Automatisierte mikrobielle monoklonale Kultivierung und Ernte mit hohem Durchsatz mit dem Einzelzell-Mikroliter-Tröpfchen-Kultur-Omics-System

Diese Forschung erforscht die Omik mikrobieller Kulturen unter Verwendung einer automatischen Plattform, um die mikrobielle Isolierung, Kultivierung und das monoklonale Screening zu verbessern. Ziel ist es, das Verständnis des menschlichen Darms, des Mikrobioms und ihrer Anwendungen zu verbessern. Zu den Technologen, die die Mikrobiomforschung vorantreiben, gehören Drop-of-Mikrofluidik, automatische Stammisolierungs- und Screening-Plattformen, Algorithmen für maschinelles Lernen und monoklonale Dispenser für Kultur-Omics und Mikrobiomanalysen mit hoher Belastung.

Das Mittelzellsystem verbessert die Mikrosichtbarkeit, die monoklonale Isolierung und Färbung erheblich, wodurch die Anzahl der Klone im Vergleich zu herkömmlichen Methoden nahezu verdoppelt wird, wodurch die Forschungsmöglichkeiten im Bereich der Mikrobild-Kulturmischung im Darm verbessert werden. Dieses Protokoll adressiert den Bedarf an kostengünstigen, hochunterstützenden mikrobiellen Screening-Plattformen und überwindet die Einschränkungen traditioneller Methoden in Bezug auf Effizienz und Scorability für die Kulturmix-Forschung. Unser Labor wird sich weiterhin auf die Integration zusätzlicher Techniken zur Tröpfchenmanipulation konzentrieren, wie z. B. Tröpfchenspaltung und -verschmelzung, um den Anwendungsbereich zu erweitern.

Öffnen Sie zunächst die Tür der Tröpfchenerzeugung und der Kultivierungskammer der MISS-Zelle. Entfernen Sie vertikal die Schutzabdeckung für den Mikroschlauch und den Mikrofluidik-Chip zur Tröpfchenerzeugung. Geben Sie mit einer Einwegspritze 10 Milliliter steriles destilliertes Wasser in den Befeuchter in der Kammer und bringen Sie die Schutzabdeckung wieder an.

Öffnen Sie die sterile Verpackung des Mikroschlauchs und des Mikrofluidik-Chips zur Tröpfchenerzeugung und platzieren Sie ihn vertikal direkt über der Kultivierungskammer. Klicken Sie dann auf der Softwareoberfläche auf Installation. Wenn das Bestätigungsfenster angezeigt wird, klicken Sie auf Ja, um die Installation zu starten.

Nehmen Sie den Luftblasenentferner heraus und befestigen Sie ihn kopfüber auf dem Luftblasenentferner in der Kammer. Befestigen Sie das Tropfenauslassrohr des Luftblasenentferners an dem darunter liegenden Klemmventil. Führen Sie es durch das Ganze und führen Sie zur Tröpfchendetektions- und Sammelkammer.

Nachdem Sie die Tür der Kammer geöffnet haben, führen Sie das Detektionsrohr senkrecht in die Detektionsbuchse ein. Stellen Sie sicher, dass das Detektionsröhrchen vollständig eingeführt ist. Ziehen Sie die Schraube, mit der das Detektionsrohr befestigt ist, im Uhrzeigersinn fest.

Nachdem Sie das vollständige Einsetzen und Sichern bestätigt haben, schließen Sie die Tür der Kammer. Verbinden Sie jeden der 10 Silikonschläuche aus dem Mikrofluidik-Chip, die mit L1 bis L10 gekennzeichnet sind, mit den entsprechenden nummerierten Klemmventilen. Verbinden Sie als Nächstes den Schnellanschluss vom Mikrofluidik-Chip mit dem entsprechenden Anschluss am omic-System, indem Sie die richtigen Verbindungen herstellen.

Sobald die Chipinstallation abgeschlossen ist, erscheint ein Pop-up-Fenster mit der Meldung Droplet Tubing Clamp Valve is opened (Tröpfchenschlauch-Klemmventil wird geöffnet). Klicken Sie auf OK, wenn die Installation der Mikroschläuche und des Chips, die Tröpfchengenerierung abgeschlossen ist, abgeschlossen ist. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass alle Schläuche korrekt an den entsprechenden Klemmventilen befestigt sind, klicken Sie auf OK.

Bevor Sie die Initialisierung durchführen, klicken Sie auf die Einstellungsoberfläche, um die relevanten Parameter zu konfigurieren, wie z. B. selektiven Modus, Inkubationstemperatur, Inkubationszeit, Rührwerksgeschwindigkeit, OD-Detektionswellenlänge sowie Anregungs- und Emissionswellenlänge für die Fluoreszenzdetektion. Navigieren Sie zur Startoberfläche und klicken Sie auf Initialisieren. Das Bestätigungs-Popup-Fenster wird angezeigt, wenn Sie auf Ja klicken, damit das IC-System eine Selbstprüfung seiner Komponenten durchführen kann, einschließlich der Einspritzpumpe, der Temperatureinstellungen, der Prüfung des Abflusses von Abfällen, des Screening-Moduls und des Tröpfchenerkennungsmoduls.

Nachdem die Initialisierung abgeschlossen ist, klicken Sie im Popup-Fenster auf OK. Um die Probe vorzubereiten, entnehmen Sie die mikrobielle Probe und führen Sie eine serielle Verdünnung mit dem entsprechenden Medium durch, um eine Konzentration von etwa 50 Zellen pro Milliliter zu erreichen, um eine Probensuspension von 40 Millilitern zu erhalten. Schrauben Sie dann den Deckel der Probenflasche ab und gießen Sie die verdünnte Stuhlsuspension mit einem magnetischen Rührstab bis zur Position der Probenzugabe in die Flasche.

Schrauben Sie die Kappe auf und ziehen Sie sie fest an. Setzen Sie dann den Schnellverbinder A in den Schnellverbinder B ein, um den Probenladevorgang abzuschließen. Nachdem Sie die Probenflasche in die vorgesehene Position gebracht haben, trennen Sie die Schnellanschlüsse A und B von der Probenflasche.

Verbinden Sie den Schnellanschluss A der Probenflasche mit dem O3-Anschluss des omic-Systems. Verbinden Sie den C3-Stecker des Mikrofluidik-Chips mit dem Schnellanschluss B und schließen Sie die Tür der Kammer. Wählen Sie auf der Startoberfläche der Software die gewünschte Anzahl der zu generierenden Tröpfchenschläuche aus und klicken Sie auf Produzieren, um die Tröpfchenerzeugung mit einer einzelnen Zelle zu starten.

Warten Sie, bis das Popup-Fenster angezeigt wird, das den Abschluss der Droplet-Erstellung anzeigt, und klicken Sie auf OK. Schließen Sie die Klemme an den drei Anschlüssen und entfernen Sie die Probenflasche. Wählen Sie auf der Startoberfläche der Software die gleiche Tröpfchenschlauchnummer aus, die bei der Tröpfchengenerierung verwendet wird.

Klicken Sie auf Kultur. Bestätigen Sie die Kultivierungszeit und -temperatur und beginnen Sie mit dem Vorgang. Warten Sie auf das Popup-Fenster, das den Abschluss der Tröpfchenkultivierung anzeigt.

Drücken Sie die UV-Taste am omic-System, um ultraviolettes UV-Licht einzuschalten. Bestrahlen Sie die Tröpfchenerkennungs- und Sammelkammer 30 Minuten lang, bevor Sie sie ausschalten. Öffnen Sie in einer supersauberen Bank alle 96 Well-Platten, die für die Tröpfchensammlung verwendet werden, und stapeln Sie sie ohne Deckel übereinander, wobei Sie sie fortlaufend von unten nach oben nummerieren.

Stellen Sie sicher, dass die obere Vertiefungsplatte mit einem Deckel abgedeckt ist. Öffnen Sie die Tür der Tröpfchendetektions- und Sammelkammer und platzieren Sie die Well-Platten in den vorgesehenen Positionen. Entfernen Sie den Deckel von der oberen Vertiefungsplatte und schließen Sie dann die Kammertür.

Schalten Sie das UV-Licht am omic-System erneut für 30 Minuten ein, um eine Sekundärsterilisation durchzuführen. Entfernen Sie anschließend den Luftblasenentferner aus seiner Position. Schrauben Sie die Kappe ab und entfernen Sie die schmetterlingsförmige Schraube von der Kappe.

Gießen Sie 200 Milliliter Luftblasenentfernungsöl in den Luftblasenentferner. Befestigen Sie die Kappe fest und befestigen Sie den Luftblasenentferner dann kopfüber an der vorgesehenen Stelle. Wählen Sie auf der Home-Oberfläche den Tröpfchenschlauch zum Sortieren aus.

Klicken Sie auf Sortierung. Geben Sie die Anzahl der zu sammelnden Well-Platten ein und starten Sie den Sortiervorgang. Beobachten Sie den Prozessanzeigebereich für Echtzeitmessungen der optischen Tröpfchendichte oder der Fluoreszenzwerte.

Analysieren Sie ca. 20 bis 30 Tröpfchen, um den OD-Wert zu überprüfen. Wenn die meisten Tröpfchen einen OD von etwa 0,2 haben, legen Sie den unteren OD-Schwellenwert auf 0,5 und den oberen OD-Schwellenwert auf vier fest. Das System sammelt automatisch Tröpfchen innerhalb dieses Bereichs in den 96-Well-Platten.

Warten Sie, bis das Popup-Fenster angezeigt wird, das den Abschluss der Droplet-Sortierung und -Sammlung anzeigt, und klicken Sie dann auf OK. Öffnen Sie die Tür der Tröpfchenerkennungs- und Sammelkammer. Setzen Sie den Deckel der Well-Platte auf die obere Well-Platte und entfernen Sie die Platten zusammen.

Klicken Sie auf Daten exportieren, um die gesammelten Tröpfchensignaldaten zu speichern. Klicken Sie auf Heatmap. Wählen Sie die Datendatei für die Tröpfchensammlung aus und beobachten Sie die OD, die im Mikroplattenformat angezeigt wird.

Visualisieren Sie diese OD-Werte als Heatmap, wobei die Farbintensität der OD-Verteilung über die Wells entspricht, um eine klare und intuitive Darstellung zu erhalten. Die Artenvielfalt der menschlichen Darmmikrobiota, die aus dem omic-System, der Festplattenmethode und der ersten Stuhlprobe gewonnen wurde, wurde auf Familienebene verglichen. 34 mikrobielle Familien wurden sowohl mit der Solid-Plate-Methode als auch mit der demonstrierten Omics-Methode angereichert, wobei das Omic-System zusätzlich vier Familien anreicherte.

Das Omic-System bereicherte auch einige der Familien mit geringer Abundanz effektiv. Auf Gattungsebene reicherten beide Methoden 74 mikrobielle Gattungen an, während die MISS-Zellmethode zusätzlich 13 Gattungen anreicherte. Darüber hinaus wurden zwei Gattungen, die ursprünglich nur in geringer Abundanz vorkamen, mit Hilfe des OMIC-Systems effektiv angereichert.

Diese Ergebnisse zeigten, dass die MISS-Zellkulturmethode bessere Wachstumsbedingungen für diejenigen Stämme bot, die in der ursprünglichen mikrobiellen Suspension in geringen Anteilen vorhanden waren oder eine schlechte Wachstumsleistung aufwiesen.