Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

In meinem Labor entwickeln wir zelluläre Therapien der nächsten Generation, indem wir Protein-Engineering mit Zell-Engineering kombinieren. Also entwickeln wir Proteinkomponenten, um neue Funktionen zu erhalten oder bestehende zu verbessern, und bauen diese Nullproteine dann in zelluläre Therapeutika ein. Wir haben die Oberflächenanzeige für spezielle Anwendungen weiterentwickelt, einschließlich des Proteinstabilitäts-Engineerings, der Entwicklung von niedermolekularen regulierten Proteinschaltern und des spezifischen Targetings von krebsassoziierten aktivierten Rezeptorbestätigungen.

Der Vorteil der Hefeoberflächenanzeige im Vergleich zu anderen Displaytechnologien wie Phagen- oder Ribosomendisplay liegt in der durchflusszytometrischen Visualisierung der Bibliothek während des Sortierprozesses und der präzisen Steuerung der Selektionsbedingungen, wie z.B. der Antigenkonzentration und der Stringenz des Sortiertors. Bereiten Sie zunächst die Kügelchen für die erste Kügelchenauswahl vor, indem Sie 10 Mikroliter magnetische Biotin-Bindemittel-Magnetkügelchen in 990 Mikrolitern PBSA resuspendieren. Legen Sie die Tube zum Waschen bei geöffnetem Deckel zwei Minuten lang auf ein Magnetgestell.

Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand. Resuspendieren Sie die gewaschenen Kügelchen in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in einem Milliliter PBSA mit 6,7 bis 33 Picomole biotinyliertem Antigen. Stellen Sie das Röhrchen nach der Inkubation zwei Minuten lang bei geöffnetem Deckel auf ein Magnetgestell, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die antigenbeladenen Kügelchen mit einem Milliliter PBSA.

Sobald sich die Kügelchen abgesetzt haben, entfernen Sie die PBSA. Suspendieren Sie dann die antigenbeladenen Kügelchen in 50 Mikrolitern PBSA. Bereiten Sie die Zellen, die Antigenkügelchen und eine Lösung aus Bärenkügelchen für die negative Selektion vor.

Nach dem Waschen resuspendieren Sie die Antigenkügelchen in 50 Mikrolitern PBSA und resuspendieren Sie die Bärenkügelchen in 150 Mikrolitern PBSA. Für die erste negative Selektion fügen Sie 50 Mikroliter gewaschene nackte Kügelchen zu 950 Mikrolitern gewaschenen Zellen in PBSA hinzu und inkubieren Sie die Mischung 1,5 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Legen Sie nach der Inkubation die Röhrchen mit den Bärenperlenzellsuspensionen bei geöffnetem Deckel auf ein Magnetgestell.

Pipettieren Sie die Flüssigkeit im Deckel in das Röhrchen und warten Sie zwei Minuten lang. Übertragen Sie dann die ungebundenen Zellen in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 50 Mikroliter gewaschene Bärenkügelchen hinzu. Nach drei Runden negativer Selektion geben Sie 50 Mikroliter antigenbeladene Bead-Lösung in die Zellen.

Zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Legen Sie nun die Zellen mit den antigenbeladenen Kügelchen bei geöffnetem Deckel auf ein Magnetgestell. Pipettieren Sie alle Flüssigkeiten, die sich im Deckel befinden, in das Röhrchen.

Warten Sie zwei Minuten, bevor Sie ungebundene Zellen verwerfen. Führen Sie alle verbleibenden Schritte wie für die erste Antigenbead-Auswahl beschrieben aus. Nach drei negativen und einer positiven Selektion werden die Zellen rasch in einem Milliliter SDCAA resuspendiert und in einen Shaker-Kolben mit einem größeren Volumen SDCAA überführt.

Nach der Induktion der Oberflächenexpression von Proteinen in SGCAA über Nacht in Hefebibliotheken werden genügend Zellen pelletiert, um die 10-fache Diversität abzudecken, und der Überstand wird verworfen. Resuspendieren Sie das Pellet in PBSA und geben Sie es in Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 30 Millionen Zellen für die Färbung in jedem Röhrchen.

Bereiten Sie so viele Röhrchen vor, wie je nach Diversität erforderlich sind, einschließlich eines Kontrollröhrchens ohne Antigen. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2000 x g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern PBSA, das das Antigen enthält, und inkubieren Sie es eine Stunde lang bei vier Grad Celsius.

Nachdem Sie die Zentrifugation erneut durchgeführt haben, entfernen Sie PBSA aus dem Pellet. Als nächstes resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern kaltem PBSA, das Antikörper für die Displayfärbung und den Antigennachweis enthält. 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen bei 2000 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Geben Sie einen Milliliter PBSA in das Pellet und wiederholen Sie die Zentrifugation. Entfernen Sie dann den größten Teil des Überstands und lassen Sie nur 20 bis 30 Mikroliter übrig, um ein Austrocknen des Pellets zu verhindern.

Suspendieren Sie das Pellet direkt vor dem Sortieren in kaltem PBSA. Sortieren Sie nun die Zellen direkt in SDCAA ein Medium. Nach der Sortierung werden die Zellen in einen Schüttelkolben mit einem größeren Volumen SDCAA-Medium überführt und bei 30 Grad Celsius und Schütteln bei 180 U/min inkubiert.