Ein immunkompetentes Mausmodell für die interstitielle Laser-Wärmetherapie des Glioblastoms

Unsere Forschung konzentriert sich auf Hirntumoren bei Erwachsenen. Dazu gehören das Glioblastom, das primäre Gliom sowie die Hirnmetastasen. Wir haben Modelle für Hirntumor-Mausen entwickelt, um wirksamere Behandlungen für Patienten mit diesen tödlichen Erkrankungen zu identifizieren.

Das Glioblastom ist der schwerste und häufigste primäre Hirntumor. Bei mehr als 20% der Glioblastom-Patienten kann dieser Hirntumor nicht operativ entfernt werden. In diesen Fällen wird die interstitielle Laser-Wärmetherapie, kurz LITT, klinisch eingesetzt, um diese aggressiven Hirntumoren zu bekämpfen.

LITT ist eine thermische Gewebeablationstechnologie, die klinisch bei chirurgisch unzugänglichen Hirntumoren angewendet wird. Unsere Forschung mit LITT-Mausmodellen wird wichtige Informationen über das Gewebe und die Zellreaktionen auf Wärmebehandlung im Tumor und im umgebenden Hirngewebe liefern. Ein besseres Verständnis der molekularen und zellulären Veränderungen, die durch LITT im Gehirn verursacht werden, wird es uns ermöglichen, LITT effektiver einzusetzen, um die Ergebnisse für Hirntumorpatienten zu verbessern.

Die wichtigste experimentelle Herausforderung ist die genaue Ausrichtung und Behandlung des Tumors. Im Gegensatz zur LITT-Chirurgie, die klinisch bei menschlichen Patienten angewendet wird, verfügen die meisten Modelle nicht über eine Echtzeit-MRT-Bildgebung, was es schwierig macht, den Tumor ohne visuelle Hilfe zu erreichen. Notieren Sie zunächst das Gewicht der anästhesierten Maus, um die richtige Medikamentendosierung zu berechnen.

Rasieren Sie den Operationsbereich vorsichtig und vermeiden Sie dabei Augen, Ohren und Schnurrhaare. Positionieren Sie die Schneidezähne der Maus in das Loch der Beißstange und stellen Sie den Nasenkonus eines stereotaktischen Rahmens so ein, dass er fest sitzt, und ziehen Sie dann die Halteschraube fest, um ihn zu sichern. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie beidseitige Zehenkneifungen der hinteren Gliedmaßen durchführen.

Sobald die Maus richtig betäubt ist, sichern Sie den Schädel mit Ohrsteckern und stellen Sie den Kopf in eine neutrale Position ein. Tragen Sie die Augensalbe großzügig auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Injizieren Sie Meloxicam mit einer 28-Gauge-Half-Inch-Spritze subkutan als Schmerzmittel.

Reduzieren Sie die Anästhesierate, um die angestrebte Atemfrequenz aufrechtzuerhalten. Als nächstes drapieren Sie die Maus aseptisch. Tragen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen die Chlorhexidin-Desinfektionslösung von der Mitte nach außen auf.

Tragen Sie dann mit einem frischen sterilen Wattestäbchen 70% Ethanol auf die gleiche Weise auf. Überprüfen Sie die Narkosetiefe erneut, indem Sie die Atemfrequenz überwachen. Führen Sie dann mit einem Skalpell mit der Nummer 15 einen 1,0 bis 1,5 Zentimeter langen mittleren sagittalen Schnitt durch, der etwas posterior der Augen in Kotschelrichtung beginnt.

Reflektieren Sie nun mit einem sterilen Wattestäbchen die Wundränder, um den Schädel sichtbar zu machen. Reiben Sie vorsichtig jegliches Bindegewebe von der Stelle ab. Verwenden Sie bei Bedarf ein steriles, in Wasserstoffperoxid getränktes Wattestäbchen, um die Schädeloberfläche freizulegen und die Lambda-Nähte sichtbar zu machen.

Lokalisieren Sie das Bregma dort, wo die linke und rechte Hornhautnaht auf die sagittale Naht treffen. Um die Verlagerung von Bregma während der LITT-Operation zu erleichtern, verwenden Sie optional ein ungiftiges farbiges Acrylharz und einen sterilen Zahnstocher aus Holz und hinterlassen Sie eine kleine Markierung über dem Bregma. Wenn sich die Mikroliterspritze im Rahmen befindet, stellen Sie die stereotaktischen Koordinaten mit der Spitze, die das Bregma berührt, auf Null.

Die X-Koordinate bezieht sich auf die Bewegung in der medialen lateralen Ebene, die Y-Koordinate für die vordere posteriore Bewegung und die Z-Koordinate für die dorsale ventrale Ebene. Stellen Sie sicher, dass sich Lambda in derselben dorsalen ventralen Ebene wie das Bregma befindet, wobei Z an beiden Landmarken gleich Null ist. Wenn Anpassungen erforderlich sind, stellen Sie sicher, dass der Schädel immer noch sicher fixiert ist, indem Sie mit einem sterilen Tupfer sanften Druck ausüben.

Positionieren Sie die Nadelspitze über dem Zielbereich bei den Koordinaten plus 2,0 Millimeter medialateral und plus 0,5 Millimeter anteroposterior vom Bregma. Senken Sie die Spitze des Bohrers vorsichtig ab, bis sie den Schädel berührt. Heben Sie die Nadelspitze leicht an und machen Sie mit einem sterilen chirurgischen Marker einen kleinen Punkt an der Stelle für das Bohrloch.

Heben Sie dann die Nadel leicht an, so dass sie nicht im Weg ist, und bohren Sie ein Loch an der markierten Stelle, wobei Sie darauf achten, dass Sie nur durch den Schädel bohren, ohne die darunter liegenden Hirnhäute zu beschädigen. Erstellen Sie ein zweites Fräsloch bei plus 3,0 Millimeter medial lateral und plus 0,5 Millimeter anteroposterior oder verlängern Sie das ursprüngliche Loch bis zu dieser Koordinate, um das Thermoelement während des LITT-Verfahrens aufzunehmen. Nehmen Sie als Nächstes das Mikrozentrifugenröhrchen mit CT2A-Mausgliomzellen aus dem Eis und schnippen Sie vorsichtig mit einer Fingerspitze auf das Röhrchen, um die Zellen wieder zu suspendieren.

Ziehen Sie mit einer Fünf- oder 10-Mikroliter-Spritze vorsichtig etwa zwei Mikroliter der Zellsuspension auf. Drücken Sie 0,5 Mikroliter aus der Spritze ab, um Luft zu entfernen. Wischen Sie den Schaft der Nadel mit einem Alkoholtupfer ab, um Flüssigkeitsreste oder Zellen zu entfernen.

Senken Sie die Nadel langsam auf eine Tiefe bei Z gleich minus drei Millimetern ab und pausieren Sie eine Minute lang. Ziehen Sie dann die Nadel langsam 0,5 Millimeter zurück und injizieren Sie Zellen mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Mikrolitern pro Minute. Warten Sie nach Abschluss der Injektion zwei Minuten, bevor Sie die Spritze über drei bis vier Minuten langsam zurückziehen.

Eine Pause von bis zu einer Minute nach den ersten Intervallen von 100 bis 250 Mikrometern hilft, eine Zellverschiebung zu verhindern. Um den Wundschnitt zu schließen, nähern Sie sich den Rändern des Schnitts wieder an. Verschließen Sie die Wunde mit drei unterbrochenen Nähten mit einer 50er-Naht, während Sie die Wundränder leicht umdrehen, um sicherzustellen, dass sich die darunter liegende Dermis berührt.

Tragen Sie die Povidon-Jodlösung auf die geschlossene Wunde auf und bringen Sie die Maus in einen mit Papier ausgekleideten Auffangkäfig auf einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Wärmekissen. Sobald das Tier wieder auf dem Brustbein liegt, kann es in seinen Heimatkäfig zurückgebracht werden. Neun Tage nach der Injektion der CT2A-Maus-Gliomzellsuspension fixieren Sie die anästhesierte Maus im stereotaktischen Rahmen.

Stellen Sie einen Schnitt in der Mittellinie wieder her und verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um den Schädel zu reinigen und jegliches Gewebe zu entfernen, das das Bregma verdeckt. Wenn der Laser Interstitial Thermal Therapy oder LITT-Aufsatz auf dem stereotaktischen Rahmen angebracht ist, nullen Sie die Koordinaten bei Bregma für die Spitze der Laserfaser. Heben Sie anschließend die Laserfaserspitze leicht an und bewegen Sie sich zu den gewünschten medialen lateralen und anterioren posterioren Koordinaten.

Senken Sie dann die Sonde langsam auf die dorsale ventrale Zielkoordinate ab, um das Ziel zu erreichen. Stellen Sie die LITT-Behandlungsparameter auf den Modus kontinuierlich und Power One What ein. Schalten Sie anschließend den Laser vom Standby-Modus auf aktiv und aktivieren Sie den Laser mit dem Fußpedal 60 Sekunden lang.

Wenn die Temperatur über 46 Grad Celsius steigt, pausieren Sie kurz und schalten Sie dann wieder ein, um die Temperatur in der Nähe von 46 Grad Celsius zu halten. Ziehen Sie zum Schluss die Laserbaugruppe langsam ein. Wischen Sie die Laserfaser und das Thermoelement vorsichtig mit einem Alkoholtupfer sauber.

Drehen Sie die Baugruppe aus dem Weg und stellen Sie sicher, dass die Sonden den Rahmen nicht berühren. T2-gewichtete kornale Magnetresonanztomographien zeigten eine erfolgreiche Tumorimplantation mit nahezu 100%Aufnahmeraten und einer konsistenten sphärischen Tumorbildung. Die LITT-Behandlung führte zu konsistenten Ablationen mit definierten hyperintensen schwarzen Bereichen, die auf eine Gewebenekrose im zentralen Kern und einen umgebenden hyperintensen weißen Bereich mit perioperativem Ödem hindeuteten.