Name: Hochdurchsatz-Bioprinting-Verfahren zur Modellierung der Gefäßpermeabilität in Standard-Sechs-Well-Platten mit Größen- und Musterflexibilität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Lernen Sie ein Hochdurchsatz-Bioprinting-Verfahren zur Modellierung der Gefäßpermeabilität in Standard-Sechs-Well-Platten. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare in-vitro-Blutgefäßmodelle für die pharmakologische Testung.

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1. Generierung des G-Codes für den Bioprinter
<ol><li>Um den Druckpfad zu generieren und zu visualisieren, besuchen Sie ein Online-G-Code-Simulationstool (z. B. NCviewer).</li>
	<li>Klicken Sie auf das Symbol Neue Datei auf der Benutzeroberfläche, um eine neue G-Code-Datei zu erstellen.</li>
	<li>Generieren Sie einen Druckpfad, indem Sie die G-Code-Befehle für den Opferkanal und die Siliziumkammer manuell schreiben. Verwenden Sie die Abmessungen einer Standardplatte mit sechs Vertiefungen als Referenz für die Erstellung der Geometrie. HINWEIS: Der hier verwendete G-Code basiert auf dem CNC-Code (Computer Numerical Control). Die Funktionen der einzelnen Befehle sind in der ergänzenden Tabelle S1 aufgeführt. Das Sechs-Well-Plattenformat wurde aufgrund seiner Kompatibilität mit kommerziellen Mikroplatten-Readern und Mikroskopie-Setups und seiner Fähigkeit, ausreichende Medienvolumina zur Unterstützung der Endothelreifung aufzunehmen, wodurch der Bedarf an häufigen Medienwechseln minimiert wird. Dieses Herstellungsprotokoll kann auch für die Verwendung mit anderen Standard-Well-Platten angepasst werden.</li>
	<li>Sobald der G-Code abgeschlossen ist, klicken Sie auf der Benutzeroberfläche auf das Symbol Datei speichern , um die Datei mit der Erweiterung .nc herunterzuladen. HINWEIS: Jeder andere verfügbare G-Code-Generierungsalgorithmus kann verwendet werden, um die Druckpfade zu generieren. Die Geometrie des Gefäßkanals kann in diesem G-Code manipuliert werden.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Opfer- und Silikonkammertinten
HINWEIS: Die Quellen für alle Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
<ol><li>Kombinieren Sie zwei Arten von Silikonpolymeren, SE1700 und Polydimethylsiloxan (PDMS), in einem Verhältnis von 10:2. Fügen Sie das Härtungsmittel jedes Polymers in einem Verhältnis von 10:1 hinzu, Polymer zu Härter.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Planetenmischer, um das Polymergemisch bei 2.000 U/min gründlich zu mischen und zu entgasen.</li>
	<li>Übertragen Sie das gemischte Silikonpolymer mit einem Spatel in eine 10-ml-Einwegspritze. Zentrifugieren Sie die geladene Spritze bei 400 × g für 3 min bei 5 °C, um eine gleichmäßige Konsistenz zu gewährleisten und Blasenbildung während des Drucks zu vermeiden. HINWEIS: Die Kammertinte sollte innerhalb von 2 Stunden nach der Zugabe der Härter verwendet werden, um eine optimale Druckqualität zu gewährleisten. Lagern Sie die Spritze bei 5 °C, während Sie den Druck vorbereiten. Dieser Prozess trägt dazu bei, die Aushärtung der Tinte zu verlangsamen, wodurch sich sonst die Druckparameter verändern können.</li>
	<li>Pluronic F-127 (PF127) wird gewogen, um eine 40%ige (w/v) Stammlösung von PF127 in destilliertem Wasser herzustellen.</li>
	<li>Mischen Sie die PF127-Lösung in einem Planetenmischer für 3 min bei 400 × g , um eine Homogenität zu erreichen. Die homogenisierte Mischung wird bei 4 °C gehalten, um PF127 vollständig aufzulösen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Thrombin-Stammlösung von 1.000 Einheiten/ml in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) vor. HINWEIS: Lagern Sie Thrombin-Stammlösung in 100 μl Aliquoten, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. Die Aliquote sollten nicht länger als 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie vor dem Drucken Opfertinte vor, indem Sie Thrombin in einer Verdünnung von 1:10 mit PF127 auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 36 % (w/v) für PF127 und 100 Einheiten/ml für Thrombin mischen. Zur Herstellung von 1 ml Opfertinte mischen Sie 100 μl Thrombin-Stammlösung mit 900 μl PF127-Stammlösung. HINWEIS: Bei der Vorbereitung der Opfertinte für den Druck einer einzelnen Platte ist ein Gesamtvolumen von 1 ml mehr als ausreichend.</li>
</ol>3. Herstellungsprozess
<ol><li>Bevor Sie mit dem Herstellungsprozess beginnen, behandeln Sie eine Sechs-Well-Platte 1 Minute lang mit Sauerstoffplasma (O2) mit einer Stärke von 100 Watt.</li>
	<li>Befolgen Sie das in Abschnitt 2 beschriebene Verfahren, um sowohl die Opfer- als auch die Silikontinte vorzubereiten, und stellen Sie sicher, dass die Tinten frei von Blasen und homogen gemischt sind, um einen konsistenten Druck zu gewährleisten. Legen Sie die Tinten vorsichtig in den Druckkopf des Biodruckers ein. Stellen Sie die Temperatur des Kopfes des Biodruckers auf 37 °C für die Opfertinte und 5 °C für die Silikontinte ein.</li>
	<li>Befestigen Sie eine konische Düse mit 22 G Doppelschraubgewinde an der Silikonspritze. Für die Opfertinte wählen Sie die Düsengröße entsprechend dem gewünschten Kanaldurchmesser. HINWEIS: Hier haben wir drei Düsengrößen demonstriert: 18 G, 20 G und 22 G. Optimale Druckparameter, einschließlich Druckdruck und Druckkopfgeschwindigkeit, sind in Tabelle 1 aufgeführt.</li>
	<li>Laden Sie den gewünschten G-Code und drücken Sie die Servo-Bereitschaftsfunktion auf der Softwareoberfläche des Biodruckers für 3 Sekunden. Positionieren Sie die Platte auf dem Tisch am Startpunkt des G-Codes und klicken Sie auf Start , um den Druckvorgang zu starten. HINWEIS: In der Regel dauert die Herstellung einer Platte mit sechs Kammern ca. 1 h und 10 min. Schritt 3.4, der das Laden und Ausführen des G-Codes umfasst, kann je nach verwendetem Bioprinter variieren. Stellen Sie sicher, dass während der Verwendung des Biodruckers sterile Bedingungen eingehalten werden, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Setzen Sie einen Deckel über die Platte und stellen Sie die Platte für 72 Stunden in einen befeuchteten CO2 -Inkubator bei 37 °C um, um die Silikonkammern auszuhärten. HINWEIS: Obwohl die Aushärtung des Silikons im Inkubator langsamer erfolgen kann, darf die Platte nicht in einen trockenen Ofen gestellt werden.</li>
</ol>4. Hydrogel-Vorbereitung und Kanaleinbettung
<ol><li>Bereiten Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 20 ml 1x PBS vor. 0,01 g Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) werden in das konische Röhrchen gegeben, um eine 0,05%ige (w/v) LAP-Lösung herzustellen. Strudeln Sie es, bis sich das Pulver vollständig aufgelöst hat. HINWEIS: Wickeln Sie das konische Rohr in Folie ein, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Die LAP-Stammlösung bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Fügen Sie 3 g Gelatinemethacrylat (GelMA) und 0,2 g Fibrinogen zu 20 ml LAP-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 15 % GelMA und 1 % Fibrinogen (als GelFib bezeichnet) zu erreichen. Geben Sie die Mischung in ein 37 °C heißes Wasserbad und mischen Sie sie regelmäßig, bis sich die Lösung vollständig aufgelöst hat.</li>
	<li>Nach der Herstellung, wie in Abschnitt 3 beschrieben, fügen Sie 300 μl vorgewärmtes GelFib in jede Hydrogelkammer hinzu, um das Opfermuster einzubetten. Vernetzen Sie das GelMA schnell mit ultraviolettem (UV) Licht bei einer Wellenlänge von 405 nm und einer Intensität von 85 mW/cm2 für 120 s. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle anderen Vertiefungen. HINWEIS: Fibrinogen vernetzt sich schnell bei Kontakt mit dem Thrombin enthaltenden Opfermuster. Wir empfehlen, Hydrogel hinzuzufügen und die UV-Vernetzung einzeln für jede Vertiefung durchzuführen, um eine unerwünschte Gelierung von GelMA bei Raumtemperatur zu vermeiden. Darüber hinaus sollten sterile Bedingungen eingehalten werden, um eine Kontamination während des UV-Härtungsprozesses zu vermeiden.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml DPBS auf jede Seite des Gefäßkanals in jeder Vertiefung und halten Sie die Platte 15 Minuten lang bei 4 °C, um das PF127 zu verflüssigen.</li>
	<li>Nach 15 Minuten saugen Sie das DPBS ab und wiederholen Sie Schritt 4.5 3x, um PF127 vollständig zu waschen.</li>
	<li>Bevor Sie Zellen in die Kanäle einführen, perfundieren Sie DMEM F12 mit 1% Matrigel für 30 Minuten durch die Kanäle, um die Zelladhäsion zu verbessern.</li>
</ol>5. HUVEC-Kultur
<ol><li>Endothelzellwachstumsmedium (EKGM) in einem 37 °C warmen Wasserbad für 30 min vorwärmen.</li>
	<li>Nehmen Sie in der Zwischenzeit ein Fläschchen mit kryokonservierten HUVECs aus dem Stickstofftank, lösen Sie vorsichtig die Kappe des Fläschchens und ziehen Sie sie dann wieder fest, um Stickstoff aus den Gewinden freizusetzen. Tauen Sie die Zellen sofort auf, indem Sie das Fläschchen 2 Minuten lang in ein 37 °C heißes Wasserbad tauchen, wobei Sie darauf achten, dass eine kleine Menge Eis im Fläschchen verbleibt. Spülen Sie das Fläschchen mit 70 % Ethanol aus, um eine Kontamination zu vermeiden. HINWEIS: Tragen Sie eine Schutzbrille, wenn Sie Zellen aus dem Stickstofftank entnehmen. Die Kappe des Fläschchens muss während dieses Vorgangs über dem Wasserspiegel gehalten werden.</li>
	<li>Bereiten Sie einen konischen 15-ml-Schlauch mit 5 ml vorgewärmtem EKGM vor. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen vorsichtig mit einer Mikropipette aus dem Fläschchen in das konische Röhrchen. Um sicherzustellen, dass keine Zellen zurückbleiben, geben Sie 1 ml frisches, vorgewärmtes Medium in das Kryofläschchen, spülen Sie das Innere aus und geben Sie alle verbleibenden Zellen in das konische Röhrchen.</li>
	<li>Das konische Röhrchen wird 3 Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten. Der Überstand wird verworfen, die Zellen in 10 ml frischem Medium resuspendiert, die Zellen in einen T75-Kolben überführt und der Kolben in einen 37 °C befeuchteten CO2 -Inkubator gestellt. HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um das im Gefriermedium im Kryoröhrchen vorhandene Dimethylsulfoxid durch Zentrifugation zu entfernen.</li>
	<li>Frischen Sie das Medium jeden zweiten Tag auf, bis die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % erreicht haben.</li>
</ol>6. Endothelisierung der Kanäle
<ol><li>ECGM, DPBS, Trypsin-neutralisierende Lösung und Trypsinethylendiamintetraessigsäure (TE) in einem 37 °C warmen Wasserbad für 30 min vorwärmen.</li>
	<li>Bei 90 % Konfluenz spülen Sie die Zellen in einem T75-Kolben mit 10 ml DPBS, geben Sie 1 ml 0,25 % TE in den Kolben und inkubieren Sie ihn 3 Minuten lang.</li>
	<li>Klopfen Sie vorsichtig auf die Seiten des Kolbens und fügen Sie 5 ml Trypsin-Neutralisationslösung hinzu, um den TE zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Verwenden Sie 5 ml frisches EKGM, um die verbleibenden Zellen zu sammeln und in den konischen Schlauch zu geben.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 250 × g für 3 Minuten, um das Küvettenpellet aufzufangen.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml frischem EKGM. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und wiederholen Sie Schritt 6.4, um ein Zellpellet zu erhalten. Resuspendieren Sie 3 Millionen Zellen in 90 μl frischem EKGM.</li>
	<li>Bevor Sie die Zellsuspension in den Kanal einführen, saugen Sie den Kanal kurz im Vakuum, um das Lumen zu reinigen. HINWEIS: Vermeiden Sie ein längeres Ansaugen des Kanals, um seine Integrität nicht zu beschädigen.</li>
	<li>Befüllen Sie den Kanal vorsichtig mit einer Zellsuspension bei einer Aussaatdichte von 0,5 Millionen Zellen pro Well. Verwenden Sie eine Mikropipette, um ~15 μl dieser Suspension hinzuzufügen, um den Kanal zu füllen. HINWEIS: Die Aussaatdichte kann je nach Größe des Kanals variieren. Diese Dichte ist für einen Kanal optimiert, der mit einer 20-G-Düse und einem Innendurchmesser von ca. 900 μm gedruckt wird.</li>
	<li>Legen Sie die Platte für 2 Stunden flach in den Inkubator. Drehen Sie anschließend die Platte um 180° um und halten Sie sie für die folgenden 2 Stunden in einer flachen Position.</li>
	<li>Waschen Sie den Kanal nach 4 Stunden mit DPBS, um nicht anhaftende und abgestorbene Zellen zu entfernen. Geben Sie 2 ml frisches ECGM in jede Vertiefung (1 mL auf jede Seite des Kanals). Starten Sie die dynamische Kultur an einer Wippe bei einem Neigungswinkel von 10° und 5 U/min, indem Sie die Platte mit den Kanälen parallel zur Schaukelrichtung auf der Wippe positionieren. Frischen Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag auf. HINWEIS: Die dynamische Kultur verbessert den Medienaustausch zwischen den Reservoiren und Kanälen und hilft den Zellen, sich über Nacht zu vermehren.</li>
</ol>7. Beurteilung der Endothelreifung
<ol><li>EKGM und DPBS in einem 37 °C warmen Wasserbad für 30 min und das Reagenz des Cell Counting Kit-8 (CCK8) bei Raumtemperatur vorwärmen.</li>
	<li>Stellen Sie eine Arbeitslösung aus CCK8 her, indem Sie 100 μl CCK8-Reagenz mit 1 ml frischem ECGM für jede Vertiefung mischen. Bereiten Sie bei der Arbeit mit einer Platte/einem 6-Kanal 600 μl CCK8-Reagenz vor, indem Sie es mit 6 ml frischem EKGM kombinieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Wachstumsmedium durch Saugen und spülen Sie die Kanäle mit DPBS aus. Geben Sie 1 ml CCK8-Arbeitslösung in jede Vertiefung und lassen Sie die Platte 30 Minuten lang flach im Inkubator bleiben. Starten Sie anschließend die dynamische Kultur auf einer Wippe, wie in Schritt 6.9 beschrieben, und setzen Sie diesen Vorgang für die nächsten 3 Stunden fort.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 3 Stunden den Inhalt aus jeder Vertiefung, indem Sie die Platte zur Seite kippen, und geben Sie ihn auf eine neue Platte mit sechs Vertiefungen. Spülen Sie die Kanäle mit DPBS aus und fügen Sie frisches Medium hinzu. HINWEIS: Decken Sie die Platte bis zur Absorptionsmessung mit Alufolie ab. Halten Sie ein konsistentes Reagenzienvolumen über alle Vertiefungen aufrecht, um einheitliche Messwerte zu gewährleisten. Vermeiden Sie beim Pipettieren sorgfältig das Einbringen von Luftblasen, die die Genauigkeit der optischen Dichtemessungen beeinträchtigen können.</li>
	<li>Nachdem Sie die Platte 15 s lang vorsichtig geschüttelt haben, um eine gleichmäßige Mischung der Farben zu gewährleisten, verwenden Sie einen Mikroplatten-Reader, um die Absorption bei 450 nm zu messen.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang in vordefinierten Zeitintervallen. Berechnen Sie die mittlere optische Dichte für jeden Zeitpunkt und zeichnen Sie eine Wachstumskurve in einer Grafiksoftware. Diese Kurve zeigt die relative Reifung des Endothels im Laufe der Zeit.</li>
</ol>8. Permeabilitätstest
<ol><li>Entferne das Medium aus einer Vertiefung von Interesse. HINWEIS: Für den Permeabilitätstest wird empfohlen, jede Vertiefung separat zu bearbeiten, um zu verhindern, dass andere Kanäle austrocknen, was ihre Gefäßpermeabilität verändern könnte.</li>
	<li>Bereiten Sie 6 ml 0,1 mg/ml-Lösung von FITC-konjugiertem Dextran vor, indem Sie 70 kDa FITC-Dextran in DPBS auflösen. HINWEIS: Bereiten Sie eine 20 mg/ml-Stammlösung von FITC-Dextran vor, indem Sie 100 mg FITC-Dextran in 5 ml DPBS auflösen. Nachdem Sie die Lösung vorsichtig vortexiert haben, aliquotieren Sie 500 μl in 1,5-ml-Röhrchen, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden. Diese Aliquots können maximal 6 Monate bei -20 °C gelagert werden. Vor der Durchführung des Assays verdünnen Sie die Stammlösung auf eine Arbeitskonzentration von 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Positionieren Sie die Platte fest auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie die Vergrößerung des Objektivs im Phasenkontrastmodus ein, um eine klare Sichtbarkeit der Kanalwand im interessierenden Bereich zusammen mit dem in der Nähe befindlichen Gel innerhalb des Sichtfelds zu gewährleisten. HINWEIS: Versuchen Sie für eine effektive Bewertung der Permeabilität, den Bereich des Gels zu maximieren, der den interessierenden Bereich im Sichtfeld umgibt. Dieser Aspekt ist der Schlüssel für eine genaue Überwachung des Dextrantransports.</li>
	<li>Nachdem Sie auf den gewünschten Bereich fokussiert haben, wechseln Sie vom Phasenkontrast in den Fluoreszenzmodus. Fügen Sie auf der Registerkarte Bildaufnahme FITC in den Weitfeldkanal ein, und nehmen Sie vor der Zugabe von Dextranlösung ein Bild auf, um die Hintergrundfluoreszenzintensität zu berechnen. Geben Sie dann 1 ml FITC-Dextran-Arbeitslösung auf eine Seite des Kanals und lassen Sie die Lösung zur anderen Seite des Bohrlochs fließen, angetrieben durch die hydrostatische Druckdifferenz.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder in vorgegebenen Zeitintervallen – häufiger für Kanäle mit hoher Permeabilität und seltener für solche mit geringerer Permeabilität.</li>
</ol>9. Messung der Fluoreszenzintensität in ImageJ
<ol><li>Messen Sie in der ImageJ-Bildanalysesoftware die Intensität zum Anfangszeitpunkt (It1), die durchschnittliche Intensität, die zu einem späteren Zeitpunkt (It2) beobachtet wurde, und die Intensität aufgrund von Hintergrundrauschen (Ib), wie unten beschrieben. Verwenden Sie Gleichung (1), um den Permeabilitätskoeffizienten (Pd) zu berechnen. T1 und T2 beziehen sich auf den Anfangs- und den späteren Zeitpunkt der Bildaufnahme. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66676/66676eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)<ol><li>Starten Sie ImageJ und öffnen Sie das Bild, das zum ursprünglichen Zeitpunkt aufgenommen wurde.</li>
		<li>Stellen Sie den Maßstab in ImageJ ein. Navigieren Sie zu Analysieren | Festlegen der Skalierung. Geben Sie den bekannten Maßstab und die Maßeinheit ein.</li>
		<li>Wählen Sie das Rechteckwerkzeug aus und zeichnen Sie ein Rechteck über den Bereich des Gels, in dem die Fluoreszenzintensitätsmessung erforderlich ist.</li>
		<li>Navigieren Sie zu Analysieren | Legen Sie Messungen fest und stellen Sie sicher, dass der mittlere Grauwert aktiviert ist. HINWEIS: Mit dieser Option wird die durchschnittliche Intensität innerhalb des ausgewählten Bereichs gemessen. Andere Parameter können je nach Bedarf für die jeweilige Analyse ausgewählt werden.</li>
		<li>Wenn der Bereich noch ausgewählt ist, navigieren Sie zu Analysieren | Messen Sie oder drücken Sie einfach M. Warten Sie, bis sich ein Ergebnisfenster öffnet, in dem die mittlere Fluoreszenzintensität und alle anderen ausgewählten Parameter angezeigt werden.</li>
		<li>Führen Sie drei Messungen durch und berechnen Sie den durchschnittlichen Wert der Fluoreszenzintensität in einer Tabelle.</li>
		<li>Dieses Verfahren wird für die Bilder wiederholt, die zum folgenden Zeitpunkt t2 aufgenommen wurden, sowie für die Bilder, die vor der Zugabe der Dextranlösung zur Berechnung der Fluoreszenzintensität zu einem späteren Zeitpunkt aufgenommen wurden, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>3D-Bioprinting für die schnelle Herstellung von Gefäßnetzwerken mit Gefäßen auf einer Platte

<table><tbody><tr><td>10 mL Serologische Pipette</td><td>SPL</td><td>SPL 91010</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze&nbsp;</td><td>Shinchang Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL konisches Röhrchen</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>3D-Biodrucker&nbsp;</td><td>T& R Biofab</td><td>3DX-Drucker 6-Well-Platte</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>SPL</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbänke</td><td>CHC LAB</td><td>PCHC-777A2-04,&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inverse Hellfeldmikroskope</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählkit (CCK8)</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählkit (CCK8)</td><td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflasche 75T</td><td>SPL</td><td>70075</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembranmatrix, LDEV-frei, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Zellkulturqualität</td><td>Sigma aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kit</td><td>DOW</td><td>DC-184</td><td></td></tr><tr><td>DOWSIL SE 1700 Klar W/C 1,1 KG Kit&nbsp;</td><td>DOW</td><td>2924404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS - 1x</td><td>Welgene</td><td>LB001-01</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2 (Ready to use)</td><td>Promocell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Micro pipette(1000,200,100,20,10)</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol 99,9%</td><td>Duksan</td><td>D5</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen aus Rinderplasma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-1G</td><td></td></tr><tr><td>FITC Dextran 70 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierende Kügelchen (1,0 &mu; m, grün)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1030-1ML</td><td></td></tr><tr><td>GelMA-Pulver (Gelatinemethacrylat) 50 g</td><td>3D Materialien&nbsp;</td><td>20JT29</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, Einfriermedium für Wiederherstellungszellkulturen, 50 mL</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVECs (humane Endothelzellen der Umbillalvene)</td><td>Promocell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Inkubator</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Lebend-/Totlebensfähigkeits-/Zytotoxizitätskit (für Säugetierzellen)</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumphenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphatpulver&nbsp;</td><td>Tokoyo Chemical Industry CO.</td><td>85073-19-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, Zählkammerdeckel</td><td>Marienfeld Superior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, Hämozytometer, Zellzählkammer</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-0650030</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>eppendorf</td><td>Centrifuge 5920 R</td><td></td></tr><tr><td>NCViewer.com</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stickstofftank</td><td>WORTHINGTON INDUSTRIES</td><td>LS750</td><td></td></tr><tr><td>Omnicure UV Laser</td><td>EXCELITAS</td><td>SERIES 1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Lösung (100x)</td><td>GenDEPOT</td><td>CA005-010</td><td></td></tr><tr><td>Planetenmischer</td><td>THINKY CORPORATION, japan</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Plasmabehandlungsmaschine</td><td>FEMTO SCIENCE</td><td>CUTE-1MPR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>Vorgefertigter Puffer, (P2007-1) 10x PBS</td><td>Biosesang</td><td>PR4007-100-00</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien-Aufbewahrungsschrank</td><td>ZIO FILTER TECH</td><td>SC2-30F-1306D1-BC</td><td></td></tr><tr><td>Echtzeit Live Cell Imaging Mikroskop</td><td>Carl ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kühlschrank</td><td>SAMSUNG</td><td>RT50K6035SL</td><td></td></tr><tr><td>ROCKER 2D digital</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>Schaufel-Spatel</td><td>CacheBy</td><td>SL-SCO7001-EA</td><td></td></tr><tr><td>Sigma, Trypsin-EDTA Solition, 0,25%</td> <td>Sigma aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenzylinder Spitzenkappe</td><td>FISNAR</td><td>3051806</td><td></td></tr><tr><td>Tally-Zähler</td><td>Control Company</td><td>&nbsp; C23-147-050</td><td></td></tr><tr><td>Konische Düse (18 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-18G-U</td><td></td></tr><tr><td>Konische Düse (22 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-22G-U</td><td></td></tr><tr><td>Konische Düse 20 G</td><td>Musashi</td><td>TPND-20G-U</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin aus Rinderplasma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7326-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Timer, 4-Kanal</td><td>ETL</td><td>SL. Tim3005</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Lösung 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralisationslösung</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td></td></tr><tr><td>UG 24 mL UG Salbenglas</td><td>Yamayu</td><td>Nr. 3-53</td><td></td></tr><tr><td>UG 58 mL UG Salbenglas</td><td>Yamayu</td><td>Nr. 3-55</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WB-11</td><td></td></tr><tr><td>Kraftmaschine</td><td>Sartorius</td><td>BCE2241-1SKR</td><td></td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-bioprinting-verfahren zur modellierung der gefäßpermeabilität in standard-sechs-well-platten mit größen- und musterflexibilität

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

Die VOP-Plattform, die sich durch Flexibilität in Größe und Muster auszeichnet, wurde mit einem Mehrkopf-Bioprinting-System hergestellt. Sowohl hohle als auch perfusionsfähige Kanäle wurden mit HUVECs besiedelt, um die Endothelisierung zu erleichtern, und anschließend mit einem Permeabilitätsassay bewertet (Abbildung 1A). Um die Multiskalen-Fertigungsfähigkeit dieser Methode zu demonstrieren, haben wir drei verschiedene Konfigurationen gedruckt: gerade, gegabelt und gewunden (Abbildung 1B). Durch einen unkomplizierten Herstellungsansatz können sechs hohle, perfundierte Gefäßkanäle, die in eine Hydrogelmatrix eingebettet sind, in einer Standard-Sechs-Well-Platte hergestellt werden. Diese Kanäle können dann mit HUVECs endothelisiert werden (Abbildung 2A). Die Zellen heften sich schnell an und vermehren sich, um die luminale Oberfläche des Gefäßkanals zu bedecken (Abbildung 2B). Zellen, die sowohl an der unteren als auch an der oberen luminalen Oberfläche haften, weisen eine gleichmäßige Verteilung innerhalb des Lumens auf (Ergänzende Abbildung S1).
Die Platte wurde für 3 Tage in einen befeuchteten Inkubator gelegt, um die Silikontinte aushärten zu lassen und gleichzeitig sicherzustellen, dass das Opfermuster frei von Austrocknung blieb (Abbildung 3A). Um die Strömung durch diese Kanäle zu bewerten, wurden grüne Mikrokügelchen eingeführt, die zeigen, dass die Kanäle effektiv perfundierbar sind (Ergänzendes Video S1). Der Durchmesser der Kanäle wurde von 558 ± 38 μm auf 1094 ± 45 μm variiert, indem die Düsengröße während des Opfermodelldrucks von 22 G auf 18 G geändert wurde. Zusätzlich wurde die geometrische Konfiguration der Kanäle durch Modifikation des G-Codes des Biodruckers manipuliert (Supplemental File 1), um das Drucken von gewundenen und gegabelten Mustern zu ermöglichen (Abbildung 3B).
Die Vernetzungsdauer mit UV wurde auf 120 s optimiert, was eine effektive Zellproliferation unterstützt (Ergänzende Abbildung S2). Diese Vernetzungsdauer führte zu einer physiologisch relevanteren Umgebung, die die Proliferation von Endothelzellen fördert, wahrscheinlich aufgrund der ausgewogenen mechanischen Eigenschaften und Porosität des Hydrogels, was eine bessere Zelladhäsion und anschließende Proliferation ermöglicht. HUVECs vermehrten sich effektiv auf der luminalen Oberfläche und zeigten am Tag 5 nach der Aussaat eine kopfsteinpflasterartige Morphologie. Die Reifung des Endothels wurde mit einem CCK8-Assay bewertet, der an den Tagen 1, 3 und 5 durchgeführt wurde (Abbildung 4A, B). Die Reifung des Endothels wurde durch Immunfärbung für CD31 5 Tage nach der Zellaussaat verifiziert, die die Lokalisation von CD31 an den Tight Junctions zeigte (Abbildung 4D).
Um die Barrierefunktion des Endothels zu bewerten, perfundierten wir am 5. Tag der Reifung eine 70 kDa Dextranlösung durch die Kanäle. Zum Vergleich wurde ein Kontrollkanal ohne Endothel (blank) gewählt. Der endothelialisierte Kanal zeigte im Laufe der Zeit minimale Veränderungen der Fluoreszenz innerhalb der perivaskulären Gelregion, was darauf hindeutet, dass das Endothel seine Barrierefunktion effektiv beibehielt. Die nackten Kanäle zeigten jedoch eine Zunahme der Fluoreszenz in der perivaskulären Gelregion, was auf eine höhere Permeabilität aufgrund des Fehlens von Endothel hinweist (Abbildung 4C und Abbildung 4E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig01.jpg"> Abbildung 1: Präparation von gedruckten Gefäßkanälen und deren Konfigurationen. (A) Schematische Darstellung der Herstellung, Endothelisierung und Permeabilitätsuntersuchung von gedruckten Gefäßkanälen. (B) Schematische Darstellung der drei Konfigurationen, die in diesem Verfahren demonstriert werden: gerade, gegabelt und gewunden. Abkürzung: VOPs = Gefäße auf einer Platte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig02.jpg"> Abbildung 2: Zeitleiste für die Herstellung des Drucks des Opfermusters und der Siliziumkammer sowie der Endothelisierung des Gefäßkanals. (A) Die Abbildung stellt eine einzelne Vertiefung der Vertiefungsplatte dar und AA' bezieht sich auf die Ansicht entlang der Querschnittsebene. (B) Repräsentative Bilder der Schritte des Herstellungsprozesses. Maßstabsstäbe = 5 mm (B1), 200 μm (B2-4). Abkürzungen: GelFib = 15 % Gelatinemethacrylat und 1 % Fibrinogen in 0,05 % w/v Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat-Lösung; HUVECs = Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig03.jpg"> Abbildung 3: Gefäße auf einer Platte. (A) Bruttobild von Gefäßen auf einer Platte nach dem Drucken des Opfermusters und der Silikonkammer. (B) Demonstration der Multiskalenherstellung von Gefäßkanälen mit einer Vielzahl von Konfigurationen und Größen, die mit grünen Mikrokügelchen durchblutet sind. Maßstabsbalken = 200 μm (gerade Kanäle), 1.000 μm (gewellte und gegabelte Kanäle). Abkürzungen: ID = Innendurchmesser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig04.jpg"> Abbildung 4: Gefäßkanäle und ihre endotheliale Reifung und Permeabilität. (A) Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Gefäßkanälen an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Aussaat mit grün fluoreszierenden Protein-markierten HUVECs, die die Proliferation und die Kopfsteinpflastermorphologie von HUVECs an Tag 5 zeigen. (B) Die Endothelreifung wurde mit einem CCK-8-Assay an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Zellaussaat bewertet. (C) Permeabilitätsassay von endothelialisierten (Endothel +) und nackten (Endothel -) Gefäßkanälen. (D) Repräsentative Bilder der CD31-Färbung veranschaulichen die Lokalisation von CD31 an Tight Junctions am Tag 5. (E) Quantifizierung der Diffusionspermeabilität. Maßstabsleisten = 200 μm (A, C, D). Abkürzungen: HUVECs = Endothelzellen der menschlichen Nabelvene; GFP = grün fluoreszierendes Protein; GFP HUVECs = GFP-getaggte HUVECs; CCK-8 = Zellzählkit 8; DAPI = 4'6-Diamidino-2-phenylindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Druckerschwärze</td>
			<td colspan="2">Parameter drucken</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Düsen-Manometer</td>
			<td>Temperatur (°C)</td>
			<td>Luftdruck (kPa)</td>
			<td>Kopfgeschwindigkeit (mm/min)</td>
		</tr><tr><td>Opfer-Tinte</td>
			<td>18</td>
			<td>37</td>
			<td>40-48</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Silikon-Tinte</td>
			<td>22</td>
			<td>5</td>
			<td>100</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Druckparameter für die Opfer- und Silikontinten.
Ergänzende Datei 1: G-Code-Skript mit den Befehlen für den 3D-Druck des Opfermusters und der Silikonkammer in einer Sechs-Well-Platte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_GCode%20File_Jove.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Repräsentative Bilder der unteren und oberen luminalen Oberfläche nach dem Zell-Seeding, die die Bindung von GFP-HUVEC sowohl in der unteren als auch in der oberen Brennebene zeigen. Maßstabsleisten = 200 μm. Abkürzungen: UU' = obere Brennebene; LL' = untere Brennebene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S1%20rev.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S2: GFP-HUVEC-Proliferation unter unterschiedlichen Vernetzungsdauern mit UV (405 nm). Maßstabsleisten = 200 μm. Abkürzungen: HUVECs = Endothelzellen der menschlichen Nabelvene; GFP = grün fluoreszierendes Protein; GFP HUVECs = GFP-getaggte HUVECs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S2%20rev.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S1: Perfusion mit grünen Mikrokügelchen, die die effektive Perfusion durch die geraden, gewundenen und gegabelten Kanäle zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/Channels%20Perfusion.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle S1: Funktionen von G-Code- und M-Code-Befehlen. HINWEIS: Im G-Code geben X, Y und Z die Koordinaten für die Bewegung entlang der X-Achse, der Y-Achse bzw. der Z-Achse an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Hochdurchsatz-Bioprinting-Verfahren zur Modellierung der Gefäßpermeabilität in Standard-Sechs-Well-Platten mit Größen- und Musterflexibilität

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in ...

high-throughput-bioprinting-method-for-modeling-vascular-permeability

Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

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Hochdurchsatz-Bioprinting-Verfahren zur Modellierung der Gefäßpermeabilität in Standard-Sechs-Well-Platten mit Größen- und Musterflexibilität

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