Im lebenden Organismus Die Bildgebung deckt das Wanderverhalten der Leukozyten in den Gelenken auf

Da Leukozyten-Knochenzellen aus dem Knochenmark stammen, müssen sie in das Gewebe eindringen, um eine Entzündung zu verursachen. Die Kontrolle dieses Prozesses stellt einen Schlüsselpunkt dar, an dem neue Therapeutika entwickelt werden können, um Entzündungen abzuschwächen. Im Allgemeinen erfolgt der Leukozytentransport in entzündete Gewebe in postkapillaren Venulen und folgt der Adhäsionskaskade, die mit der Aufnahme der frei fließenden Leukozyten durch die Gefäßwand beginnt.

Darauf folgt das Rollen entlang der Behälterwand in Richtung Pro. Festnahme am Endothel. Es gibt also von Adhäsion und dem Kribbeln in alle Richtungen auf der Gefäßoberfläche, um einen entsprechenden Ort zu bestimmen und eine transendotheliale Migration in eine bestimmte Stelle im Gewebe zu finden.

Entzündende Entzündungen. Diese unterschiedlichen Schritte werden durch die Kombination molekularer Signale, einschließlich der Chemoattraktoren, reguliert. Das Chemoattraktor aktiviert die Leukozyten über ZP Cs und spielt eine entscheidende Rolle in der Migrationskaskade.

Daher haben weitere Endpunktstudien und In-vitro-Experimente keine Einblicke darin geliefert, wie Chemoattractanten- und Chemoattractant-Rezeptor-Signale dynamisch das Leukozyten-Migrationsverhalten in-vivo regulieren. So haben jüngste Fortschritte in der Bildgebungstechnologie beispiellose Einblicke in die Migration von Immunzellen bei lebenden Tieren ermöglicht und unser Verständnis der molekularen Regulation des Immunzelltransports in vivo erheblich verbessert. Deshalb haben wir kürzlich einen Antrag gestellt, den molekularen Mechanismus zu untersuchen, der den Neutrophilentransport zu den Stellen von Gelenkentzündungen steuert.

Unsere In-vivo-Gelenkbildgebung baut dieses neue Paradigma für Typ-III-Überempfindlichkeitsreaktionen im Gelenk auf. Unsere Komplementkomponente C5a wirkt als Auslöser der Entzündung, während Gewebezellen im aktuellen Paradigma der Typ-III-Überempfindlichkeitsreaktionen eine bedeutendere Rolle bei der Entzündung spielen. Daher ist die In-vivo-Bildgebung des Gelenks eine wertvolle Technik, um das migrierte Verhalten der Leukozyten und die molekulare Dynamik mit dem entzündeten Gelenk aufzudecken.

Deshalb teilen wir dieses Protokoll für die In-vivo-Gelenkbildgebung, um Forschungsgruppen zu unterstützen, die diesen Prozess bei entzündeten Gelenken untersuchen. Bereiten Sie das Verdünnungskollagen des Rinders Typ II in 0,05 Molaressigsäure vor, indem Sie es über Nacht bei vier Grad schütteln, um die Emulsionsmischung zu erzeugen: Kollagenverdünnung mit vollständigem Freund-Adjuvans im Verhältnis 1:2 in einer Glasspritze. Es konnte auch etwa 20 Minuten lang von Hand gemischt werden.

Dieser Prozess erzeugt Wärme, also kühlt die Glasspritze mit Emulsion auf Eis. Eine Mäuse, die vor den Impfungen betäubt wurde. Gestalten Sie das Haar entlang des Schwanzes mit einer Haarschneider, um sich auf die Impfung vorzubereiten.

Injizieren Sie langsam 100 Mikroliter Volumen der Emulsion in den subkutanen Raum nahe der Basis des Schwanz. Die klinische Bewertung von Arthritis und die Messung der Pfotendicke sind unerlässlich, um die Krankheitsaktivität zu beurteilen. In der Regel werden klinische Wertungen bei Arthritis und Pfotendickenmessungen alle ein bis drei Tage nach den ersten Impfungen durchgeführt.

Der klinische Arthritis-Wert zu diesem Wert ist die Summe der Werte aller vier Pfoten jeder Maus. Die Ergebnisse werden wie folgt aufgezeichnet. Null ist also unnormal.

Eine davon ist Erythem und eine Anschwellung eines Fingers. Zweitens ist das Erythem und die Schwellung von zwei Fingern oder das Erythem und die Schwellung des Sprunggelenks. Drei ist Erythem und Schwellung von mehr als drei Fingern oder eine Schwellung von zwei Fingern und des Sprunggelenks.

Viertes ist Erythem und starke Schwellung von Knöchel, Fuß und Finger mit Deformität. Die Pfotendickenmessung wird also die Dicke jeder Pfote mit digitalen Schieberschiebern gemessen. Die durchschnittliche Pfotendicke über alle vier Pfoten wird für jede Maus verwendet.

Mäuse werden betäubt und formen das Mausbein dann mit Scheren. Verwenden Sie Haarentfernungscreme, um restliche Haare zu entfernen. Entferne die Creme mit feuchter Mullbinde.

Tragen Sie steriles Hornhautgleitmittel auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern und das Risiko von Hornhautschwingungen zu verringern. Unter einem chirurgischen Mikroskop wird mit einer Mikroschere ein Zentimeter großer Schnitt entlang der Haut gemacht. Behandeln Sie die Bildgebung früher mit 1,5 % Agarose mit PBS.

Die Bühne ist auf dem Mikroskop bereitet. Passen Sie die Konfokalmikroskop-Einstellungen ein, einschließlich Laserleistung, Verstärkung, Versatz und Position. Sobald der geeignete Standort gefunden ist, beginnen Sie mit der Bildaufnahme.

Ein repräsentatives Ergebnis der CIA. Typischerweise wird der Beginn der Arthritis ab Tag 28 beobachtet, wobei der klinische Arthritis-Wert und die Pfotendicke am 35. Tag einen Höhepunkt erreichen. Die Häufigkeit von CIA bei DBA-1-Tages-Mäusen liegt bis Tag 35 meist über 900 bis 100 %.

Hier zeigt der Film links das Gelenk bei Kontrollmäusen und rechts das Gelenk bei CIA-Mäusen. In diesen Filmen stehen die grünen Zellen für Ly6G-positive Neutrophile. Die orangefarbenen Zellen zeigen CD4-positive T-Zellen, und die weißen Bereiche entsprechen Blutgefäßen.

Am 35. Tag sieht man deutlich, dass mehr Ly6G-positive Neutrophile außerhalb der Blutgefäße vorhanden sind als bei CD4+T-Zellen. Diese Neutrophilen sind stark beweglich und bewegen sich aktiv in verschiedene Richtungen im entzündeten Gelenk. Hier zeige ich die repräsentative Analyse der In-vivo-Bildgebung der Gelenke.

Die Grafik links zeigt die Anzahl der neu haftenden Neutrophilen, während die rechts die Anzahl der neu transmigrierten Neutrophilen während einer 30-minütigen Aufnahme anzeigt. In den arthritischen Gelenken ist die Anzahl sowohl der neu haftenden als auch der transmigrierten Neutrophilen deutlich höher als in den Kontrollgelenken. Abschließend präsentieren wir unser aktuelles Protokoll für die In-vivo-Bildgebung von Gelenken, das eine hochauflösende, Echtzeit-Visualisierung des Wanderverhaltens von Leukozyten bei lebenden Mäusen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen ermöglicht.

Diese Technik ermöglicht es uns, direkt zu beobachten, wie Immunzellen in entzündeten Geweben interagieren, wie sie an die Blutgefäßwände haften, in das Gewebe transmigrieren und die Entzündungsreaktion orchestrieren. Durch diesen Ansatz können wir dynamische zelluläre Verhaltensweisen erfassen, die mit herkömmlichen histologischen oder in-vitro-Methoden sonst unsichtbar wären. Durch die Kombination dieses Bildgebungssystems mit quantitativer Analyse und molekularen Markern können wir Schlüsselwege aufdecken, die den Beginn und das Fortschreiten von Arthritis vorantreiben.

Wichtig ist, dass die aus diesen in-vivo-Beobachtungen gewonnenen Erkenntnisse nicht nur unser Verständnis der Dynamik von Immunzellen vertiefen, sondern auch eine wissenschaftliche Grundlage für die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele bieten. Da sich diese Technologie weiterentwickelt und immer mehr Forscher die Methodik anpassen und verfeinern, glauben wir, dass die In-vivo-Bildgebung zu einer wesentlichen Plattform zur Untersuchung komplexer, immunvermittelter Erkrankungen werden wird und eine kraftvolle Verbindung zwischen grundlegender Immunologie und translationaler und klinischer Forschung darstellt. Letztlich hoffen wir, dass dieser Ansatz in naher Zukunft zur Entwicklung innovativer Therapien für rheumatoide Arthritis und andere chronisch entzündliche Erkrankungen beitragen wird.