Name: Chirurgische Perfusion und Isolierung der Bauchspeicheldrüse des Schweins zur Inselisolierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Lernen Sie die chirurgische Perfusion und Isolierung der Schweinebauchspeicheldrüse zur Inselisolierung. Diese Methode maximiert Ausbeute und Reinheit für Xenotransplantationsforschung.

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<meta charset="utf8"></head><body>Reinigung von Schweineinseln durch chirurgische Perfusion der Bauchspeicheldrüse des Schweins

<ol><li>Gillespie, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+pathogenesis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22CMAJ%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention.</a> CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).</li>
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<li>Pratschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+death+and+its+influence+on+donor+organ+quality+and+outcome+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Brain death and its influence on donor organ quality and outcome after transplantation.</a> Transplantation. 67 (3), 343-348 (1999).</li>
<li>vander Windt, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+islet+damage+after+direct+exposure+of+pig+islets+to+blood%3A+has+humoral+immunity+been+underestimated%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated.</a> Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).</li>
<li>Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+blood+content+on+porcine+pancreatic+dissociation+and+islet+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield.</a> Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+porcine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult porcine islets of Langerhans.</a> Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M NaOH, 100 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS, 500 mL (15 bis 30 &de; C)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1x D-PBS, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 1 L</td><td>Thermo Fisher</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Konische Röhrchen</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430236-6EA</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B [50 mg]</td><td>Millipore Sigma</td><td>PHR1662</td><td></td></tr><tr><td>Antiseptikum Povidon Jod 10%</td><td>Millipore Sigma</td><td>25655-41-8</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Gradient Former</td><td>BioRad</td><td>395</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Thermo Fisher</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>COBE Zellprozessor</td><td>Ebay</td><td>317690&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Behälter für Aufschlusskreislauf, Gibco-Flasche, 1 l</td><td>Thermo Fisher</td><td>10341001</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Thermo Fisher</td><td>60-10-6</td><td></td></tr><tr><td>Gradientenformer Anschlusskit</td><td>BioRad</td><td>1652008</td><td></td></tr><tr><td>Heparin [1000 U/ml]</td><td>Notfallmedizinische Produkte</td><td>0409-2720-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Puffer (1 m), 100 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Humanserumalbumin 25%, 100 mL</td><td>Celprogen</td><td>HSA2001-25-1</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Covetrus</td><td>Artikel#:11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Patterson</td><td>Artikel #:07-894-8462</td><td></td></tr><tr><td>Liberase (100 mg)</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>LEBEND/TOT Viabilitäts-/Zytotoxizitäts-Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyt 1.1 Medium 500 mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5020</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex LS 16 Schlauch</td><td>Masterfle</td><td>96419-16</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Schlauchpumpe</td><td>Masterflex</td><td>07522-30</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (2 mg/ml)</td><td>Celprogen</td><td>PS-30-002</td><td></td></tr><tr><td>Pulmozym (1 mg/ml, 2,5 ml/Fläschchen))</td><td>Dornase Alfa</td><td>8931278</td><td></td></tr><tr><td>Rückgewinnungsmedium, PIM(R)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td><td>PIM-R001GMP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Millipore Sigma</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Nährmedium, PIM(S)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td><td>PIM-S001GMP</td><td></td></tr><tr><td>Tzed&trade; (Tiletamin und Zolazepam) Injektion C</td><td>Patterson</td><td>Artikel #:07-894-6240</td><td></td></tr><tr><td>University of Wisconsin (UW) Lösung, 3 L</td><td>Global Transplant Solutions</td><td>1000-0046-06</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Sigma Alderich</td><td>CLS6783-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Patterson</td><td>Artikel #:07-891-6165</td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgische perfusion und isolierung der bauchspeicheldrüse des schweins zur inselisolierung

Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation

Der operative Aufbau und die Mittellinien-Laparotomie sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Laparotomieschnitt sollte gekrümmt sein, um die urogenitale Öffnung zu vermeiden (Abbildung 1B). Befestigen Sie beim Aufstellen des Retraktors den Pfosten für den Omni- oder Bookwalter-Retraktor an der linken, unteren Ecke des Tisches. Die ideale Retraktion umfasst zwei Retraktorklingen für die rechte Bauchdecke, zwei für die linke Bauchdecke und 1-2 für den rechten Dickdarm und den Dünndarm, die in ein steriles Handtuch gewickelt sind (Abbildung 1C). Es können Karosseriewand-, Splanchnik- oder Temperaufrollklingen verwendet werden, je nach Verfügbarkeit eines Assistenten und den Vorlieben des Bedieners. Wenn kein Omni- oder Bookwalter-Retraktor verfügbar ist, können 1-2 selbsthaltende Balfour-Retraktoren verwendet werden, um die Bauchdecke auf beiden Seiten zurückzuziehen. Ein Assistent kann dann die Retraktion auf den rechten Dickdarm und den Dünndarm anwenden, der in ein steriles Handtuch gewickelt ist.
Die in Abbildung 2 durchgeführte retroperitoneale Dissektion kann mit einer Mischung aus stumpfer und scharfer Dissektion durchgeführt werden. Obwohl es wichtig ist, eine umlaufende Kontrolle der infrarenalen IVC und der Aorta zu erhalten, muss diese Dissektion nicht bis zur Bifurkation fortgesetzt werden. Der intrathorakale Teil des Eingriffs stellt die technisch anspruchsvollste Herausforderung dar (Abbildung 3), da eine Verletzung der intrathorakalen oder retrohepatischen IVC erhebliche Blutungen verursachen und das Operationsfeld verdunkeln kann. Wenn Sie die absteigende thorakale Aorta identifizieren, trennen Sie die Aorta mit Daumen und Zeigefinger unverblümt von der Speiseröhre. Um den Ausriss kleiner Interkostalarterien und nachfolgende Blutungen zu vermeiden, ist eine umlaufende Kontrolle nicht erforderlich, solange die absteigende thorakale Aorta mit einem klar definierten Raum zur Aufnahme einer Aortenklemme zugänglich ist.
Die Kanülierung der infrarenalen Aorta erfolgt nach der Seldinger-Technik (Abbildung 4). Dies kann mit proximal und distal geklemmter infrarenaler Aorta (Abbildung 4A) oder direkt ohne Klemmung erfolgen. Achten Sie darauf, die Nadel nicht durch die Rückwand der Aorta zu stechen. Eine größere Hülle kann auch verwendet werden, wenn die Aorta ausreichend groß ist. Es ist wichtig, den Infusionsverlängerungsschlauch mit Luft zu befreien und den Infusionsschlauch aus der UW-Lösung steril mit der 10Fr-Schleuse zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass der Infusionskanal offen ist, obwohl der Fluss erst beginnt, wenn die Aorta festgeklemmt ist (Abbildung 4B). Bei der Venotomie in der infrarenalen IVC ist es wichtig, dass der Primärchirurg die IVC mit einer DeBakey-Pinzette sicher hält, um die Stelle der Venotomie nicht zu verlieren und ein großes Blutvolumen in das Operationsfeld fließen zu lassen. Eine Venotomie weg von der Bauchspeicheldrüse mit der prompten Platzierung einer Poolabsaugung erhält ein unblutiges Operationsfeld mit klaren Gewebeebenen für die Pankreeatomie (Abbildung 4C). Die anfängliche Drainage erfolgt über dunkles venöses Blut, das jedoch aufhellt, wenn das Schwein ausgeblutet wird und die UW-Lösung durch die Eingeweide perfundiert wird. Achten Sie darauf, für diesen Teil des Eingriffs einen großen Saugkanister zu verwenden.
Die Eingeweide und insbesondere die Bauchspeicheldrüse werden mit zunehmender Perfusion der UW-Lösung immer blasser (Abbildung 5A). Der Pankreasgang kann identifiziert werden, indem man dem Verlauf des Zwölffingerdarmlappens in den Zwölffingerdarm folgt. Der Kanal sollte auf zwei Seidenbinder aufgeteilt werden, um eine Kontamination mit magensaftresistentem Inhalt zu vermeiden (Abbildung 5B). Während das Pankreasparenchym blass und blutleer erscheinen sollte, sollte das verbleibende Bindegewebe, das die Bauchspeicheldrüse umgibt, vor der Isolierung der Insel gereinigt werden (Abbildung 5C).
Die entnommene Bauchspeicheldrüse kann dann einem mehrstufigen Inselisolations- und Reinigungsprozess unterzogen werden (Abbildung 6). Abbildung 7A zeigt die repräsentative Größenverteilung der Inselzellen nach dem Isolierungs- und Reinigungsprozess der Insel. Abbildung 7B zeigt gereinigte Inselzellen mittels Hellfeldmikroskopie und nach der Lebend-/Totfärbung, wobei die grüne und die rote Färbung lebensfähige bzw. nicht lebensfähige Inselzellen darstellen. Die Ausbeute und Reinheit der Inselzellen kann mit einem Inselzellzähler bewertet werden. Repräsentative Ausbeuten ergeben sich aus drei unabhängigen Pankreasisolierungen von Schweinen, die in Abbildung 7C zusammengefasst sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig01.jpg"> Abbildung 1: Operativer Aufbau. (A) Schwein in Rückenlage mit steril vorbereitetem Abdomen; (B) Mittellinien-Laparotomie vom Xiphoid bis zum Schambein; (C) Retroperitoneum freigelegt mit eingesetztem Omni-Retraktor. Maßstabsbalken = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig02.jpg"> Abbildung 2: Retroperitoneale Dissektion. (A) Retroperitoneumdissektion mit umlaufender Kontrolle der infrarenalen IVC und der Nierenvenen. Das gelbe Rechteck ist in Abbildung 2B vergrößert. (B) Vergrößertes Bild der infrarenalen IVC und der Nierenvenen; (C) Abgebundene Nierenvenen. Maßstabsleisten = 2 cm. Abkürzung: IVC = Vena cava inferior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig03.jpg"> Abbildung 3: Erlangung der suprazöliakie-Kontrolle. (A) Rechtes Hemidiaphragma eingeschnitten. Das gelbe Quadrat ist in Abbildung 3B vergrößert. (B) Verlängerung des Schnitts des rechten Hemidiaphragmas, um die intrathorakale IVC und die absteigende thorakale Aorta freizulegen; (C) Circumferentielle Kontrolle der intrathorakalen IVC erhalten. Maßstabsleisten = 2 cm. Abkürzung: IVC = Vena cava inferior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig04.jpg"> Abbildung 4: Kanülierung der infrarenalen Aorta, viszerale Isolierung und Perfusion. (A) Proximale und distale Kontrolle der infrarenalen Aorta; (B) 10Fr-Schleuse, die nach der Seldinger-Technik in die infrarenale Aorta eingesetzt wird; (C) Viszerale Perfusion über die infrarenale Aortenscheide und Drainage über Venotomie und Poolsauger bei infrarenalen IVC. Maßstabsleisten = 2 cm. Abkürzung: IVC = Vena cava inferior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig05.jpg"> Abbildung 5: Totale Pankreatektomie. (A) Eingeweide, die während der Perfusion blasser werden; (B) Pankreasgang isoliert; (C) Explantierte Bauchspeicheldrüse des Schweins. Maßstabsbalken = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig06.jpg"> Abbildung 6: Isolierung und Reinigung von Inselzellen. Schematische Darstellung der Infusion der Enzymlösung, der Verdauung der Bauchspeicheldrüse des Schweins, der Gewebeentnahme, der Zellwäsche mit dem Zellprozessor sowie der Zellkultur und -analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig07.jpg"> Abbildung 7: Repräsentative Lebensfähigkeit und Ausbeute der Inselzellen nach der Reinigung. (A) Schweineinseln nach vergrößerter Hellfeld-Bildgebung und Lebend-/Totfärbung. Grün zeigt lebende Zellen; Rot zeigt tote Zellen an. Maßstabsbalken = 100 μm (B) Histogrammverteilung der Größe der Schweineinsel nach der Reinigung. (C) Tabelle mit Angabe der Reinheit der Inselzellen und der Ausbeute aus drei Isolierungen von Pankreasinseln des Schweins. Abkürzung: IEQ = Inseläquivalent, die Standardeinheit für die Quantifizierung von Inseln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Chirurgische Perfusion und Isolierung der Bauchspeicheldrüse des Schweins zur Inselisolierung

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe) mit einem modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Die Versorgung von Typ-2-Diabetes Inseln für die Forschung ist nicht ausreichend. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus Patienten partielle Pankreatektomie. Dieser Ansatz stellt einen einzigartigen Ort für den Erhalt von kleinen Inseln von Typ 2 Diabetes und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten in ausreichender Zahl für die Grundlagenforschung und klinische Studien.

Isolierung humaner Inselzellen aus teilweise Pankreatektomierten

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Gewebe-Engineering der gesamten Bauchspeicheldrüse ist eine Herausforderung, weil die exokrinen und endokrine Funktionen. Wir zeigen eine Methode für die Zerlegung einer intakten Schweinen der Bauchspeicheldrüse und der Prozess der erfolgreichen Decellularization von Perfusion von Waschmitteln Triton x-100, Natrium Deoxycholate und Deoxyribonuclease.

Isolation und Decellularization eine ganze Schweine Pankreas

Der Videoartikel fasst die Technik der Pankreatektomie und Pankreas-Allotransplantation in einem 3-Tage-Überlebensmodell am Schwein zusammen, mit einer Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Methode und Schwerpunkt auf den chirurgischen Tipps und Tricks zum Umgang mit der prekären und empfindlichen viszeralen Anatomie des Schweins.

Chirurgische Tipps und Tricks für die Durchführung einer Schweinepankreastransplantation

Hier geben wir Details zur Durchführung der glukosestimulierten Insulinsekretion (GSIS) durch Perfusion durch das Gefäßsystem von Mäusen mit intakter Bauchspeicheldrüse als zusätzliche Technik zur Beurteilung der endokrinen Pankreasfunktion mit Reduktion möglicher Störfaktoren.

Glukosestimulierte Insulinsekretion über Perfusion durch das Gefäßsystem der Maus mit intakter Bauchspeicheldrüse

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Lernen Sie die chirurgische Perfusion und Isolierung der Schweinebauchspeicheldrüse zur Inselisolierung. Diese Methode maximiert Ausbeute und Reinheit für Xenotransplantationsforschung.

Chirurgische Perfusion und Isolierung der Bauchspeicheldrüse des Schweins zur Inselisolierung

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