Name: Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Protein-Varianten durch Hefe-Oberflächendisplay mit magnetischen Perlen und Durchflusszytometrie anreichern. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle der Selektionsbedingungen für die Entwicklung zellulärer Therapien.

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<meta charset="utf8"></head><body>Optimierung der Proteinfunktionen durch Techniken zur Anzeige von Hefeoberflächen

Das Display der Hefeoberfläche ist eine der Schlüsseltechnologien im Bereich des Protein-Engineerings. Es ermöglicht die Auswahl von Proteinvarianten mit gewünschten Eigenschaften wie verbesserter Affinität oder Stabilität. Es wurde erstmals 19971 eingeführt und ist neben dem Phagen-Display 2,3, dem Ribosomen-Display4 und dem Säugetierzell-Display 5,6,7 eine der am häufigsten verwendeten Display-Technologien. Das Protein of Interest (POI) wird auf der Oberfläche von Hefezellen dargestellt, indem es mit Verankerungsproteinen fusioniert wird. Es steht eine Reihe verschiedener Ankerproteine zur Verfügung, und am häufigsten wird der POI mit dem C-Terminus des Hefe-Agglutinin-Paarungsproteins Aga2p 1,8 fusioniert. Darüber hinaus wird der POI in der Regel von zwei Tags flankiert, wie z. B. einem Hämagglutinin-Tag (HA-Tag) und einem c-myc-Tag, was die Detektion des Anzeigepegels unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern und Durchflusszytometrie ermöglicht (Abbildung 1A). Typische Hefeauswahlkampagnen beinhalten eine Kombination aus magnetischer Bead-Selektion und durchflusszytometrischer Sortierung. Die Bead-Selektionen ermöglichen den Umgang mit großen Zellzahlen und die Anreicherung von Proteinvarianten, die an das Zielantigen binden, auch bei geringen Affinitäten, da multivalente Wechselwirkungen mit den antigenbeladenen Beads zu Aviditätseffekten führen und somit den Verlust von Varianten mit niedriger Affinität verhindern (Abbildung 1B). Die durchflusszytometrische Analyse und Selektion bietet den Vorteil, dass die Bindung der angezeigten POI-Varianten an das markierte Antigen sichtbar gemacht werden kann. Folglich können die Bindungspopulationen sortiert und kultiviert werden, was zur Anreicherung von Proteinvarianten mit gewünschten Eigenschaften über mehrere Sortierrunden hinweg führt. Darüber hinaus können zusätzliche Runden der zufälligen Mutagenese durchgeführt werden, um die Diversität und damit die Wahrscheinlichkeit, zusätzliche Mutationen zu finden, die zur Affinität und/oder Stabilität des Proteins beitragen, weiter zu erhöhen.
Die Darstellung der Hefeoberfläche bietet bestimmte Vorteile, wie z.B. (a) eukaryotische Expressionsmaschinerie, die sowohl oxidative Proteinfaltung als auch eukaryotische posttranslationale Modifikationen (wie N-Glykosylierung) ermöglicht, (b) Expressionsnormalisierung aufgrund der Detektion der beiden Peptid-Tags, die das Protein flankieren, (c) visuelle Inspektion des Selektionsfortschritts durch Durchflusszytometrie (z. B. Prozentsatz der Bindungszellen und Bindungsintensität) und (d) die Möglichkeit, einzelne Proteinmutanten auf Hefe (z. B. Analyse der Thermostabilität sowie der Affinität), die eine zeitsparende Alternative zur aufwendigen Proteinexpression und -reinigung darstellt9. Tatsächlich haben sowohl die Affinitäten (KD-Werte) als auch die Stabilitäten (T50-Werte) von Proteinen, die auf der Hefeoberfläche angezeigt werden, gute Korrelationen mit Daten gezeigt, die mit biophysikalischen Methoden und löslichen Proteinen gewonnen wurden 9,10,11,12. Das Hefeoberflächendisplay wurde für das Engineering einer Vielzahl von Proteinen eingesetzt, z. B. für die Antikörperfragmente 13,14,15,16, die 10. Typ-III-Fibronektindomäne 17,18, rcSso7d19,20 oder Knottine21. In ähnlicher Weise wurden umfangreiche Forschungen durchgeführt, um das Design von Hefebibliotheken zu optimieren, indem die randomisierten Positionen sowie die Verwendung von Aminosäure-Codons geändert wurden 17,22,23. Die Anzeige der Hefeoberfläche hat sich als erfolgreich für die Entwicklung der Stabilität 14,15,24,25, der Affinität 18,26,27, der enzymatischen Aktivität 28,29,30,31 und der Proteinexpression32 erwiesen. Darüber hinaus wurden anspruchsvollere Anwendungen, wie z. B. die bedingte Bindung in Gegenwart oder Abwesenheit eines kleinen Moleküls, unter Verwendung der Hefeoberflächenanzeige20 durchgeführt.
In diesem Protokoll beschreiben wir alle wesentlichen Schritte für eine Selektionskampagne mit Hefeoberflächendarstellung am Beispiel der G4-Bibliothek (basierend auf der 10. Typ III Fibronektindomäne, Fn3), die gegen das Antigen humanes Retinol-bindendes Protein 4 (hRBP4) in Gegenwart des kleinen Moleküls A112020 selektiert wurde. Diese Selektion wurde durchgeführt, um eine Protein-Protein-Interaktion zu erhalten, die von einem kleinen Molekül abhängt, das als molekularer Schalter verwendet werden kann. Bemerkenswert ist, dass zwar alternative Ansätze mit der Darstellung der Hefeoberfläche möglich sind, typische Hefeselektionen jedoch in der Regel auf die Bindung an ein Zielantigen ohne vorherige Bindungsaffinität abzielen. Wir decken alle Schritte einer Hefeauswahlkampagne ab, die die Kultivierung einer Hefebibliothek, die Kügelchenauswahl, die durchflusszytometrische Sortierung und die Affinitätsreifung durch fehleranfällige PCR (epPCR) umfasst. Daher ergänzt dieses Protokoll frühere Protokolle zur Anzeige von Hefeoberflächen33, 34 und kann als Grundlage für die Auswahl der Hefeoberflächenanzeige (Abbildung 1) mit einer beliebigen Hefebibliothek und einem Zielantigen der Wahl verwendet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig1v5.jpg"> 
Abbildung 1: Prinzip der Hefeoberflächenanzeige und ein typischer Arbeitsablauf für die Auswahl der Hefeoberflächenanzeige. (A) Der POI wird in einen Hefeoberflächen-Anzeigevektor kloniert und typischerweise von einem N-terminalen HA- und einem C-terminalen c-myc-Tag flankiert. Das Konstrukt ist mit dem Hefe-Paarungsprotein Aga2p fusioniert, um es auf der Oberfläche anzuzeigen. Bei dem abgebildeten Protein handelt es sich um das technisch hergestellte Binder "RS3" von PDB ID: 6QBA20. (B) Flussdiagramm, das einen typischen Arbeitsablauf für Auswahlkampagnen für Hefeoberflächendisplays veranschaulicht, die die Anreicherung von Proteinvarianten mit den gewünschten Eigenschaften durch Kügelchenauswahl und durchflusszytometrische Sortierung sowie epPCR für die Affinitätsreifung kombinieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig1largev5.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>10-beta elektrokompetent E. coli&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Carl Roth</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin-Natriumsalz</td><td>Carl Roth</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-myc-Antikörper, Klon 9E10, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A488 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-myc-Antikörper, Klon 9E10, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A647 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-Antikörper, Klon 16B12, AF488</td><td>BioLegend</td><td>901509 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-Antikörper, Klon 16B12, AF647</td><td>BioLegend</td><td>682404 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin, kalte Ethanolfraktion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäuremonohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>D-Galaktose</td><td>Carl Roth</td><td>4987.2</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Difco Hefe Stickstoffbasis</td><td>Becton Dickinson (BD)&nbsp;</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumhydrogenphosphat-Heptahydrat</td><td>Carl Roth</td><td>X987.3</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Carl Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Biotin Binder</td><td>Invitrogen</td><td>11047 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EBY100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette 1 mm (für E.coli)</td><td>VWR</td><td>732-1135</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette 2 mm (für Hefe)</td><td>VWR</td><td>732-1136</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>MERCK</td><td>1070172511</td><td></td></tr><tr><td>GeneMorph II Random Mutagenesis Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>200550</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Casamino Acids</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>223120</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>131339.1211</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose& nbsp;</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetat-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNA-Gel-Extraktionskit</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch PCR & DNA-Aufreinigungskit</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1S-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Auswuchsmedium</td><td>NEB</td><td>B9035S</td><td></td></tr><tr><td>pCTCON2</td><td>Addgen</td><td>#41843</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His Antikörper, AF488</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His-Antikörper, AF647</td><td>Qiagen</td><td>35370</td><td></td></tr><tr><td>Pepton ex Kasein tryptisch verdaut</td><td>Carl Roth</td><td>8986.3</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>SaII-HF</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat</td><td>Carl Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Steritop Flaschenaufsatzfilter mit Gewinde</td><td>MERCK</td><td>S2GPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>S32354 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat-Dihydrat</td><td>Carl Roth</td><td>4088.1</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis-Spektralphotometer</td><td>Agilent</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt, mikrogranuliert</td><td>Carl Roth</td><td>2904.4</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep Hefe Plasmid Miniprep II</td><td>Zymo Research</td><td>D2004&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

protein-engineering durch hefe-oberflächendisplay

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Die G4-Bibliothek wurde gegen das Antigen hRBP4 selektiert, das an den niedermolekularen Wirkstoff A1120 gebunden ist. Die Färbung der Bibliotheken für die durchflusszytometrische Sortierung wurde wie in Methode 6 beschrieben durchgeführt, und die angewandte Gating-Strategie ist in Abbildung 2A dargestellt. Ein erstes Gate umfasste alle Zellen basierend auf der Zellmorphologie, und das zweite Gate (Histogramm der FSC-Breite) zeigte eine stringente Gating-Strategie, die angewendet wurde, um einzelne Zellen auszuwählen und Zellaggregate zu entfernen. Das dritte und letzte Gate zeigte die Darstellung von Proteinvarianten (x-Achse) versus Antigenbindung (y-Achse). Hefezellen, die sowohl Display- als auch Bindungssignale zeigten, wurden sortiert. Wichtig ist, dass das Sortiergatter stringent eingestellt wurde, um Bindungsdomänen mit hohem Bindungssignal und damit hoher Affinität anzureichern. Diese stringente Selektion führte zu einer Anreicherung von Hefezellen, die während der gesamten Selektionskampagne spezifisch an das Zielantigen binden (Abbildung 2B). In späteren durchflusszytometrischen Sortierrunden wurde die Antigenkonzentration um das 10-fache (von 100 nM auf 10 nM) gesenkt. Dadurch wurde das Gesamtbindungssignal reduziert, und nur Bindemittel mit einer hohen Affinität waren noch nachweisbar und sortiert (Abbildung 2C).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig2v5.jpg"> 
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse einer Selektion der Fn3-basierten G4-Bibliothek zur Bindung an das Antigen (hRBP4 in Gegenwart von A1120). (A) Die allgemeine Gating-Strategie zur Sortierung von Hefebibliotheken. Das erste Gatter (FSC vs. SSC) besteht darin, alle Hefezellen auszuwählen und Streuereignisse auszuschließen; Das zweite Gate (Histogramm von FSC-W) zielt darauf ab, Zellaggregate zu entfernen und nur einzelne Hefezellen auszuwählen. Das dritte Gate stellt das Oberflächenanzeigeniveau (Nachweis des HA- oder c-myc-Tags) vs. die Bindung an das Antigen dar (hier hRBP4 in Gegenwart von 5 μM A1120, nachgewiesen durch einen Anti-His-Antikörper). Die Bibliothek wurde zusätzlich nur mit Sekundärantikörpern (ohne Antigen) gefärbt, bei denen keine Antigenbindung zu erwarten ist. Sortierte Zellen werden blau hervorgehoben. (B) Entwicklung der G4-Bibliothek über 3 Runden der durchflusszytometrischen Sortierung. Eine Anreicherung der Bindungspopulation kann mit jeder Auswahlrunde beobachtet werden. (C) Die Verwendung niedrigerer Antigenkonzentrationen ermöglicht die Selektion von Proteinvarianten mit einer höheren Affinität zum Zielantigen. Bei 10-facher Reduktion der Antigenkonzentration (hier hRBP4) erscheinen unterschiedliche Diagonalen, die auf das Vorhandensein von Klonen mit höherer (sortierte Zellen, blau) oder niedrigerer Affinität hinweisen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig2largev5.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

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Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

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