Durchflusszytometrie-basierte Isolierung und therapeutische Bewertung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten in einem Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

Wir konzentrieren uns auf die Entwicklung einer Methode zur Isolierung und adoptiven Übertragung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten, TILs, in einem Pankreaskarzinommodell. Wir versuchen zu beantworten, ob die Untergruppen der TILs Pankreastumoren in vivo effektiv bekämpfen und abtöten können und wie T-Zellen für zukünftige klinische Studien optimiert werden können. Jüngste Entwicklungen in der adoptiven Zelltherapie, einschließlich der Verbesserung von TIL-Isolierungs- und Expressionstechniken, der sanften Modifikation von TILs, um ihr Targeting zu verbessern, und der Kombination der TIL-Therapie mit anderen Immuntherapien wie Checkpoint-Inhibitoren oder zielgerichteten Therapien für eine verbesserte Wirksamkeit von Antitumoren.

Wir haben eine robuste Methode zur Isolierung und Expansion von tumorreaktiven TILs aus dem Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs etabliert. Wir zeigten eine erhöhte Anti-Tumor-Wirksamkeit von adoptiv übertragenen tumorreaktiven T-Zellen. Unser Protokoll bietet einen gezielteren Ansatz für die adoptive Zelltherapie, indem es die Isolierung und Auswahl tumorspezifischer TILs im Vergleich zu anderen weniger spezifischen Methoden ermöglicht.

Es wird auch durch biolumineszierende Bildgebung zur nicht-invasiven Tumorüberwachung eingesetzt. Unsere Ergebnisse werden das Feld voranbringen, indem sie ein standardisiertes präklinisches Modell zur Bewertung der Wirksamkeit der TIL-Therapie bereitstellen und die Behandlungsparameter von T-Zell-Untergruppen für Bauchspeicheldrüsenkrebs optimieren. Um eine KPC-Luciferase-Zellsuspension zur Induktion eines orthotopen Pankreastumors bei Mäusen herzustellen, trypsinisiert man die KPC-Luciferase-Zelllinie für eine Minute bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie nach der Trypsinisierung PBS hinzu, übertragen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension. Zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in einer Konzentration von 1 mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter in PBS, das 30% Basalmembranmatrix enthält. Platzieren Sie die betäubte Maus auf einer Bedienplattform.

Nachdem Sie einen 0,5 bis 1 Zentimeter langen linken Bauchschnitt gemacht haben, halten Sie die Milz mit einer Pinzette fest und legen Sie die Bauchspeicheldrüse frei. Nach der Zubereitung der Mischung aus KPC-Luciferase-Zellen und Basalmembran-Matrix injizieren Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension mit 50.000 Zellen in die Bauchspeicheldrüse mit einer 29-Gauge-Nadel. Bringen Sie die Bauchspeicheldrüse wieder in die Bauchhöhle zurück.

Nähen Sie nacheinander das Peritoneum und die Haut. Lassen Sie die Maus auf einem warmen Pad ruhen, bis sie vollständig wach ist. Nach sieben Tagen injizieren Sie der Maus intraperitoneal 60 Mikroliter D-Luciferin-Kaliumsalzlösung für die Live-Bildgebung.

Positionieren Sie die Maus nach der Anästhesie im In-vivo-Bildgebungssystem für die Biolumineszenzdetektion. Entfernen Sie die Maus nach der Bildgebung aus dem System und lassen Sie sie sich auf natürliche Weise von der Narkose erholen. Platzieren Sie zunächst die euthanasierte Spendermaus auf einer Operationsplattform.

Sterilisieren Sie den gesamten Körper mit 75% Ethanol. Verwenden Sie bei einer sterilen Haube eine Schere und eine Pinzette, um die Bauchhöhle zu öffnen. Entfernen Sie den Tumor und legen Sie ihn in PBS auf Eis.

Messen Sie die Tumorgröße mit einem Vernier-Kaliber. Berechnen Sie dann das Tumorvolumen mit der Formel auf dem Bildschirm. Nach der Herstellung der 1X-Aufschlusslösung mit Kollagenase, Dispase II und DNAse I in RPMI 1640 geben Sie ein bis zwei Milliliter der Lösung pro Vertiefung in eine 12-Well-Platte.

Zerkleinern Sie die Tumore mit einer Schere in kleine Stücke. Übertragen Sie die Tumorstücke in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und verdauen Sie sie bei 37 Grad Celsius, während Sie sie 30 Minuten lang bei 70 U/min schütteln. Um die Verdauung zu beenden, fügen Sie ein bis zwei Milliliter 10%iges fötales Rinderserum hinzu und überführen Sie die Zellsuspension in ein Sammelröhrchen.

Waschen Sie die Vertiefungen einer 12-Well-Platte zweimal mit PBS, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln. Die Zellsuspension wird durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb filtriert, die Gewebefragmente zerkleinert und zerkleinert, um die einzelnen Zellen mit dem flachen Ende eines Spritzenkolbens freizusetzen. Das Filtrat wird fünf Minuten lang bei 400 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert und das Pellet für die Durchflusszytometrie-Färbung in 5 %igem Rinderserumalbumin resuspendiert.

Zu Beginn platzieren Sie die von der tumortragenden Maus isolierten Zellen zusammen mit den mononukleären Zellen der Milz oder des peripheren Blutes der nicht tumortragenden Maus auf einer Arbeitsplattform. Färbung von Zellen mit FC-Blockern und Flow-Antikörpern in einer Verdünnung von 1 bis 100. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis.

Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal in PBS durch Zentrifugation, bevor Sie sie in 1 %Rinderserumalbumin in PBS resuspendieren. Um CD45+CD3+-Zellen zu sortieren, wird auf einem Durchflusszytometer lebende Zellen auf Basis von FSC-A und SSC-A zu einem Gate P1 gegatet. Anschließend gaten Sie einzelne Zellen von P1 basierend auf FSC-A und FSC-H, um Gate P2 zu erstellen. Sortieren Sie CD45+CD3+Zellen von P2 mit CD45- und CD3-Gating. Sammeln Sie die sortierten Zellen in Sammelröhrchen.

CD45+CD3+-Zellen fünf Minuten lang bei 400 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen im Mausserum in einer Konzentration von 1 mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter und legen Sie sie auf Eis. Platzieren Sie die tumorinduzierte Empfängermaus auf einer Operationsplattform.

Injizieren Sie mit einer 29-Gauge-1/2-Zoll-Insulinspritze die sortierten Immunzellen intraperitoneal. Verabreichen Sie dann Interleukin-2 intraperitoneal an drei aufeinanderfolgenden Tagen.