigem Fettgewebe in Mäusen mittels [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Messung des Grundumsatzes und der oxidativen Kapazität von thermogenen Adipozyten bei übergewichtigen Mäusen.

Bestimmung des basalen Energieverbrauchs und der Fähigkeit thermogener Adipozyten, Energie bei übergewichtigen Mäusen zu verbrauchen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um die physiologische Bedeutung des Einflusses der Aktivität des braunen Fettgewebes (BAT) auf den menschlichen Stoffwechsel zu quantifizieren. Dies wird durch die Kombination von Kohlenhydratbeladung und indirekter Kalorimetrie mit Messungen supraklavikulärer Temperaturänderungen erreicht. Dieser neuartige Ansatz kann dazu beitragen, ein pharmakologisches Ziel für die BAT-Thermogenese beim Menschen zu entwickeln.

Verwendung einer Kombination aus indirekter Kalorimetrie, Infrarot-Thermografie und Blutzuckerspiegeln zur Messung der Thermogenese von braunem Fettgewebe beim Menschen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung, Kultivierung und Phänotypisierung von mikrovaskulären Endothelzellen aus humanem subkutanem Fettgewebe (hSATMVECs). Zusätzlich beschreiben wir ein experimentelles Modell des hSATMVEC-Adipozyten-Cross-Talks.

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe

Dieses Manuskript beschreibt , wie für thermostabilisierende Mutationen zu screenen, die menschliche Serotonintransporter reinigen, Antikörper mit hoher Affinität zu erzeugen, und der Serotonin - Transporter-Antikörper - Komplex mit dem Antidepressivum S -Citalopram gebunden kristallisieren. Dieses Protokoll kann auf die Untersuchung von anderen schwierigen Membrantransportern, Rezeptoren und Kanälen angepasst werden.

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Das Ziel des Protokolls ist Keratin Hydrolysat aus Hühnerfedern durch alkalische enzymatische Hydrolyse vorzubereiten und zu testen, ob hinzufügen von Keratin-Hydrolysat in einem Kosmetik Salbe Basis verbessert die Barrierefunktion der Haut (Steigerung der Flüssigkeitszufuhr und abnehmenden transepidermalen Wasserverlust). Tests werden durchgeführt auf Männer und Frauen freiwillige.

Vorbereitung der Keratin-Hydrolysat aus Hühnerfedern und ihre Anwendung in der Kosmetik

Erfahren Sie die arteriovenöse Metabolomik zur Messung des In-vivo-Metabolitenaustauschs in braunem Fettgewebe mittels GC-MS im Mausmodell. Diese Methode ermöglicht schnellere Validierung genetischer Modelle und liefert Einblicke in den Energiehaushalt.

Arteriovenöse Metabolomik zur Messung des In-vivo-Metabolitenaustauschs in braunem Fettgewebe

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