Extraktion und Nachweis von Geosmin und 2-Methylisoborneol in Wasser und Fischen mit Hilfe von sorptiven Extraktionssonden mit hoher Kapazität und GC-MS

[Erzähler] In diesem Video demonstrieren wir den Prozess zur Extraktion und Detektion von Geosmin und 2-Methylisoborneol aus Wasser- und Fischproben unter Verwendung von sorptiven Extraktionssonden mit hoher Kapazität und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS). Geosmin und 2-Methylisoborneol sind flüchtige organische Verbindungen mikrobiellen Ursprungs, die in Bächen, Teichen, Brunnen oder sogar rezirkulierenden Aquakultursystemen vorkommen. Diese Geruchsstoffe können dem Wasser und den darin gezüchteten Fischen bereits in extrem niedrigen Konzentrationen unangenehme Gerüche und Aromen verleihen. Hier sehen wir einen Wissenschaftler, der Wasser aus einer zirkulierenden Aquakulturanlage sammelt. Geosmin- und 2-Methylisoborneol-Wasserproben werden in Braunglasfläschchen gesammelt, die für VOCs eingestuft sind, ohne dass sich Luft im Fläschchen befindet. Tauchen Sie dazu das Fläschchen unter Wasser und verschließen Sie es so, dass keine Luftblasen zurückbleiben. Wir beginnen mit der Vorbereitung unserer Kalibrierung und internen Standards. Zuerst wird eine als C1 gekennzeichnete Stammlösung hergestellt, indem 10 Mikroliter Geosmin und 2-Methylisoborneol-Lösung in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Liter in einen 100-Milliliter-Messkolben gegeben werden. Füllen Sie den Kolben bis zur Volumenmarkierung mit Methanol der Klasse LC/MS. Daraus ergibt sich eine Lösung, die jeden Analyten in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Liter enthält. Als nächstes werden Kalibrierstandards hergestellt, indem bestimmte Volumina der C1-Stammlösung in die 100-Milliliter-Messkolben gegeben und das Volumen mit deionisiertem Wasser gefüllt werden. Es ist wichtig, täglich frische Kalibrierstandards vorzubereiten, da diese Lösungen extrem verderblich sind. Für die internen Standards stellen Sie die Stammlösung I1 her, indem Sie 10 Mikroliter 2-Isopropyl-3-methoxypyrazin, auch bekannt als IPMP, in einen mit LC/MS-Methanol gefüllten Ein-Liter-Messkolben geben, wodurch eine Stammlösung von 10 Milligramm pro Liter entsteht. Dann wird eine zweite Lösung I2 hergestellt, indem man hundert Mikroliter der I1-Stammlösung in einen Hundert-Milliliter-Messkolben gibt und mit deionisiertem Wasser füllt, um eine Konzentration von 10 Mikrogramm pro Liter zu erreichen. Beginnen Sie damit, eine 20-Milliliter-Wasserprobe in das Probentablett zu geben. Wiegen Sie 2,5 Gramm Natriumchlorid ab und geben Sie es in jedes Probengefäß. Die Zugabe von Salz verbessert die Übertragung von Geosmin und MIB aus dem Wasser in den Kopfraum. Geben Sie fünf Milliliter der Wasserprobe in jedes Fläschchen und versetzen Sie sie mit 50 Mikrolitern der internen Standardlösung I2. Verschließen und verschließen Sie jedes Fläschchen sofort nach der Vorbereitung, um den Analytverlust zu minimieren. Der nächste Schritt ist die Analytextraktion. Setzen Sie das Probentablett in den Autosampler-Tabletthalter ein und bereiten Sie die Instrumentenmethode mit den folgenden Tasteneinstellungen vor: Rührzeit vor der Probenahme bei 10 Minuten. Parameter für die Probenahme: 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Option Wash HiSorb Sonde aktiviert ist, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu verhindern. Sondendesorption: 15 Minuten auf 270 Grad Celsius einstellen. Siphon-Einstellungen: Eine Trap-Load-Temperatur von 25 Grad Celsius und eine geteilte Durchflussrate von acht Millilitern pro Minute. Sobald diese Einstellungen vorgenommen sind, starten Sie den Autosampler in Verbindung mit der GC-MS-Methode für die Analyse von Wasserproben. Legen Sie für die Analyse des Fischgewebes ein 20-Milliliter-Fläschchen pro Fischprobe in das Tablett. Homogenisieren Sie das Fischgewebe mit einer Küchenmaschine und wiegen Sie ein Gramm des homogenisierten Gewebes in jedes Fläschchen. Es werden fünf Milliliter einer gesättigten Natriumchloridlösung zugegeben und jede Probe mit 100 Mikrolitern der internen Standardlösung I2 aufgespießt. Verschließen und verschließen Sie jedes Fläschchen sofort. Die Extraktionsmethode für Fischproben ist ähnlich wie für Wasser, jedoch mit wesentlichen Unterschieden aufgrund der lipidreichen Natur des Fischgewebes. Zu diesen Unterschieden gehört die Rührzeit vor der Probenahme: Auf 20 Minuten eingestellt. Inkubationstemperatur der Probenahme: 80 Grad Celsius für 30 Minuten bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min. Stellen Sie sicher, dass die Wash HiSorb-Sondenfunktion aktiviert ist. Sobald diese Schritte abgeschlossen sind, führen Sie den Autosampler in Verbindung mit der GC-MS-Methode für die Analyse von Fischproben aus. Die gleichen GC-MS-Parameter gelten sowohl für Wasser- als auch für Fischgewebemethoden. Der GC ist mit fünf MS 30 Meter x 0,25 Millimeter x 0,25 Mikron Säule ausgestattet. Als Trägergas wird ein hochreines Helium mit einer Durchflussmenge von zwei Millilitern pro Minute verwendet. Das Ofenprogramm beginnt mit einer Anfangstemperatur von 60 Grad Celsius, die drei Minuten lang gehalten wird, gefolgt von einer Temperaturrampe von 10 Grad Celsius pro Minute auf 100 Grad Celsius, dann von 20 Grad Celsius pro Minute auf 190 Grad Celsius und von 30 Grad Celsius pro Minute auf 280 Grad Celsius mit einer abschließenden Haltezeit von zwei Minuten. Die Gesamtlaufzeit beträgt ca. 16,5 Minuten. Für die Transferleitung zwischen GC und MS stellen Sie die Temperatur auf 280 Grad Celsius ein, wobei die Ionenquelle auf 250 Grad Celsius und das Vierfache auf 200 Grad Celsius eingestellt wird. Verwenden Sie im MS für den Scan-Modus einen Bereich von 50 bis 350 Masse-zu-Ladung-Verhältnis. Verwenden Sie für die ausgewählte Ionenüberwachung (SIM) die folgenden Ionen zur Quantifizierung und Bestätigung: IPMP, 152 und 137 Masse-zu-Ladungs-Verhältnis. MIB, Masse-Ladungs-Verhältnis von 95 bis 107. Und Geosmin, 112 und 55 Massen-Ladungs-Verhältnis. Überprüfen Sie die Peakauswahl in Ihrer Chromatographie-Software immer manuell, um Fehler zu vermeiden. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für den Nachweis von Geosmin und 2-Methylisoborneol in Wasser- und Fischproben unter Verwendung von sorptiven Extraktionssonden mit hoher Kapazität und GC-MS. Durch sorgfältiges Befolgen dieser Anweisungen können Forscher genaue und zuverlässige Ergebnisse bei der Analyse des Vorhandenseins dieser Verbindungen sicherstellen. Abbildung eins zeigt den Einfluss der Desorptionstemperatur der Sonde auf die Verschleppung. Ein Laborstandard, der Geosmin und 2-Methylisoborneol in einer Menge von 20 Nanogramm pro Liter enthielt, wurde bei drei verschiedenen Sondendesorptionstemperaturen analysiert. Panel A zeigt die mittleren Peak-Gebiete für Geosmin und MIB. Jede Sonde wurde anschließend noch zweimal bei der gleichen Anfangstemperatur desorbiert, um die Verschleppung zu beurteilen. Die Ergebnisse für geosmin und MIB sind in den Feldern B bzw. C dargestellt. Der Übertrag wird ausgedrückt als die Peakfläche in Prozent der ursprünglichen Peakfläche. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung über drei Replikate dar. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine höhere Desorptionstemperatur die Verschleppung minimiert, ohne die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen. Abbildung Zwei zeigt einen Vergleich der korrigierten und der unkorrigierten Datenwiederherstellung für analytische Standards bei 15 und 40 Nanogramm pro Liter unter Verwendung von PDMS-Sonden für die Extraktion. Die Proben wurden unter Verwendung von 2-Isopropyl-3-methoxypyrazin (IPMP) als internem Standard korrigiert. Ohne Korrektur war die Wiederfindung signifikant geringer, wobei die Korrekturen bei etwa 60 % der bekannten Spitzenwerte lagen. Nach der Korrektur lag die Wiederfindung bei nahezu 100 %, was zeigt, wie wichtig es ist, interne Standards für eine genaue Quantifizierung zu verwenden. Abbildung drei vergleicht die Rückgewinnungsdaten für Geosmin auf der linken Seite und 2-Methylisoborneol auf der rechten Seite mit 15 Nanogramm pro Liter unter Verwendung von zwei Arten von Sonden: reine PDMS- und Dreiphasensonden, die PDMS, Divinylbenzol und Kohlenstoff mit breitem Bereich umfassen. Beide Sondentypen zeigen eine gute Leistung, obwohl reine PDMS-Sonden etwas bessere Wiederherstellungsraten aufwiesen. Angesichts dieses Ergebnisses und der Kosteneinsparungen wurden zukünftige Analysen mit reinen PDMS-Sonden durchgeführt. Abbildung 4 zeigt die lineare Regression der Kalibrierkurven für geosmin und MIB. Der durchgezogene Bereich stellt Geosmin mit einem R-Quadrat-Wert von 0,9999 dar, und die gestrichelte Linie stellt MIB dar, ebenfalls mit einem R-Quadrat-Wert von 0,9999. Beide Kurven weisen eine hervorragende Linearität bei minimalem Fehler auf und validieren die quantitative Genauigkeit der Methode über den getesteten Konzentrationsbereich. Abbildung 5 zeigt die Konzentrationen von Geosmin und 2-Methylisoborneol in Wasserproben, die aus sieben verschiedenen Aquakultursystemen entnommen wurden. Feld A zeigt die Geosmin-Konzentrationen und Feld B zeigt die MIB-Konzentrationen. Jedes System hatte mindestens drei Replikate, und in den meisten Fällen lagen die Konzentrationen dieser Verbindungen über den Nachweisgrenzen der Methode. Ein System, das als System eins gekennzeichnet war, überschritt die menschliche Geruchsschwelle für Geosmin, was auf ein potenzielles Problem mit der Wasserqualität in diesem System hinweist. Abbildung 6 zeigt Daten von zwei Fischproben, die mit F1 und F2 markiert sind und mit Geosmin und 2-Methylisoborneol versetzt wurden. Beide Verbindungen wurden in dreifacher Ausfertigung analysiert, um die Wiederfindung und Präzision zu bestimmen. Die Konzentrationen von Geosmin und MIB sowie die mit Stacheln versehenen Fischproben sind aufgetragen und zeigen die Fähigkeit der Methode, diese Verbindungen auch in lipidreichem Fischgewebe genau nachzuweisen. Die heute vorgestellten Methoden bieten einen robusten Rahmen für den sensitiven Nachweis von Geosmin und 2-Methylisoborneol. Durch die Integration von sorptiven Extraktionssonden mit hoher Kapazität und präziser GC-MS-Analyse haben wir eine Technik demonstriert, die unsere Nachweisfähigkeiten erheblich verbessert. Diese methodische Weiterentwicklung verbessert nicht nur den Durchsatz, sondern reduziert auch das Risiko menschlicher Fehler und erhöht die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Wenn wir diese Techniken weiter verfeinern, werden sie zweifellos zu unverzichtbaren Instrumenten im Bereich der Umweltüberwachung und der Bewertung der Lebensmittelqualität.