Name: Optogenetische Aktivierung von intrinsischen kardialen autonomen Neuronen in exzidierten perfundierten Mausherzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T12:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie die optogenetische Aktivierung intrinsischer kardialer Neuronen in perfundierten Mausherzen. Diese Methode untersucht die Kinetik autonomer Neuronenaktivierung und die Wechselwirkung zwischen cholinergen und katecholaminergen Systemen.

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Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der George Washington University genehmigt und folgten dem Leitfaden des National Institute of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Konstruktion der Mikro-LED-Lichtquelle
<ol>
	<li>Löten Sie unter einem Präpariermikroskop in einem gut belüfteten Bereich die abisolierten Enden von zwei isolierten Kupferdrähten mit einer Länge von mindestens 20 cm an die Kontaktpunkte einer 465-nm-Mikro-LED (Abbildung 1). Testen Sie das Löten, indem Sie die LED an eine Stromquelle anschließen und einschalten.</li>
	<li>Schneiden Sie die unteren 1 cm einer gefilterten Pipettenspitze mit 200 μl ab. Schieben Sie den Filter mit einer Stange mit kleinem Durchmesser heraus. Setzen Sie die Micro-LED mit Drähten so in die Pipettenspitze ein, dass die LED bündig mit dem Ende der Spitze abschließt. Setzen Sie den Filter oben an der Pipettenspitze wieder ein, um die LED und die Drähte an Ort und Stelle zu halten, und kleben Sie dann die Ränder der LED mit Sekundenkleber an die Pipettenspitze. Lass den Sekundenkleber trocknen.</li>
	<li>Bereiten Sie das Silikonelastomer vor, indem Sie die Basis und das Härter im Verhältnis 10:1 kombinieren und gut mischen. Entfernen Sie alle Blasen aus der Mischung mit einer Vakuumkammer oder durch Zentrifugieren.</li>
	<li>Nehmen Sie ein 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen und ritzen Sie die Seiten ein, um das Entfernen der LED zu erleichtern (auf Wunsch kann hier auch Schmiermittel in die Innenseite des Röhrchens gegeben werden). Kleben Sie die Außenseite des Schlauchs ab, um sicherzustellen, dass kein Auslaufen entsteht. Gießen Sie ca. 0,2 ml der Silikonelastomermischung in das Röhrchen und setzen Sie dann die Mikro-LED-Pipettenspitze in das Röhrchen ein, wobei Sie mindestens 1 mm Abstand zwischen der LED und dem Boden des Röhrchens lassen. Wenn sich Blasen gebildet haben, klopfen Sie das Zentrifugenröhrchen auf eine harte Oberfläche, um sie zu lösen. HINWEIS: Die Pipettenspitze kann präventiv mit Silikonelastomer beschichtet werden, um die Blasenbildung beim Platzieren der LED zu reduzieren.</li>
	<li>Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen micro-LED aufrecht in einen 50 °C heißen Laborofen oder Inkubator und lassen Sie es mindestens 8 h oder über Nacht stehen. Tragen Sie hitzebeständige Handschuhe, wenn Sie mit dem Ofen interagieren. Sobald das Elastomer ausgehärtet ist, entfernen Sie die LED aus dem Zentrifugenröhrchen. Wenn das Elastomer noch klebrig ist, legen Sie es wieder in den Ofen.</li>
	<li>Entfernen Sie nach dem vollständigen Aushärten überschüssiges Elastomer mit einem Präzisionsmesser von der Spitze der LED, so dass nicht mehr als 1 mm übrig bleibt. Die richtige Verkapselung der LED minimiert die Erwärmung des Gewebes während der Photostimulation.</li>
	<li>Bestimmen Sie die optische Leistung der LED mit einem optischen Leistungsmesser. Schalten Sie das Leistungsmessgerät ein und passen Sie die Wellenlängeneinstellungen so an, dass 465 nm angezeigt werden. Platzieren Sie die LED in einer Linie mit einem Fotodioden-Leistungssensor und schalten Sie die LED mit dem Funktionsgenerator ein. Der optische Leistungsmesser liefert einen Messwert in Watt. Berechnen Sie die Bestrahlungsstärke, indem Sie den Messwert durch die Fläche der beleuchteten Fläche (0,88 mm2) dividieren. HINWEIS: Die ideale Bestrahlungsstärke sollte ca. 2,4 mW/mm2 betragen, um ChR211 angemessen zu aktivieren.</li>
</ol>
2. Experimentelle Vorbereitung
<ol>
	<li>Züchten Sie Mäuse in Übereinstimmung mit früheren Veröffentlichungen, um ChR2 entweder in cholinergen Neuronen (ChAT-ChR2) oder katecholaminergen Neuronen (TH-ChR2) zu exprimieren12 (Abbildung 2). Bestätigung der Expression von TH-Cre oder ChAT-Cre bei Mäusen, die für Experimente verwendet wurden, unter Verwendung eines Genotypisierungsansatzes, wie zuvor beschrieben12.</li>
	<li>Bereiten Sie mindestens 225 ml Krebs-Henseleit (KH)-Lösung vor (in mM: 118 NaCl, 4,7 KCl, 1,25 CaCl2, 0,57 MgSO4, 25 NaHCO3, 1,17 KH2PO4, 6 Glukose) und filtrieren Sie mit einem 0,2 μm Zellulosenitrat-Membranfilter. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, wenn er mit 95 %O 2 und 5 % CO2 angereichert ist.</li>
	<li>Spülen Sie das Langendorff-Perfusionssystem vor dem Experiment mit gereinigtem Wasser und entfernen Sie überschüssiges Wasser, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.</li>
	<li>Fügen Sie dem System einen 10-μm-Membranfilter hinzu, bevor KH zirkuliert. Schalten Sie die Wasserbäder ein, die so eingestellt sind, dass die Perfusattemperatur bei 37 °C bei Durchflussraten zwischen 2-5 mL/min gehalten wird.</li>
	<li>Geben Sie 175 mL KH in das Perfusionssystem und beginnen Sie mit der Durchblutung. Blasen Sie die Lösung mit 95 % O2 / 5 % CO2 , um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. HINWEIS: Das zirkulierende KH-Volumen variiert von System zu System, abhängig von den Schlauch- und Behältergrößen.</li>
	<li>Kalibrieren Sie den Durchflussmesser, indem Sie den Durchfluss durch das Perfusionssystem mit einem Absperrhahn stoppen und die Nulltaste am Durchflussmesser drücken.</li>
	<li>Bereiten Sie eine physiologische Datenerfassungssoftware wie LabChart mit 12 Kanälen vor: Herzbadtemperatur, Aortenperfusattemperatur, EKG-Ableitungen I-III plus vier zusätzliche berechnete Ableitungen, Herzfrequenzberechnung, Flussrate und Funktionsgeneratorausgang zur Verfolgung von LED-Impulsen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Herzfrequenz in LabChart unter Verwendung des für die Herzfrequenz reservierten Kanals mit der Funktion für zyklische Messungen zur Erkennung des Maus-EKGs auf Ableitung I. Die Herzachsenerweiterung von LabChart verwendet Ableitung I und Ableitung II, um Ableitung III, aVR, aVL und aVF zu berechnen.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Micro-LED-Bauweise. Vereinfachte Übersicht über die Schritte zum Bau einer Micro-LED-Lichtquelle. Zwei Drähte werden an die Mikro-LED gelötet und in eine 200 μL Pipettenspitze gesteckt und dann mit Sekundenkleber versehen (Schritt 1). Silikonelastomer wird im Verhältnis 10:1 gemischt und in eine Vakuumkammer gegeben, um Blasen zu entfernen (Schritt 2). Das Silikonelastomer wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegossen, die Mikro-LED-Pipettenspitze wird eingeführt und über Nacht aushärten gelassen (Schritt 3). Anschließend wird die isolierte Mikro-LED aus der Röhre entfernt und überschüssiges Silikon sollte abgeschnitten werden (Schritt 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Transgenes Mauszuchtschema. Eine Elternmaus mit dem lox-abhängigen ChR2-Gen wird mit einer anderen Maus mit einem Cre-Promotor gekreuzt. Eine Elternmaus mit Tyrosinhydroxylase (TH) Cre-Promotor produziert heterozygote Nachkommen, bei denen 50% ChR2 in katecholaminergen Zellen exprimieren. Eine Elternmaus mit Cholin-Acetyltransferase (ChAT) Cre-Promotor wird homozygote Nachkommen produzieren, bei denen 100% ChR2 in cholinergen Zellen exprimieren. Die Expression wird durch Genotypisierung bestätigt. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von12 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
3. Exzision und Perfusion des Herzens
<ol>
	<li>Vor der Exzision verabreichen Sie 250 Einheiten Heparin (ca. 8 U/g) durch intraperitoneale Injektion mit einer 1-ml-Spritze. Warten Sie mindestens 10 Minuten, bevor Sie operiert werden.</li>
	<li>Legen Sie eine erwachsene Maus in eine Anästhesie-Induktionskammer. Verabreichen Sie ~4% Isofluran und warten Sie, bis sich die Atmungsfrequenz verlangsamt und vertieft. Nehmen Sie die Maus aus der Kammer und überprüfen Sie die Beendigung des Schmerzreflexes durch Zusammenkneifen der Zehen, bevor Sie eine Gebärmutterhalsluxation durchführen.</li>
	<li>Halten Sie den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette fest und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere in die Bauchhöhle. Öffnen Sie die Brusthöhle, indem Sie vorsichtig durch das Zwerchfell schneiden. Schneiden Sie durch die Rippen, um Herz und Lunge freizulegen. Fassen Sie vorsichtig die Lunge und entfernen Sie das Herz und die Lunge.</li>
	<li>Legen Sie das Herz in eine Schüssel mit heparinisiertem KH. Entferne die Lunge und alle großen Fettstücke. Legen Sie das gereinigte Herz in eine 2. Schale mit heparinisiertem KH unter ein Präpariermikroskop mit 2-facher Vergrößerung. Lokalisieren Sie die Aorta und schieben Sie sie mit einer feinen Pinzette über die Kanüle. Befestigen Sie das Herz mit einer 4-0-Seidennaht an einer Kanüle. HINWEIS: Die Kanülierung kann auf Eis erfolgen, um die Stoffwechselaktivität des Herzens zu reduzieren.</li>
	<li>Spülen Sie eine Bolusinjektion von heparinisiertem KH durch die Kanüle, um Blut aus den Herzkranzgefäßen zu entfernen, bevor es auf das Perfusionssystem gelegt wird.</li>
	<li>Verbinden Sie das kanülierte Herz mit dem Perfusionssystem und legen Sie es in die mit Perfusat gefüllte PDMS-Schale. Legen Sie die EKG-Nadelelektroden entsprechend dem Einthovenschen Dreieck13 in die PDMS-Schale. Akklimatisieren Sie das Herz für mindestens 5 Minuten.</li>
	<li>Drehen Sie das Herz so, dass der linke Vorhof zugänglich ist, und schneiden Sie mit einer selbstöffnenden Mikroschere ein ~1 mm Loch in den linken Vorhof. Führen Sie einen Schlauch mit einem Durchmesser von 1 mm durch diese Scheibe in den linken Ventrikel ein, um das dort eingeschlossene Perfusat freizusetzen. HINWEIS: Ein Präpariermikroskop zum Betrachten des Herzens kann diesen Schritt erleichtern.</li>
	<li>Drehen Sie das Herz so, dass die RA nach oben zeigt und der Sinusknoten (SA) für die Beleuchtung zugänglich ist (Abbildung 3).</li>
	<li>Passen Sie die EKG-Elektroden nach Bedarf an, indem Sie die Elektroden näher an das Herz bringen oder sie in Perfusat tauchen, um die Signale mit einem geeigneten Signal-Rausch-Verhältnis zu empfangen. Die Einstellungen können je nach verwendeter Hardware und Software für die EKG-Erfassung variieren. Bei diesem Verfahren wurde ein Einthoven Goldberger-Modul mit einer Verstärkung von 2000 und einem 500-Hz-Cut-Off-Filter verwendet, und die Softwareeinstellungen umfassten einen Netzfilter und eine Abtastfrequenz von 1000 Hz.</li>
</ol>
4. Optogenetische Aktivierung
<ol>
	<li>Schließen Sie das Micro-LED-Gerät an ein Funktionsaggregat an, um Pulswellen mit folgenden Parametern zu erzeugen: 10 Hz Frequenz, 30 ms Pulsbreite, 10 Vpp Amplitude.</li>
	<li>Platzieren Sie die Micro-LED vorsichtig auf dem SA-Knoten. Vermeiden Sie es, mit der Micro-LED zu stark zu drücken, da dies zu einer Verringerung der Herzfrequenz und der Funktion führen kann.</li>
	<li>Schalten Sie den Funktionsgenerator ein und messen Sie die Veränderungen der Herzfrequenz durch die Photostimulation. Sofortige Veränderungen der Herzfrequenz deuten auf eine effektive Aktivierung hin. Die katecholaminerge Aktivierung führt zu einem exponentiellen Anstieg der Herzfrequenz10, während die cholinerge Aktivierung zu einem sofortigen Abfall führt8.</li>
	<li>Schalten Sie den Funktionsgenerator aus. Lassen Sie die Herzfrequenz auf das Niveau vor der Aktivierung zurückkehren.</li>
	<li>Wenn die optogenetische Aktivierung zu einer Änderung der Herzfrequenz von weniger als 100 Schlägen pro Minute führt, positionieren Sie die Mikro-LED neu, um die Neuronen der RA besser zu beleuchten. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf.</li>
</ol>
5. Experimentelles Vorgehen und Datenanalyse
<ol>
	<li>Um die Hypothese zu testen, dass die intrinsische optogenetische cholinerge Stimulation die exogene beta-adrenerge Aktivierung durch Noradrenalin (NE) unterdrücken kann, werden 10 μM und 100 μM Stammlösungen von NE in einem Rauchfutter hergestellt.</li>
	<li>Geben Sie eine Bolusdosis NE durch eine Injektionsöffnung in das Perfusionssystem. Sobald der Anstieg der Herzfrequenz ein Plateau erreicht hat, schalten Sie die Micro-LED für ~10 s ein. Schalten Sie das Licht aus und überwachen Sie Änderungen der Herzfrequenz.</li>
	<li>Nachdem die Herzfrequenz wieder in den Sinusrhythmus zurückgekehrt ist, erhöhen Sie die Dosis von NE und wiederholen Sie die optogenetische Stimulation. Fahren Sie mit jeder Dosis NE fort.</li>
	<li>Schalten Sie am Ende der Studie die Gaszufuhr aus, entfernen Sie das Herz aus dem System und bewahren Sie es bei Bedarf in einem Fixiermittel auf.</li>
	<li>Spülen Sie die Reservoire und Schläuche des Perfusionssystems nach Bedarf mit DI-Wasser oder Reinigungsmittel aus. Trocknen Sie das System gründlich ab, um Schimmel zu vermeiden.</li>
	<li>Speichern Sie die LabChart-Datei. Exportieren Sie das Herzfrequenzsignal und die EKG-Kanäle für die Offline-Analyse und grafische Darstellung.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Konfiguration des Maus-Herzbades. Ein kanüliertes Mausherz zeigt die Platzierung des LED-Geräts und der EKG-Elektroden. Eine Gehäusemasse ist vorhanden, um Geräusche von der umgebenden Elektronik zu reduzieren. EKG-Nadelelektroden werden in Anlehnung an das Einthoven-Dreieck platziert. Abkürzungen: LA = linker Arm; RA = rechter Arm; LL = linkes Bein; G = Masse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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<li>Asfour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+fluorescence+imaging+of+isolated+biventricular+working+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts.</a> J Vis Exp. (65), e4115(2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>#3c Pinzette (x2)</td><td>Dumont</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Zellulosenitrat-Membranfilter</td><td>Whatman</td><td>7182-004</td><td>Zur Filtration KH</td></tr><tr><td>0,5 ml, Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-200269</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; m Nukleporen-Membranfilter</td><td>Whatman</td><td>111115</td><td>Für Systemfilter</td></tr><tr><td>Analoger Inkubator&nbsp;</td><td>Qunicy Labs</td><td>12-140</td><td></td></tr><tr><td>Aortenkanüle</td><td>Harvard-Gerät&nbsp;</td><td>73-2798</td><td></td></tr><tr><td>Arbiträrer Funktionsgenerator</td><td>Tektronix</td><td>AFG3021B</td><td></td></tr><tr><td>Geflochtene Seidennaht 4-0</td><td>Chirurgische Spezialitäten Look</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Gebogener Hämostat</td><td>Ted Pella</td><td>53065</td><td></td></tr><tr><td>Einthoven Goldberger Modul</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-1778</td><td></td></tr><tr><td>Flexibler Silikondraht 30AWG</td><td>BNTECHGO</td><td>619317716902</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Schwere gebogene Iriszange&nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>OC022R</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-Injektionsmittel</td><td></td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>Irisschere</td><td>Ted Pella</td><td>13215</td><td></td></tr><tr><td>Isofluranlösung</td><td>Covetrus</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8&nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>Datenerfassungssoftware</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodisparierschere</td><td>WPI</td><td>504520</td><td></td></tr><tr><td>Micro-LED</td><td>Dialight</td><td>598-8091-107F</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Leistungsmessgerät</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/35</td><td>ADInstruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Selbstöffnend Präzisionsschere</td><td>Excelta</td><td>366</td><td></td></tr><tr><td>Eintier-Anästhesiegerät</td><td>E-Z Systems</td><td>EZ-108SA</td><td></td></tr><tr><td>Lötstation</td><td>Weller</td><td>WES51</td><td></td></tr><tr><td>SureOne Filter Pipettenspitzen</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-478</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Silikonelastomer Kit</td><td>DOW</td><td>04019862</td><td></td></tr><tr><td>Gewebezange</td><td>Ted Pella</td><td>13220</td><td></td></tr><tr><td>Schlauch-Durchflusssystem</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetische aktivierung von intrinsischen kardialen autonomen neuronen in exzidierten perfundierten mausherzen

Optogenetic Activation of Intrinsic Cardiac Autonomic Neurons in Excised Perfused Mouse Hearts

Ein Langendorff-Perfusionssystem mit konstantem Druck (Abbildung 4) sollte in der Lage sein, die Herzfrequenz der Maus von mindestens 300 Schlägen pro Minute für weit über eine Stunde aufrechtzuerhalten, wenn eine angemessene Sauerstoffversorgung, Temperatur und koronarer Fluss aufrechterhalten werden. Bei diesem Aufbau hängt die Temperatur des Aortenperfusats vom koronaren Fluss ab, so dass die Temperaturen im Wasserbad möglicherweise angepasst werden müssen, wenn sich die Durchflussrate ändert, um die Aortentemperatur bei 37 °C zu halten. Die koronaren Flussraten des Mausherzens liegen in der Regel zwischen 1,5 und 4,5 ml/min, abhängig von der Größe des Herzens. Die Aufrechterhaltung der Perfusattemperatur bei 37 °C bei Flussratenschwankungen ist für eine gleichbleibende Herzfunktion notwendig und besonders wichtig für eine konstante Druckperfusion. Das beschriebene Perfusionssystem ist so ausgelegt, dass es einen hydrostatischen Druck von 70 mmHg über die Höhe der Perfusatsäule aufrechterhält. Dies wird durch eine Pumprate erreicht, die einen gleichmäßigen Überlauf aus dem oberen Behälter gewährleistet. Das Perfusat kann mit 20 μM des Vasodilatators Cromakalin ergänzt werden, um den normalen oder supranormalen Koronarfluss zu verbessern und aufrechtzuerhalten und eine vollständige Sauerstoffversorgung des Myokards zu gewährleisten14.
Die Photostimulation cholinerger Neuronen in ChAT-ChR2-Mausherzen bei 10 Hz und 30 ms Pulsbreite sollte zu einem nahezu sofortigen Abfall der Herzfrequenz führen. Eine effiziente Photostimulation cholinerger Neuronen in ausreichend durchbluteten Herzen sollte zu einer Verringerung der Herzfrequenz um mindestens 100 Schläge pro Minute führen. Abbildung 5 zeigt einen sofortigen Abfall von 75 Schlägen pro Minute beim Einschalten der Mikro-LED, der weiter abnimmt, bis er einen maximalen Abfall von 135 Schlägen pro Minute erreicht. Innerhalb einer halben Sekunde nach dem Ausschalten der Micro-LED steigt die Herzfrequenz auf 175 Schläge pro Minute, bevor sie allmählich auf das Niveau vor der Stimulation zurückkehrt. Es wird ein EKG mit sechs Ableitungen vorgestellt, um die Unterschiede im RR-Intervall vor, während und nach der Stimulation zu veranschaulichen (Abbildung 5B). Die Ableitungen aVR, aVL und aVF werden in der LabChart-Software mit den Ableitungen I und II berechnet.
Die Photostimulation von katecholaminergen Neuronen in TH-ChR2-Mausherzen bewirkt eine allmählichere (exponentielle) Veränderung der Herzfrequenz im Vergleich zur Photostimulation cholinerger Neuronen. Dies wird wahrscheinlich durch die beta1-adrenerge Aktivierung verursacht, die das zweite Botensystem von cAMP aktiviert, das PKA aktiviert, das Zielproteine phosphoryliert, während dies bei der muskarinischen Aktivierung nicht der Fall ist. Abbildung 6 zeigt einen Anstieg der Herzfrequenz um 135 Schläge pro Minute im Verlauf von 10 s. Nach dem Ausschalten des Lichts werden weitere 10 s benötigt, um zum normalen Sinusrhythmus zurückzukehren. Wenn die Mikro-LED nicht richtig isoliert ist, kann sie das Herz erwärmen, was zu einem Anstieg der Herzfrequenz führt. Diese Erwärmungsreaktion ist weniger intensiv als die TH-ChR2-Stimulation; Daher ist die Veränderung der Herzfrequenz weniger ausgeprägt.
Eine Anwendung dieses Protokolls besteht darin, optogenetische Stimulation zur Depolarisierung von Neuronen zu verwenden, was zur Freisetzung endogener Neurotransmitter führt, während gleichzeitig exogene Neurotransmitter zum Perfusat hinzugefügt werden. Abbildung 7A zeigt die endogene Acetylcholinfreisetzung aus einem ChAT-ChR2-Mausherz mit einer Bolusdosis NE, die dem Perfusat zugesetzt wurde. Ohne NE führte die Photostimulation zu einem Abfall der Herzfrequenz um mehr als 100 Schläge pro Minute und hielt diesen Abfall für die Dauer der Stimulation aufrecht. Bei einer hohen Dosis von NE (2000 nM) betrug der maximale Herzfrequenzabfall während der Photostimulation 40 Schläge pro Minute. Die Herzfrequenz begann sofort zu steigen und erreichte fast das Niveau vor der Stimulation, bevor das Licht ausgeschaltet wurde. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die optogenetische Unterdrückung der Herzfrequenz durch die Photostimulation der ChAT-Neuronen nicht in der Lage war, den Anstieg der Herzfrequenz infolge einer hohen Dosis von NE vollständig zu unterdrücken, was zu einer kürzeren Zeit der Herzfrequenzunterdrückung und einer geringeren Abnahme der Herzfrequenz führte (Abbildung 7B). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Arbeiten an Großtieren überein, die eine progressive AV-Knotenblockade bei gleichzeitiger Stimulation des Nervus vagusis und der Sternganglien zeigten12,13.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Versuchsaufbau. Diagramm des Perfusionssystems. Pfeile zeigen die Richtung des Perfusats an. Superfusionsperfusat wird durch gestrichelte Linien angezeigt und Komponenten sind rot umrandet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Repräsentative cholinerge Photostimulationsreaktion. (A) Ein 6-Kanal-EKG während der optogenetischen Aktivierung von ChAT-ChR2. Durchgehende blaue Linien zeigen an, dass die Mikro-LED ein- und ausgeschaltet wird. Rote gestrichelte Felder zeigen die Zeit für (B)-Snippets an. (B) Halbsekunden-Ausschnitte des EKG-Signals vor (a), während (b) und nach der Photostimulation (c). Das RR-Intervall wird für jeden Abschnitt angezeigt. (C) Die Herzfrequenz (oben) wird zusammen mit den Pulswellen eines Funktionsgenerators (unten) angezeigt. Die Herzfrequenz beginnt bei 450 Schlägen pro Minute und sinkt nach 8 s Photostimulation auf 315 Schläge pro Minute, bevor sie 7 s nach Beendigung der Photostimulation wieder auf 410 Schläge pro Minute zurückkehrt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig6.jpg"> 
Abbildung 6: Repräsentative katecholaminerge Photostimulationsreaktion. (A) Ein 6-Kanal-EKG während der optogenetischen Aktivierung von TH-ChR2. Durchgehende blaue Linien zeigen an, dass die Mikro-LED ein- und ausgeschaltet wird. Rote gestrichelte Felder zeigen die Zeit für (B)-Snippets an. (B) Halbsekunden-Ausschnitte des EKG-Signals vor (a), während (b) und nach der Photostimulation (c). Das RR-Intervall wird für jeden Abschnitt angezeigt. (C) Die Herzfrequenz (oben) wird zusammen mit den Pulswellen eines Funktionsgenerators (unten) angezeigt. Die Herzfrequenz beginnt bei 390 Schlägen pro Minute und erreicht nach 10 Sekunden Photostimulation einen Spitzenwert von 525 Schlägen pro Minute, bevor sie 8 Sekunden nach Beendigung der Photostimulation wieder auf 390 Schläge pro Minute zurückkehrt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig7.jpg"> 
Abbildung 7: Cholinerge Photostimulation mit exogenem NE. (A) Herzfrequenzreaktion während der ChAT-ChR2-Photostimulation mit steigenden Dosen von NE zum Perfusat. Sobald die Herzfrequenz einen maximalen Anstieg aufgrund von NE erreichte, wurde die Mikro-LED für ca. 10 s eingeschaltet. Eine Unterdrückung der Herzfrequenz war bei hohen Dosen von NE immer noch möglich, aber die Dauer der Stimulation nahm mit zunehmender Dosis ab. (B) Die Zeit, die die Herzfrequenz unterdrückt blieb. Zeiten, die näher an 10 s lagen, blieben im Allgemeinen für die gesamte Dauer der Stimulation unterdrückt. (C) Der Abfall der Herzfrequenz während der Photostimulation war bei höheren NE-Dosen weniger schwerwiegend als bei niedrigen Dosen. Niedrige Dosen führten zu einer durchschnittlichen Abnahme der Herzfrequenz um 40 %, während höhere Dosen nur um 25 % sanken. Zur Beurteilung der statistischen Signifikanz wurde ein ungepaarter t-Test durchgeführt. Dargestellt als Standardfehler des Mittelwerts * p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Optogenetische Aktivierung von intrinsischen kardialen autonomen Neuronen in exzidierten perfundierten Mausherzen

A balance of cholinergic and catecholaminergic activation is necessary to maintain heart health. Interrogating the interaction between these pathways can ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Dieses Papier beschreibt die Präparation Verfahren, Instrumental-Setup, und experimentellen Bedingungen bei der optischen Abbildung von Transmembranpotential (Vm) und intrazellulären Calcium-Transienten (CAT) in intakten isolierten Langendorff perfundierten Maus Herzen.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

Quelle: Jungen, C., et al. Einfluss intrakardialer Neuronen auf die kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenese in einem ex vivo Langendorff-System. J. Vis. exp. (2018). Das Video zeigt eine ex vivo-Technik zur Stimulation des intrakardialen Nervensystems, um die Anfälligkeit des Herzens für Herzrhythmusstörungen zu beurteilen. Mit Hilfe eines Perfusionsapparaturs wird ein isoliertes Mausherz mit einem sauerstoffhaltigen Puffer perfundiert. Das intrakardiale Nervensystem wird dann mit hoher...

Stimulation des intrakardialen Nervensystems zur Beurteilung der Anfälligkeit für Herzrhythmusstörungen

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Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation der intrakardialen vegetative Nervensystem und die Bewertung ihres Einflusses auf grundlegende Elektrophysiologie, Arrhythmogenesis und Lager Dynamik mit einem ex-Vivo Langendorff Setup.

Auswirkungen der intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis in einem Ex-Vivo -Langendorff-System

Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Untersuchung der Herzdynamik anhand eines translationalen Tiermodells zu etablieren. Der beschriebene experimentelle Ansatz beinhaltet eine duale Emissions-Optokardiographie in Verbindung mit einer elektrophysiologischen Studie zur Beurteilung der elektrischen Aktivität in einem isolierten, intakten Schweineherzmodell.

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Elektromechanische Bewertung der optogenetisch modulierten Kardiomyozytenaktivität

Diese Arbeit berichtet über eine Methode zur Kontrolle des Herzrhythmus intakter muriner Herzen von transgenen Kanalrhodopsin-2 (ChR2) Mäusen unter Verwendung lokaler Photostimulation mit einem Mikro-LED-Array und gleichzeitiger optischer Kartierung des Epikardialmembranpotentials.

Fortschrittliches Herzrhythmusmanagement durch Anwendung optogenetischer Multi-Site-Photostimulation bei murinen Herzen

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate zu beschreiben, indem Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung des gesamten Sinusknotengewebes verwendet wird, um Schrittmacherfehler bei Mäusen zu identifizieren. Pharmakologische Wirkstoffe können auch in diese Methode eingeführt werden, um ihre Auswirkungen auf die intrinsische Schrittmacherei zu untersuchen.

Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Transgenexpression in Ratten- und Mausherzen durch direkte intramyokardiale Injektion des Virus unter echokardiographischer Leitung. Methoden zur Beurteilung der Anfälligkeit des Herzens für ventrikuläre Arrhythmien durch die programmierte elektrische Stimulation isolierter, Langendorff-durchbluteter Herzen werden hier ebenfalls erläutert.

Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und die Bewertung des Risikos für Herzrhythmusstörungen

Dieses Protokoll stellt einen detaillierten methodischen Rahmen für die Elektroporations-basierte Transgenese von Herzzellen in sich entwickelnden Mausherzen dar. Die hier bereitgestellten Video-Assets erleichtern das Erlernen dieser vielseitigen Technik.

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Erfahren Sie die optogenetische Aktivierung intrinsischer kardialer Neuronen in perfundierten Mausherzen. Diese Methode untersucht die Kinetik autonomer Neuronenaktivierung und die Wechselwirkung zwischen cholinergen und katecholaminergen Systemen.

Optogenetische Aktivierung von intrinsischen kardialen autonomen Neuronen in exzidierten perfundierten Mausherzen

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