Name: Immunmagnetische Isolierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen aus Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Erfahren Sie die immunmagnetische Isolierung von CD34+ Gefäßwand-Stammzellen aus Mäusen mittels magnetischer Sortierung und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Charakterisierung für kardiovaskuläre Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82070502, 31972909, 32171099) und des Sichuan Science and Technology Program der Provinz Sichuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607) finanziert. Die Autoren danken Qingbo Xu von der Zhejiang University für die Hilfe bei der Zellkultur, und die Autoren danken der Durchflusszytometrie-Plattform an der Southwest Medical University für die wissenschaftliche und technische Unterstützung.

Diese Studie wurde genehmigt und die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für das Management und die Verwendung von Labortieren in China behandelt. Die Forschung hielt sich strikt an die ethischen Anforderungen von Tierversuchen, mit Genehmigung der Tierethikkommission (Zulassungsnummer: SWMU2020664). Für die vorliegende Studie wurden acht Wochen alte gesunde C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts mit einem Gewicht zwischen 18 und 20 g verwendet. Die Tiere wurden im Laboratory Animal Center der Southwest Medical University (SWMU) untergebracht.
1. Gewebeblockkultur von Adventitia aus Aorta und Mesenterialarterien
<ol><li>Isolation der Residenten CD34+ VW-SCs<ol><li>Anästhesieren Sie zwei Mäuse mit 3% Isofluran-Inhalation (nach institutionell anerkannten Protokollen). Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie durch Zehenkneifen. Positionieren Sie die Maus in Rückenlage mit medizinischem Klebeband und sprühen Sie 70%iges Ethanol-Desinfektionsmittel, um das Fell der Maus zu desinfizieren. Öffnen Sie die Brust- und Bauchhöhle mit einer sterilen Augenschere und -zange, um Herz und Darm freizulegen. Nach dem Präparieren der isolierten Aorta und der Mesenterialarterien werden die Aorta und das Mesenterialbett in eine Petrischale gesteckt, die Silikonelastomer enthält und mit einer physiologischen Salzlösung gefüllt ist. Mit einer weiteren sterilisierten Schere und Pinzette sezieren Sie schnell das Fett um die Aorta und die Mesenterialarterien.</li>
		<li>Übertragen Sie das präparierte Gewebe in eine 6 cm große Petrischale, die 1 % Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-Lösung enthält (siehe Materialtabelle). Nach zweimaligem Spülen die Arterien in eine Gewebekulturhaube unter einem Stereomikroskop überführen.</li>
		<li>Schneiden Sie die Arterien in Längsrichtung auf und ziehen Sie mit einer feinen Pinzette die äußere Schicht der Aorta und den ersten Ast der Mesenterialarterien ab. Übertragen Sie die äußeren Schichten in eine 3,5 cm große Petrischale, die 0,1-0,2 mL Kulturmedium enthält (siehe Materialtabelle). Schneiden Sie die äußeren Schichten in winzige Stücke (ca. 1 mm3).</li>
		<li>Übertragen Sie die Gewebestücke in einen mit Gelatine beschichteten T25-Kolben, um eine gleichmäßige Verteilung auf dem Boden des Kolbens zu gewährleisten. Halten Sie einen moderaten Abstand zwischen den Gewebestücken ein, um das Kriechen und Wachstum der Zellen zu erleichtern. Der Kolben wird 3 Stunden lang senkrecht in einen Inkubator (37 °C, 5 % CO2) gestellt, damit die Gewebeblöcke am Boden des Kolbens haften können.</li>
		<li>Fügen Sie nach 3 Stunden 5 ml DMEM-Wachstumsmedium mit hohem Glukosegehalt hinzu, um die Gewebeblöcke einzutauchen. Richten Sie den T25-Kolben horizontal aus. Überwachen Sie die Zellmigration um Gewebeblöcke herum durch ein Mikroskop in Abständen von 3 Tagen. HINWEIS: Das Medium sollte 20 % fötales Rinderserum, 0,2 % Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 0,2 mM β-Mercaptoethanol und 1 % Penicillin/Streptomycin enthalten (siehe Materialtabelle). Fötales Rinderserum unterstützt die Zellproliferation, während LIF und β-Mercaptoethanol die Zelldifferenzierung behindern 7,8.</li>
		<li>Wenn die Zellen im T25-Kolben eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen, werden sie in einen oder zwei T75-Kolben geleitet und kultiviert. Subkulturieren Sie die Zellen über fünf Passagen, um ein angemessenes Wachstum und Gesundheit zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
	<li>Magnetische Trennung von residenten CD34+ Stammzellen<ol><li>Wenn die Zellen in einem oder zwei T75-Kolben eine Konfluenz von 80 % erreichen, dissoziieren Sie die Zellen mit Trypsin und resuspendieren sie in 1 ml Sortierpuffer (2 mM EDTA und 0,5 % FBS). Die Zellzahl (107/T75 Kolben) bestimmen und die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min (bei Raumtemperatur) zentrifugieren.</li>
		<li>Der Überstand wird vollständig verworfen und das Zellpellet in 98 μl Sortierpuffer pro insgesamt 107 Zellen resuspendiert. Fügen Sie 2 μl CD34-Antikörper hinzu (siehe Materialtabelle). Gut mischen und 30 min bei 4°C im Dunkeln unter gelegentlichem Schütteln inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 2 mL Sortierpuffer und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und vollständig und resuspendieren Sie die Zellen in 80 μl Sortierpuffer.</li>
		<li>20 μl Anti-FITC-Mikrokügelchen (pro insgesamt 107 Zellen, siehe Materialtabelle) in den Puffer geben. Durch wiederholtes Pipettieren gut mischen und 15 Minuten bei 4 °C im Dunkeln unter intermittierendem Schütteln inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie 2 mL Puffer hinzufügen und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren, um die Zellen zu repelletieren. Den Überstand vollständig verwerfen und die Zellen in 1 ml Puffer resuspendieren.</li>
		<li>Positionieren Sie eine MS-Säule innerhalb des Magnetfelds eines geeigneten Separators und stellen Sie sicher, dass ein Sammelröhrchen (z. B. ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen) unter der MS-Säule platziert wird, um die getrennten Komponenten zu sammeln. (siehe Materialtabelle). Spülen Sie die Säule mit 500 μL Puffer und warten Sie, bis sie vollständig durchlaufen ist.</li>
		<li>Laden Sie die Zellsuspension in die Säule und sammeln Sie den Durchfluss mit unmarkierten Zellen in das 15-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Nehmen Sie die Säule aus dem Separator und setzen Sie sie auf ein neues 15-mL-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 500 μl Puffer in die Säule und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben in die Säule drücken.</li>
		<li>Um die Reinheit von CD34+ -Zellen zu verbessern, kann die eluierte Fraktion mit einer zweiten MS-Säule angereichert werden. Wiederholen Sie den Trennvorgang wie oben beschrieben. Beurteilen Sie die Reinheit der sortierten Zellen mittels Durchflusszytometrie. HINWEIS: In der Regel werden 10%-20% CD34+ -Zellen erhalten, mit etwa 70%-80% negativen Zellen und einem Verlust von ca. 10% durch Färbe- und Zentrifugenverfahren.</li>
		<li>Um die Reinheit der CD34+ -Stammzellen der Gefäßwand weiter zu bestätigen, werden die sortierten Zellen durch Durchflusszytometrie identifiziert. Die vorliegende Studie zeigte eine Reinheit von mehr als 90%.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Zellidentifikation durch Immunfluoreszenz
<ol><li>Samenzellen auf Deckgläsern (Durchmesser 8 mm) mit 0,04 % Gelatine vorbeschichtet.</li>
	<li>Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 60 % bis 70 % erreichen, spülen Sie sie zweimal mit PBS und fixieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3 Minuten lang (3 Mal) mit PBS und permeabilisieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,2 % Triton X-100 (in PBS).</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3 min lang (3 mal) mit PBS und blockieren Sie die unspezifische Bindung der Antikörper mit 5% Eselsserum (in PBS) für 1 h.</li>
	<li>Entfernen Sie den Blockierungspuffer, indem Sie jedes Deckglas mit einer Pinzette an der Kante festhalten und auf ein Blatt fusselfreies Tuch abtropfen lassen.</li>
	<li>Die Zellen werden in 100-fach verdünnten Primärantikörpern (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, siehe Materialtabelle) in 1% BSA (in PBS) über Nacht bei 4 °C inkubiert.</li>
	<li>Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Zellen 3 Minuten lang (3 Mal) mit PBS. Inkubieren Sie die Zellen mit einem Alexa Fluor 488-markierten Sekundärantikörper (1:200 in 1% BSA) (siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Führen Sie eine DAPI-Gegenfärbung durch, indem Sie die DAPI-Stammlösung in PBS auf 0,5 μg/ml verdünnen und die Zellen 5 Minuten lang inkubieren.</li>
	<li>Mit PBS spülen und die Deckgläser mit Antifading-Reagenz versiegeln. Nehmen Sie Bilder unter dem konfokalen Laserscanning-Mikroskop auf.</li>
</ol>3. Induzierte Differenzierung und Charakterisierung von CD34+ VW-SCs
<ol><li>Züchten Sie CD34+ -Stammzellen mit einer angemessenen Dichte (40%-50% Konfluenz) auf Deckgläsern bzw. 6-Well-Platten.</li>
	<li>Induktion der Endothelzell-orientierten Differenzierung von CD34+ -Zellen durch Kultivierung von Zellen im Endothelzellkulturmedium EBM-2 (siehe Materialtabelle) für 1 Woche.</li>
	<li>Induktion der Fibroblastenzell-orientierten Differenzierung von CD34+ -Zellen durch Kultivierung von Zellen im Fibroblasten-Zellkulturmedium FM-2 (siehe Materialtabelle) für 3 Tage.</li>
	<li>Die undifferenzierten und differenzierten Zellen werden einer Immunfluoreszenzfärbung (wie in Schritt 2 erwähnt) bei einer Laseranregung von 488 nm und einem 40-fachen Objektiv unterzogen. Nachweis der Expression von Endothelzellmarkern (CD31, VWF) und Fibroblastenzellmarkern (PDGFRα, Vimentin) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Dissoziieren Sie die Zellen mit Trypsin und erhalten Sie das Zellpellet durch Zentrifugation (300 x g, 5 min, Raumtemperatur). Zellen mit 100 μl Sortierpuffer resuspendieren. Die Zellsuspension wird mit gereinigtem Anti-Maus-CD16/CD32 mAb (1 μg) (siehe Materialtabelle) bei 4 °C für 5 min vorinkubiert.</li>
	<li>Geben Sie 2 μl PE Ratte Anti-Maus CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoklonaler Antikörper APC (2 μL, 1:50) und CD140a (PDGFRa) Monoklonaler Antikörper FITC (2 μL, 1:50) direkt in vorinkubierte Zellen in Gegenwart von Maus Fc Block und inkubieren Sie diese 15 Minuten lang bei 4 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie 2 mL Puffer hinzufügen und 5 Minuten lang bei 300 x g (Raumtemperatur) zentrifugieren, um die Zellen wieder zu pelletieren. Der Überstand wird vollständig verworfen und die Zellen in 300 μl Puffer resuspendiert. Legen Sie die Durchflussröhrchen mit den gefärbten Zellen in eine Eisbox, die für die Durchflusszytometrie bereit ist.</li>
</ol>4. Nachweis des intrazellulären Ca2+ -Signalwegs in vaskulären CD34+ -Stammzellen
<ol><li>Keimzellen auf Deckgläsern 10 h vor Experimenten mit einer Dichte von bis zu 70% Konfluenz.</li>
	<li>Nehmen Sie die Deckgläser heraus und befestigen Sie sie mit Vaseline auf dem Boden einer speziellen Kammer.</li>
	<li>Waschen Sie die Deckgläser einmal mit PBS, ersetzen Sie sie durch Fura-2/AM (5 μM) in Tyrode-Lösung (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl2 1,2 mM, Glukose 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2,4 mM) (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang im Dunkeln.</li>
	<li>Entfernen Sie den Farbstoff, indem Sie 10 Minuten lang mit der Tyrode-Lösung behandeln, um eine Entesterung von Fura-2/AM zu ermöglichen.</li>
	<li>Montieren Sie die Kammer auf dem Tisch eines inversen Fluoreszenzmikroskops, das mit einem Weitfeld-Bildgebungssystem ausgestattet ist, das einen Monochromator und eine CCD-Kamera enthält (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Öffnen Sie das Hauptfenster, gehen Sie zum Dialogfeld "Grab-Einstellungen " und zur Kameraseite und drücken Sie die Live-Taste für die Live-Bildanzeige.</li>
	<li>Wählen Sie den Fluoreszenzbildtyp, stellen Sie die Wiederholungszeiten der Schleife von 340 nm/380 nm, die Bildgröße und die Kamerabelichtungszeit auf 380 nm und 340 nm ein, um eine optimale Bildhelligkeit zu erzielen.</li>
	<li>Machen Sie einzelne Schnappschüsse und zeichnen Sie mehrere Freihandlinien, um die Zellen mit unterschiedlichen Farben zu umkreisen und den Interessenbereich (ROIs) vorzudefinieren, wobei der Hintergrund als ROI 0 angezeigt wird.</li>
	<li>Bearbeiten Sie ein bereits eingebettetes Protokoll in der Arbeitsbereichsansicht erneut, und erstellen Sie einen neuen Arbeitsbereich.</li>
	<li>Führen Sie das Protokoll aus, und die Meldung "Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)" zeigt das kinetische Online-Diagramm an.</li>
	<li>In der numerischen Ansicht wird eine Tabelle angezeigt, in der Spalten mit Graustufenwerten und entsprechenden Zeitinformationen angezeigt werden. Exportieren Sie die Tabellenkalkulationsdaten mithilfe der Zwischenablage.</li>
	<li>Berechnen Sie F340 nm/F380 nm, was auf intrazelluläre Ca2+ -Veränderungen nach Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz hinweist (ROI 0).</li>
</ol>

Isolierung und magnetische Trennung von murinen CD34+ -Stammzellen aus der Gefäßwand

<ol><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+progenitor+cells+in+the+adventitia+contribute+to+atherosclerosis+of+vein+grafts+in+ApoE-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice.</a> J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Diese Studie bietet eine schnelle und bequeme Methode zur Gewinnung von funktionellen CD34+ VW-SCs aus der Aorta und den Mesenterialarterien von Mäusen. CD34+ VW-SCs, die mit dieser Methode erhalten werden, haben proliferative Aktivität und multidirektionale Differenzierungseigenschaften. Triphosphat-Inositol-1,4,5-Trisphosphat-Rezeptoren (IP3Rs), Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) und speicherbetriebene Calciumkanäle vermitteln die Freisetzung und den Eintritt von Ca2+ in CD34+</...

Die Gefäßwand spielt eine zentrale Rolle bei der Gefäßentwicklung, der homöostatischen Regulation und dem Fortschreiten von Gefäßerkrankungen. In den letzten Jahren haben zahlreiche Studien das Vorhandensein verschiedener Stammzelllinien in den Arterien aufgedeckt. Im Jahr 2004 berichtete die Gruppe von Professor Qingbo Xu erstmals über die Existenz von vaskulären Stamm-/Vorläuferzellen in der Peripherie der adulten Gefäßwand, die CD34, Sca-1, c-kit und Flk-11 exprimieren. Diese vaskulären Stammzellen weisen ein multidirektionales Differenzierungs- und Proliferationspotenzial auf. Unter normalen Bedingungen bleiben sie relativ ruhig; Wenn sie jedoch durch bestimmte Faktoren aktiviert werden, können sie sich in glatte Muskelzellen, Endothelzellen und Fibroblasten differenzieren. Alternativ können sie die perivaskuläre Matrix und die Bildung von Mikrogefäßen durch parakrine Effekte regulieren, um die Reparatur oder den Umbau verletzter Gefäße zu fördern 2,3,4,5,6. Kürzlich wurde festgestellt, dass residente CD34+-Stammzellen in der Gefäßwand eine Rolle bei der Regeneration von Endothelzellen nach einer Verletzung des Führungsdrahts der Oberschenkelarterie spielen2. Folglich sind die Isolierung und Quantifizierung von CD34+ VW-SCs und die Untersuchung der grundlegenden biologischen Eigenschaften von CD34+ Stammzellen von entscheidender Bedeutung für die weitere Untersuchung der Signalwege, die an der Regulation von CD34+ VW-SCs beteiligt sind.
Derzeit stehen verschiedene Methoden zur Zelltrennung zur Verfügung, darunter Techniken, die auf Zellkultureigenschaften oder physikalischen Eigenschaften von Zellen basieren, wie z. B. die Dichtegradientenzentrifugation, die zu sortierten Zellen führt, die viele Nichtzielzellen und eine relativ geringe Reinheit enthalten 7,8,9,10,11,12 . Eine weitere häufig verwendete Technik ist die Fluoreszenz-/magnetisch unterstützte Zellsortierung. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist ein komplexes System mit hohen technischen Anforderungen, das relativ teuer und zeitaufwändig ist und möglicherweise die Aktivität der sortierten Zellen beeinträchtigt13,14. Die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) ist jedoch effizienter und bequemer, mit einer hohen Rückgewinnungsrate und Zellaktivität und geringeren Auswirkungen auf nachgelagerte Anwendungen8. Daher haben wir in diesem Protokoll MACS zur Aufreinigung von CD34+ VW-SCs angewendet und die Zellen durch Durchflusszytometrie weiter identifiziert. Die Etablierung von MACS-basierten Isolationsmethoden zur Untersuchung von Gefäßwandstammzellen wäre von unschätzbarem Wert. Zum einen ermöglicht sie experimentelle genetische und zellbiologische Studien. Zweitens ermöglicht die effiziente Isolierung und Kultivierung von Stammzellen aus der Gefäßwand eine systematische Bewertung und ein Screening von Signalfaktoren, die die Stammzellfunktionen regulieren. Drittens stellt die Identifizierung kritischer Phänotypen in Stammzellen eine wichtige "Qualitätskontrolle" bei der Beurteilung des Zellstatus dar. Daher könnte die Identifizierung von Methoden zur Reinigung für ähnliche Anwendungen bei analogen Stammzellen, die aus Gefäßen gewonnen werden, nützlich sein.
Dieser Bericht bietet eine detaillierte Demonstration einer stabilen und zuverlässigen Methode für die Kultivierung von CD34+ VW-SCs, einschließlich Zellidentifizierung und funktioneller Bewertung, die durch Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und Ca2+ -Signalmessung durchgeführt wird. Diese Studie bildet die Grundlage für weitere vertiefte Forschungen zur Funktion von CD34+ VW-SCs und ihren Regulationsmechanismen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.

<table><tbody><tr><td>2%ige Gelatinelösung</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 Antikörper</td><td>R& D</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab81289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-C-Kit-Antikörper</td><td>CST</td><td>77522</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FITC-Mikrobeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FITC MicroBeads MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flk-1 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab24313</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki67 Antikörper</td><td>CST</td><td>34330</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDGFR&alpha; Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab131591</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca- 1 Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>710952</td><td></td></tr><tr><td>CD140a (PDGFRA) Monoklonal Antikörper (APA5), FITC</td><td>eBioscience &nbsp; Invitrogen</td><td>11-1401-82</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) Monoklonaler Antikörper (390), APC</td><td>eBioscience&nbsp; Invitrogen</td><td>17-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Antikörper, Anti-Maus, FITC, REAfinity Klon REA383</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-775</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturhaube</td><td>JIANGSU SUJING GROUP CO., LTD&nbsp;</td><td>SW-CJ-2FD</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>&nbsp; CENCE&nbsp; &nbsp;</td><td>L530</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp; Inkubatoren&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4111</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>ZEISS 980&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium mit hohem Glukosegehalt</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Kulturmedium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>FACSMelody&nbsp; &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSMelody&Handel; System</td><td>&nbsp; </td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Millipore</td><td>ES-009-C</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 Kulturmedium</td><td>ScienCell</td><td>2331</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>M1292</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen-IgG (H+L) hoch kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor Plus 488</td><td>&nbsp; Thermofisher Wissenschaftlich&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Leukämie-Hemmfaktor</td><td>Millipore</td><td>LIF2010</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS&nbsp; &nbsp; Startkit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-312</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-Lösung</td><td>Beyotime</td><td>C0224</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigte Ratte Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD fc Block)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZX10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TILLvisION 4.0 Programm&nbsp;</td><td>&nbsp; T.I.L.L.Photonics GmbH</td><td>polychrome V&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VWF Monoklonaler Antikörper (F8/86)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp; MA5-14029</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

immunmagnetische isolierung von in der gefäßwand ansässigen cd34+ -stammzellen aus mäusen

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Residente CD34+ -Stamm- und Vorläuferzellen (VW-SCs) werden zunehmend für ihre entscheidende Rolle bei der Regulierung von Gefäßverletzungen und -reparaturen anerkannt. Die Etablierung einer stabilen und effizienten Methode zur Kultivierung funktioneller muriner CD34+ VW-SCs ist unerlässlich, um die Mechanismen, die an der Proliferation, Migration und Differenzierung dieser Zellen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen beteiligt sind, weiter zu untersuchen. Das beschriebene Verfahren kombiniert magnetisches Bead-Screening und Durchflusszytometrie zur Aufreinigung von primär kultivierten residenten CD34+ VW-SCs. Die gereinigten Zellen werden dann durch Immunfluoreszenzfärbung und Ca2+ -Bildgebung funktionell identifiziert. Kurz gesagt, werden Gefäßzellen aus der Adventitia der murinen Aorta und der Mesenterialarterie durch Anheften von Gewebeblöcken gewonnen, gefolgt von einer Subkultivierung bis zum Erreichen einer Zellzahl von mindestens 1 × 107. Anschließend werden CD34+ VW-SCs mittels magnetischer Kügelchensortierung und Durchflusszytometrie aufgereinigt. Die Identifizierung von CD34+ VW-SCs beinhaltet die zelluläre Immunfluoreszenzfärbung, während die funktionelle Multipotenz bestimmt wird, indem die Zellen einem spezifischen Kulturmedium zur orientierten Differenzierung ausgesetzt werden. Darüber hinaus wird die funktionelle interne Ca2+ -Freisetzung und der externe Ca2+ -Eintrag mit einer kommerziell erhältlichen Bildgebungsworkstation in Fura-2/AM-geladenen Zellen bewertet, die ATP, Koffein oder Thapsigargin (TG) ausgesetzt sind. Diese Methode bietet eine stabile und effiziente Technik zur Isolierung, Kultivierung und Identifizierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen und bietet die Möglichkeit für In-vitro-Studien zu den Regulationsmechanismen von VW-SCs und das Screening von zielgerichteten Medikamenten.

Isolierung und Reinigung von CD34+ VW-SCs Die hohe Reinheit von CD34+ VW-SCs wird aus der Adventitia der Aorta und der Mesenterialarterie der Maus durch Gewebeattachment und magnetische Mikrokügelchensortierung gewonnen. Der Anteil der CD34+ -Zellen in der Gefäßwand liegt im Allgemeinen bei 10%-30%. Die Durchflusszytometrie bestätigt, dass die Reinheit von CD34+ -Zellen, die durch magnetische Bead-Sortierung erhalten werden, mehr als 90 % beträgt (<strong cl...

Diese Studie hat eine stabile und effiziente Methode zur Isolierung, Kultivierung und funktionellen Bestimmung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen (CD34+ VW-SCs) etabliert. Diese leicht verständliche und zeitsparende Isolationsmethode kann von anderen Forschern genutzt werden, um die möglichen Mechanismen zu untersuchen, die an Herz-Kreislauf-Erkrankungen beteiligt sind.

Immunmagnetische Isolierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen aus Mäusen

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...

Residente CD34+-Stammzellen aus der Gefäßwand werden zunehmend für ihre entscheidende Rolle bei der Regulierung des Gefäßumbaus nach einer Verletzung anerkannt. Die Etablierung einer stabilen und effizienten Methode zur Kultivierung funktioneller CD34+-Zellen ist unerlässlich, um die beteiligten Mechanismen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen weiter zu untersuchen. Diese Technik kombiniert magnetisches Bead-Screening und Durchflusszytometrie, um die primär kultivierten residenten CD34+-Stammzellen zu reinigen.Anschließend können die gereinigten Zellen durch Immunfluoreszenzfärbung und Kalziumbildgebung funktionell identifiziert werden. Aufgrund der phänotypischen und funktionellen Heterogenität von residenten CD34+-Stammzellen in der vaskulären Nervenwand wird es notwendig sein, den spezifischen subzellulären Typ der residenten vaskulären CD34+-Zellen zu identifizieren. Wir stellen eine verfeinerte Methodik für die Kultur, Identifizierung und funktionelle Bewertung von gefäßwandresidenten CD34+-Stammzellen vor.Dieser neuartige Ansatz umfasst magnetische Sortierung, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und Kalziumsignalmessung. Durch den Einsatz dieser Techniken schafft unsere Studie eine solide Grundlage für zukünftige umfassende Untersuchungen der Regulation von Empfänger-CD34+-Stammzellen sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen.

immunomagnetic-isolation-vascular-wall-resident-cd34-stem-cells-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Dieses Video zeigt eine Technik zur Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems (HIS). CD34+ hämatopoetische Stammzellen (HSCs) werden aus menschlichen Buffy-Coat-Zellen aus Nabelschnurblut mit Hilfe von Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen isoliert. Die CD34+ HSCs werden in einem mit Zytokinen angereicherten Wachstumsmedium expandiert und kryokonserviert. Schließlich werden die aufgetauten HSCs in ein immundefizientes Mausjunges injiziert, um das HIS-Mausmodell zu etablieren.

Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut zur Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das große Mengen an murinen Monozyten aus heterogenem Knochenmark für translationale Anwendungen erzeugt. Im Vergleich zu anderen trägt diese neue Methode dazu bei, die Anzahl der getöteten Tiere zu reduzieren und die Kosten zu senken, indem teure Methoden wie die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) vermieden werden.

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

Menschliche Herzgewebe birgt multi perivaskuläre Vorläuferzellpopulationen, die für myokardiale Regeneration geeignet sein können. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die gleichzeitige Isolierung und Reinigung von zwei multi stromalen Zellpopulationen , die mit nativem Blutgefäße, dh CD146 + CD34 - Perizyten und CD34 + CD146 - Adventitia - Zellen aus dem menschlichen Herzmuskel.

Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Dieses Protokoll zeigt ein sicheres und effizientes Verfahren zur CD133 ändern+ Hämatopoetischen Stammzellen. Der vorgestellte nicht-viralen, magnetische Polyplex basierenden Ansatz kann eine Grundlage für die Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung der verabreichten Zelle Produkt per Magnet-Resonanz-Tomographie bilden.

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

Wir haben ein Protokoll optimiert, um murine Herzpericyten für die Grundlagenforschung und die Erforschung ihres biologischen und therapeutischen Potenzials zu isolieren und zu reinigen.

Isolierung und Reinigung von murinen Herzperizyten

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung primärer Mikroglia in Tiermodellen demyelinisierender Krankheiten unter Verwendung der säulenförmigen magnetisch aktivierten Zellsortierung.

Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Mäusen mit menschlichem Immunsystem (KIS) für immunonkologische Studien. Anweisungen und Überlegungen zur Verwendung dieses Modells zum Testen von humanen Immuntherapeutika an menschlichen Tumoren, die in dieses Modell implantiert wurden, werden vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf der Charakterisierung der Reaktion des menschlichen Immunsystems auf den Tumor liegt.

Erprobung von Krebsimmuntherapeutika in einem humanisierten Mausmodell mit menschlichen Tumoren

Intrafemorale Injektionen ermöglichen die Transplantation einer kleinen Anzahl von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), indem die Zellen direkt in der Knochenmarkhöhle platziert werden. Hier beschreiben wir ein experimentelles Protokoll zur intrafemoralen Injektion von humanen HSPCs in immundefiziente Mäuse.

Intrafemorale Injektion von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse 

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von Mikrogliazellen aus dem Hypothalamus der Maus (oder gleichwertigen kleinen Gehirnstrukturen) mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) in relativ kurzer Zeit. Die MACS-sortierten hypothalamischen Mikroglia können für die ex vivo-Analyse verwendet werden und können für die Durchführung von In-vitro-Assays plattiert werden.

Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundiertem adulten Mausgehirn durch magnetisch aktivierte Zellsortierung  

Erfahren Sie die immunmagnetische Isolierung von CD34+ Gefäßwand-Stammzellen aus Mäusen mittels magnetischer Sortierung und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Charakterisierung für kardiovaskuläre Forschung.

Immunmagnetische Isolierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34⁺ -Stammzellen aus Mäusen

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