Name: Generierung von Gefäßorganoiden aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Erfahren Sie eine skalierbare Methode zur Erzeugung homogener Gefäßorganoiden aus humanen iPSCs mit ROCK-Inhibitoren und Mikrowell-Confinement. Diese Technik verbessert die Reproduzierbarkeit und ermöglicht morphologische Analysen sowie Krankheitsmodellierungen.

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<meta charset="utf8"></head><body>hiPSC-abgeleitete vaskuläre Organoide für das Wirkstoffscreening und die Modellierung von Krankheiten

<ol><li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 364 (6444), 960-965 (2019).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3d+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3d tissue physiology in vitro.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3d+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Koike, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+hepato-biliary-pancreatic+organogenesis+from+the+foregut-midgut+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary.</a> Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).</li>
<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li>
<li>Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+blood+vessel+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).</li>
<li>Wimmer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+vessel+organoids+as+a+model+of+diabetic+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy.</a> Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).</li>
<li>He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2021).</li>
<li>He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+S+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible%2C+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).</li>
<li>Hwang, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwell-mediated+control+of+embryoid+body+size+regulates+embryonic+stem+cell+fate+via+differential+expression+of+wnt5a+and+wnt11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11.</a> Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).</li>
<li>Antonchuk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+embryoid+bodies+from+human+pluripotent+stem+cells+using+aggrewell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates.</a> Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Star+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+pericyte-like+cells+induce+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties.</a> Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+vascular+and+neuronal+networks+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform.</a> Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).</li>
<li>Sakurai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+vascularized+bleeding+model+that+integrates+the+principal+components+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis.</a> Nat Commun. 9 (1), 509(2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+biomimetic+pericyte-covered+3d+microvascular+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).</li>
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<li>Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+perfusable+microvascular+network+morphology+using+a+multiculture+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).</li>
<li>Haase, K., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+on-chip+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in on-chip vascularization.</a> Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).</li>
<li>Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+models+of+vascular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).</li>
<li>Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+vascular+growth+and+tissue+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nat Methods. 16 (3), 255(2019).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>711-546-152</td><td>rekonstituieren mit 0,25 mL 50% Glycerin,&nbsp; lagern bei -20&Grad; C für bis zu 1 Jahr, Verdünnungsverhältnis für den Gebrauch: 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>705-606-147</td><td>rekonstituiert mit 0,25 ml 50 % Glycerin, Lagerung bei -20 μg; C für bis zu 1 Jahr, Verdünnungsverhältnis für den Gebrauch: 1:1000</td></tr><tr><td>B27-Supplement minus Vitamin A (50x)</td><td>Gibco</td><td></td><td>12587010 Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquot und bei -20 &deg lagern; C, Gefrier-Auftau-Zyklus vermeiden</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>ProSpec</td><td>CYT-081</td><td>rekonstituiert mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 100 ng/&micro; L, aliquot und bei -20 & deg lagern; C</td></tr><tr><td>CD31 Antikörper&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab28364</td><td>Verdünnungsverhältnis: 1:400</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>022626001</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423/10</td><td>Die Stammlösung bei 12 mM mit DMSO herstellen und bei -20 & deg lagern; C für bis zu 1 Jahr.</td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Tocris</td><td>7163/10</td><td>stellt die Stammlösung bei 100 & Mikro her; M mit DMSO und lagern bei -20 & Grad; C für bis zu 1 Jahr.</td></tr><tr><td>Kollagen I&nbsp;</td><td>Corning</td><td>40236</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td>AXRMP/Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Corning Elplasia Platten</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, Pulver</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>10x Stammlösung mit biograde ddH2O herstellen und mit einem 0,2 &; Mikro sterilisieren; m Filter. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Edi042A</td><td>Cedars Sinai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Medchemexpress LLC</td><td>HY1039610MG</td><td>die Stammlösung bei 1 mM mit DMSO herstellen und bei -20 & deg lagern; C für bis zu 1 Jahr.</td></tr><tr><td>ERG Antikörper</td><td>Cell Singali Technology</td><td>97249</td><td>Verdünnungsverhältnis: 1:400</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Auftauen bei 4 &deg; C&nbsp; und aliquot, speichern at&nbsp; -20 &Grad; C für bis zu fünf Jahre oder bei 4 Grad lagern; C für bis zu einem Monat</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>ProSpec</td><td>CYT557</td><td>rekonstituiert mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 100 ng/&mikro; L, aliquot und bei -20 & deg lagern; C</td></tr><tr><td>Fluorodish Zellkulturschale</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td><td>rekonstituiert mit DMSO in einer Konzentration von 12 mM, aliquotiert und lagert bei -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heparin, 100 kU</td><td>MilliporeSigma</td><td>375095100KU</td><td>rekonstituieren mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 4 kU/mL</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13998123</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>bei 4 & Grad auftauen; C, aliquot und bei -20° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus vermeiden</td></tr><tr><td>Matrigel, GFR Basalmembran Matrix</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquotieren und bei -80° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus vermeiden</td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA, 100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Water</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001130</td><td>Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquot und bei -20° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus vermeiden</td></tr><tr><td>N2-Ergänzung (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Auftauen bei 4 & Grad; C, aliquot und bei -20° lagern; C, Frost-Tau-Zyklus</td></tr><tr><td>vermeiden NaOH-Lösung (1 M)</td><td>Cytiva&nbsp; HyClone</td><td>SH31088.01</td><td></td></tr><tr><td>NeuroBasalmedium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements, ver 5.42</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselsserum</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>17000121</td><td>rekonstituieren mit 10 mL sterilem ddH2O, lagern bei 4 > C für bis zu zwei Wochen</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 20%</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15713S</td><td>verdünnt mit PBS</td></tr><tr><td>PBST, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28352</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta; Antikörper</td><td>R& D</td><td>AF385</td><td>Verdünnungsverhältnis: 1:400</td></tr><tr><td>Polyamin-Supplement (1000x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Rapiclear Clearing-Reagenz, 1,49</td><td>SUNJIN LAB</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (7,5%)</td><td>Gibco</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat-Monohydrat</td><td>Thermofisher</td><td>J6228822</td> mit <td>ddH2O für 1% (wt/v) Stammlösung auflösen</td></tr><tr><td>TBST, 20x</td><td>Thermofisher</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>trans-ISRIB</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5284/10</td><td>stellen die Stammlösung bei 1 mM mit DMSO her und lagern bei -20°; C für bis zu 1 Jahr.</td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>ProSpec</td><td>CYT-116</td><td>rekonstituieren mit sterilem ddH2O in einer Konzentration von 100 ng/&micro; L, aliquot und bei -20° lagern; C</td></tr></tbody></table>

generierung von gefäßorganoiden aus humaninduzierten pluripotenten stammzellen

Vascular Organoid Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Abbildung 1A zeigt das Schema dieses Protokolls, einschließlich der Schlüsselkomponenten, die in jeder Phase verwendet werden. Die Differenzierung begann mit der EB-Bildung, gefolgt von der Mesoderminduktion und der Spezifizierung der Gefäßlinie (Abbildung 1B-D). Die Aggregate wurden im Laufe der Zeit größer und weniger kugelförmig. Organoide zeigten ab Tag 5 Ecken und Kanten. Nach der Eingebettetheit in das Kollagen-I-Basalmembran-Matrix-Gemisch keimten vaskuläre Endothelzellen und Perizyten und wuchsen bereits am 7. Tag zu komplexen Gefäßnetzwerken heraus (Abbildung 1E). Da der Hauptzweck dieser modifizierten Methode darin besteht, die Schwankungen zwischen verschiedenen Generationschargen zu minimieren, haben wir die EB-Größe von zwei unabhängigen Chargen gemessen, und sowohl die Größenmessungen als auch die statistische Analyse bestätigten die Konsistenz und Gleichmäßigkeit dieser Methode (Abbildung 1F).
Um die vaskuläre Differenzierung zu validieren, wurden Organoide an Tag 5 vor der Einbettung entnommen und mit vaskulären Markern wie CD31, ERG1 und PDGFRβ gefärbt. Die Organoide exprimierten CD31, ERG1 und PDGFRβ (Abbildung 2), was auf das Vorhandensein von vaskulären Endothelzellen und Perizyten hinweist.
Nach der Gewebereinigung wurden die Gefäßnetzwerke mit einer Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert (Abbildung 3A). Reife Organoide wurden an Tag 17 (Abbildung 3B, Probe im Gelblock) und Tag 28 (Abbildung 3C, die Probe wurde aus dem Gelblock entnommen und einzeln in einer 96-Well-Platte kultiviert) mit CD31, ERG1 und PDGFRβ gefärbt; beachten Sie, dass das Gefäßnetzwerk an den Rändern die Sphäroide umhüllte, anstatt sich nach der Entnahme aus dem Gelblock radial auszudehnen).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig01.jpg"> Abbildung 1: Erzeugung von Gefäßorganoiden. (A) Schema der Schritte und Zeitleiste für die Erzeugung von Gefäßorganoiden. (B-E) Repräsentative Hellfeldbilder von vaskulären Organoiden in verschiedenen Stadien. Maßstabsstäbe: 100 μm. (F) Statistische Analyse in EB-Größe von zwei verschiedenen EB-Erzeugungschargen unter Verwendung der in dieser Arbeit vorgestellten Mikrotitermethode. Für die EB-Generierung wurden 1.000 Zellen pro Mikrotiter verwendet, für die Chargen 1 und 2 n = 42 bzw. n = 40. Signifikanz wird als ns dargestellt, nicht signifikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig02.jpg"> Abbildung 2: Immunfärbung von vaskulären Organoiden vor der Geleinbettung. Repräsentative Fluoreszenzbilder von Organoiden, die mit den Endothelmarkern (A) CD31 (grün) und (B) ERG1 (grün) bzw. (C) dem Perizytenmarker PDGFRβ (grün) gefärbt wurden. Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Maßstabsstäbe: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig03.jpg"> Abbildung 3: Immunfluoreszierende Charakterisierungen des Gefäßnetzwerks in vaskulären Organoiden. (A) Ein repräsentatives Bild zeigt in Gel eingebettete Gefäßorganoide in der Glasschale nach der Gewebereinigung. Die Organoide waren transparent, aber unter einem 385 nm UV-Licht sichtbar. (B) Ein repräsentatives 3D-Whole-Mount-Bild eines Gefäßorganoids an Tag 17. Das Gefäßorganoid wurde mit DAPI (blau), dem vaskulären Endothelzellmarker CD31 (grün) und dem Perizytenmarker PDGFRβ (magenta) gefärbt. (C) Eine repräsentative 3D-Bildgebung eines entnommenen Gefäßorganoids an Tag 28, gefärbt mit den Endothelmarkern CD31 (rot) und ERG1 (grün). Maßstabsbalken: 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>hiPSC Expansionsmedium</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr><tr><td>mTeSR Plus Basalmedium</td>
			<td>400 mL</td>
		</tr><tr><td>mTeSR Plus Ergänzung</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Zusammensetzung des hiPSC-Expansionsmediums.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>hiPSC-Sämedium</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr><tr><td>PSC-Expansionsmedium</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr><tr><td>Chroman 1 (100 μM)</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Emricasan (1 mM)</td>
			<td>30 μL</td>
		</tr><tr><td>Polyamin-Ergänzung (1000x)</td>
			<td>ca. 20 μl</td>
		</tr><tr><td>trans-ISRIB (1 mM)</td>
			<td>14 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Zusammensetzung des hiPSC-Saatmediums.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>N2B27 mittel</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX Ergänzung</td>
			<td>48,6 mL</td>
		</tr><tr><td>NeuroBasales Medium</td>
			<td>48,6 mL</td>
		</tr><tr><td>GlutaMAX Ergänzung (100x)</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA, 100x)</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (1000x)</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr><tr><td>N2-Zuschlag (100x)</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>B27 Supplement minus Vitamin A (50x)</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr><tr><td>Heparin, 4 kU/ml</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Zusammensetzung des N2B27-Mediums.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mesoderm-Induktionsmedium (MIM)</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>N2B27 mittel</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>BMP4 (100 ng/μL)</td>
			<td>0,9 μl</td>
		</tr><tr><td>CHIR99021 (12 mM)</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 4: Zusammensetzung des Mesoderm-Induktionsmediums (MIM).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Gefäßdifferenzierungsmedium 1 (VDM1)</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>N2B27 mittel</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr><tr><td>Forsklin (12 mM)</td>
			<td>0,5 μl</td>
		</tr><tr><td>VEGFA (100 ng/μL)</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 5: Zusammensetzung des vaskulären Differenzierungsmediums 1 (VDM1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Kollagen I Mischung</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Kollagen I (3,61 g/ml)</td>
			<td>2,77 mL</td>
		</tr><tr><td>10x DMEM/F12 mittel</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>Natriumbicarbonat, 7,5 %</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>HEPES, 1 M</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>0,73 mL</td>
		</tr><tr><td>NaOH, 1M</td>
			<td>75 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 6: Zusammensetzung der Kollagen-I-Mischung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Kollagen I - Basalmembran-Matrix-Gemisch</td>
			<td>6,5 mL</td>
		</tr><tr><td>Collage I Mischung</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Matrigel (10 mg/ml)</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 7: Zusammensetzung des Kollagen-I-Basalmembran-Matrix-Gemisches.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Gefäßdifferenzierungsmedium 2 (VDM2)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX™ Ergänzung</td>
			<td>3,67 mL</td>
		</tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA, 100X)</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (1000x)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Heparin, 4 kU/ml</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Knockout-Serum-Ersatz</td>
			<td>0,75 mL</td>
		</tr><tr><td>FBS</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>VEGFA (100 ng/μL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>FGF2 (100 ng/μL)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 8: Zusammensetzung des vaskulären Differenzierungsmediums 2 (VDM2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Blockieren des Puffers</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>Esel-Serum</td>
			<td>2,5 mL</td>
		</tr><tr><td>Tween 20</td>
			<td>0,25 mL</td>
		</tr><tr><td>Triton X-100</td>
			<td>0,25 mL</td>
		</tr><tr><td>Natriumdesoxycholatlösung (1 Gew.-%, wt/v)</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>46,5 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 9: Zusammensetzung des Blockierungspuffers für die Immunfärbung.

Generierung von Gefäßorganoiden aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Vascular organoids derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) recapitulate the cell type diversity and complex architecture of human ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Das Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung menschlicher Gehirnorganoide aus induzierten pluripotenten Stammzellen. Es wird gezeigt, wie die Neurosphäre eine neuroektodermale Schicht bildet, die die Bildung anderer Keimblätter unterdrückt. Die Neurosphären sind in eine 3D-Gelmatrix eingebettet und bilden neuroepitheliale Knospen. Wenn diese neuroepithelialen Knospen mit Organoidmedien inkubiert werden, differenzieren sie sich in spezifische Hirnregionen, was zur Bildung reifer...

Eine In-vitro-Methode zur Erzeugung von Organoiden des menschlichen Gehirns

Dieses Video skizziert die Herstellung von Organoiden vom Vorderhirntyp aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) und demonstriert die Entwicklung von Stammzellaggregaten zu komplexen Strukturen, die die Hirnrinde nachahmen und sich in verschiedene Neuronentypen differenzieren.

Generierung von zerebralen Organoiden vom Vorderhirntyp aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Zerebrale Organellen repräsentieren eine neue Modellsystem, frühe menschliche Gehirn Entwicklung in Vitrozu untersuchen. Dieser Artikel enthält die detaillierte Methodik um homogene dorsalen Vorderhirn-Typ Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen einschließlich kritische Charakterisierung und Validierung Schritte effizient zu generieren.

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll wurde als Mittel zur Herstellung von Gehirnorganoiden in einer vereinfachten, kostengünstigen Weise ohne exogene Wachstumsfaktoren oder Kellermembranmatrix unter Beibehaltung der Vielfalt der Gehirnzelltypen und vieler Merkmale der zellulären Organisation erzeugt.

Eine statische selbstgesteuerte Methode zur Generierung von Hirnorganoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Hirnorganoiden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). Um Gehirnorganoide in großen Mengen und von hoher Qualität zu erhalten, verwenden wir hausgemachte Mini-Bioreaktoren.

Gehirnorganoid-Erzeugung aus induzierten pluripotenten Stammzellen in hausgemachten Mini-Bioreaktoren

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur effizienten Herstellung entwicklungsrelevanter menschlicher Herzorganoide (hHOs) unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen durch Selbstorganisation. Das Protokoll beruht auf der sequentiellen Aktivierung von Entwicklungshinweisen und produziert hochkomplexes, funktionell relevantes menschliches Herzgewebe.

Erzeugung von selbstorganisierenden menschlichen Herzorganoiden aus pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von selbstorganisierenden Blutgefäßen aus humanen pluripotenten und induzierten pluripotenten Stammzellen. Diese Blutgefäßnetzwerke weisen ein ausgedehntes und verbundenes Endothelnetzwerk auf, das von Perizyten, Aktin der glatten Muskulatur und einer durchgehenden Basalmembran umgeben ist.

Erzeugung menschlicher Blutgefäß-Organoide aus pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von schnellen und reproduzierbaren endodermalen Leberorganoiden (eHEPOs). Mit diesem Protokoll können eHEPOs innerhalb von 2 Wochen hergestellt werden und langfristig (mehr als 1 Jahr) expandieren, ohne ihre Differenzierung und Funktionalität zu verlieren.

Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Dieses Protokoll stellt eine umfassende und effiziente Methode zur Herstellung von Nierenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung von Suspensionskulturbedingungen dar. Das Hauptaugenmerk dieser Studie liegt auf der Bestimmung der anfänglichen Zelldichte und der WNT-Agonistenkonzentration, was Forschern, die sich für die Erforschung von Nierenorganoiden interessieren, zugute kommt.

Erzeugung von Nierenorganoiden in Suspension aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung, Expansion und in-vivo-Bildgebung von NK-Zellen aus hES-und iPS-Zellen abgeleitet.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

Erfahren Sie eine skalierbare Methode zur Erzeugung homogener Gefäßorganoiden aus humanen iPSCs mit ROCK-Inhibitoren und Mikrowell-Confinement. Diese Technik verbessert die Reproduzierbarkeit und ermöglicht morphologische Analysen sowie Krankheitsmodellierungen.

Generierung von Gefäßorganoiden aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

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