DNA-Barcode-basierte Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung zur Analyse von FFPE-Proben von genetisch umprogrammierten murinen Melanomen

Wir stellen ein Protokoll zur Entwicklung und Validierung eines Multiplex-Immunfluoreszenz-Panels zur Untersuchung von FFPE-Geweben von Mäusen vor und demonstrieren dessen Nutzen durch die Untersuchung von Proben aus einem Melanommodell, das mit Nanopartikeln behandelt wurde, die Plasma-DNA liefern und immunologische Signale für die Reprogrammierung der Tumormikroumgebung kodieren. Auf diesem Gebiet fehlten streng entwickelte und validierte Multiplex-Immunfluoreszenzprotokolle, die mit formalinfixierten, paraffineingebetteten FFPE-Geweben der Maus kompatibel sind.

Die formalinfixierte Paraffineinbettung bewahrt die Gewebemorphologie langfristig, ist einfach zu handhaben und zu lagern und ermöglicht die Erstellung von Gewebe-Microarrays für die Betrachtung mehrerer Proben auf einem einzigen Objektträger.

Die räumliche Proteomik-Bildgebung wird die Visualisierung und Analyse einer komplexen Tumormikroumgebung verbessern und letztendlich bei der Vorhersage von Immunreaktionen helfen, was zur Entwicklung besserer Therapeutika beitragen kann.

Wir werden dieses Protokoll verwenden, um ein verbessertes räumliches Profiling von Maustumormodellen über viel mehr Tumorarten und verschiedene Immunorgane hinweg zu ermöglichen.

[Erzähler] Zu Beginn die FFPE-Objektträger bei 60 Grad Celsius über Nacht backen. Am nächsten Tag kühlen Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ab, bevor Sie mit der Entparaffinisierung und Rehydrierung beginnen. Inkubieren Sie anschließend die Objektträger zweimal für jeweils fünf Minuten in Xylollösung, um Paraffin zu entfernen, und rehydrieren Sie dann das Gewebe, indem Sie die Objektträger zweimal für jeweils fünf Minuten durch 100%iges Ethanol bewegen. Legen Sie den Objektträger nacheinander für jeweils fünf Minuten in 90 %, 70 %, 50 % und 30 % Ethanollösungen. Waschen Sie die Objektträger zweimal jeweils fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser. Führen Sie eine Antigen-Entnahme durch und verwenden Sie dann eine frische Bleichlösung, um das Gewebe zweimal im Abstand von 45 Minuten zu bleichen, bevor Sie eine Antikörperfärbung durchführen. Führen Sie anschließend die Antikörperfärbung über Nacht bei vier Grad Celsius in einer Kunststoffkammer durch. Entfernen Sie nach dem Färben die Kunststoffkammer und sammeln Sie den zuvor aufgetragenen Antikörpercocktail. Waschen Sie die Objektträger zweimal jeweils zwei Minuten lang in Färbepuffer. Inkubieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang in einem Färbegefäß mit 40 Millilitern Fixierlösung nach dem Färben und spülen Sie sie dann dreimal jeweils zwei Minuten lang mit PBS aus. Übertragen Sie nun die Objektträger für fünf Minuten in eiskaltes Methanol, bevor Sie sie mit PBS spülen. Tragen Sie 200 Mikroliter der endgültigen Fixierlösung auf jeden Objektträger unter einer Feuchtigkeitskammer auf. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur waschen Sie die Objektträger erneut in PBS für drei Zyklen von jeweils zwei Minuten. Wenn Sie sofort bildgebend machen, wischen Sie den Objektträger mit einem fusselfreien Tuch um das Gewebe herum. Drücken Sie die Durchflusszelle 30 Sekunden lang mit der Montageausrüstung der Durchflusszelle. Wenn Sie später fotografieren, lagern Sie den Objektträger ohne Anwendung der Durchflusszelle im Lagerpuffer bei vier Grad Celsius. Wenn Sie bereit sind, die Bilder abzubilden, übertragen Sie die Objektträger für 10 Minuten aus dem Lagerpuffer auf PBS, bevor Sie die Durchflusszelle einsetzen. Bereiten Sie als Nächstes einlaufende DMSO-Puffer basierend auf den gewünschten Bildgebungszyklen vor. Bereiten Sie die Reporter-Stammlösung vor, die für die Gesamtzahl der Bildgebungszyklen erforderlich ist. Pipettieren Sie 250 Mikroliter Reporterstammlösung und fünf Mikroliter jedes Reporters in beschriftete schwarze oder bernsteinfarbene Ein-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Übertragen Sie die Lösung auf eine schwarze 96-Well-Platte und verschließen Sie diese mit Klebefolie. Starten Sie nun das Bildgebungsgerät und stellen Sie mit dem Instrumentenmanager die Parameter und Belichtungszeiten ein. Setzen Sie die Reporterplatte in das Gerät ein und legen Sie dann den Objektträger in die Mikroskophalterung, um mit der Bildgebung zu beginnen. Erfassen Sie Bilder von gefärbtem Gewebe. Installieren Sie die neueste Version der Software zur Analyse der digitalen Pathologie. Klicken Sie auf Projekt erstellen und wählen Sie einen Zielordner für den Projektbereich aus. Klicken Sie anschließend auf Bilder hinzufügen, gefolgt von Dateien auswählen. Navigieren Sie dann zur QuP-TIFF-Datei, die aus der Multiplex-Immunfluoreszenzbildgebung erstellt wurde. Stellen Sie den Bildtyp auf Fluoreszenz ein, behalten Sie die Standardeinstellungen bei und klicken Sie auf Importieren. Wenn Sie QuPath verwenden, doppelklicken Sie auf das neue Bild, um einen Arbeitsbereich zu öffnen, und drücken Sie dann regelmäßig auf Datei und Speichern, um die Projektänderungen zu verfolgen. Schalten Sie die Sichtbarkeit und Anzeigeeinstellungen der Markierung mit dem Helligkeits- und Kontrastwerkzeug in der Symbolleiste um. Verwenden Sie den Pinsel oder den Zauberstab, um eine Anmerkung um den gesamten Gewebeabschnitt zu zeichnen. Definieren Sie diese Anmerkung als vollständiges Gewebe, wobei die darüber liegende Haut oder Regionen, die nicht analysiert werden sollen, ausgeschlossen werden. Halten Sie die ALT-TASTE gedrückt, um negative Anmerkungen zu erstellen oder Begrenzungen zu verkleinern. Wählen Sie nun die Anmerkung aus, indem Sie auf die Registerkarte Anmerkungen klicken und auf Objekte gefolgt von Anmerkungen drücken, und klicken Sie dann auf Ausgewählte Anmerkungen duplizieren. Schalten Sie den SOX 10-Kanal ein und verkleinern Sie dann die duplizierte Anmerkung, um die Tumorregion mit ALT + Pinsel-/Zauberstab-Werkzeug zu definieren. Wählen Sie nun die vollständige Gewebeanmerkung aus. Gehen Sie dann zu Objekte, gefolgt von Anmerkungen und Anmerkungen erweitern. Stellen Sie den Erweiterungsradius auf ein Mikrometer ein und klicken Sie auf Ausführen. Benennen Sie diese neue Anmerkung in Vollständige Gewebeerweiterung um. Wählen Sie die Tumoranmerkung aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie In Hierarchie einfügen aus. Wählen Sie die Tumor-Anmerkung erneut aus, gehen Sie dann zu Objekte, Anmerkungen, und klicken Sie nun auf Invers machen. Definieren Sie diese neue Annotation als Stroma und wiederholen Sie sie für alle Gewebeschnitte. Um die Zellensegmentierung auszuführen, klicken Sie auf die Registerkarte Bild, um die Pixelbreite und Bildhöhe zu ermitteln. Laden Sie die StarDist-Erweiterung von GitHub herunter. Importieren Sie die QuPath-Erweiterung StarDist.jar Datei in QuPath. Laden Sie auch die groovigen StarDist-Skriptdateien und die Modelldatei von GitHub herunter. Wählen Sie für jeden Gewebeschnitt sowohl Tumor- als auch Stroma-Annotationen aus. Klicken Sie in der Einstellungsleiste auf Automatisieren und dann auf Skripteditor, um die Skriptoberfläche zu öffnen. Öffnen Sie das entsprechende StarDist-Zellensegmentierungsskript, das der Pixelgröße des Bildes entspricht. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie StarDistcellsegmodel.pb für die Zellsegmentierung aus. Speichern Sie nach der Zellsegmentierung das Bild, klicken Sie dann nacheinander auf Messen, Messungen exportieren, wählen Sie die entsprechenden Bilder aus und legen Sie den Exporttyp als Zellen und das Trennzeichen als .csv fest. Wählen Sie einen Speicherort für die Ausgabedatei aus und klicken Sie dann auf Füllen, um relevante Metriken einzuschließen. Wählen Sie für jeden Abstammungsmarker, der in der Clusterbildung oder Phänotypisierung verwendet werden soll, einen Mittelwert aus, der exportiert werden soll. Um Proteomdaten zu normalisieren, öffnen Sie die exportierte CSV-Datei und kürzen Sie die Spaltenüberschriften, um nur den Markierungsnamen beizubehalten. Nachdem Sie die neueste Version von R & R Studio installiert haben, laden Sie das .r-Skript für die Markierungsnormalisierung von GitHub herunter und führen Sie es aus, um Zellen basierend auf der Kerngröße herauszufiltern. Führen Sie eine minimale/maximale Normalisierung für jeden Marker durch. Speichern Sie nach Abschluss des Vorgangs die neue CSV-Datei mit den normalisierten Daten. Die Antikörper-DNA-Barcode-Konjugation wurde durch Proteingelelektrophorese bestätigt, wobei zusätzliche Banden im Bereich der schweren Kette gezeigt wurden. Die Multiplex-Immunfluoreszenzbildgebung von B16-F10-Flankentumoren, die mit 4-1BBL/IL-12-Nanopartikeln und systemischem Anti-PD1 behandelt wurden, zeigte eine deutliche Immunmarkerexpression über Tumorschnitte hinweg. Das FlowSOM-Clustering identifizierte im Vergleich zur Seurat-Phänotypisierung einen größeren Bereich der Markerexpressionsintensitäten mit einem maximalen Intensitätsunterschied von etwa 0,7 gegenüber 0,5. Die FlowSOM-Phänotypisierung klassifizierte auch eine höhere Anzahl von Makrophagen in die Subtypen M1 und M2. Die Quantifizierung der Makrophagendichten zeigte, dass FlowSOM im Vergleich zu Seurat höhere Dichten sowohl von M1- als auch von M2-Makrophagen detektierte, während Seurat mehr Makrophagen als Sonstige klassifizierte. Die räumliche Analyse zeigte, dass M2-Makrophagen und natürliche Killerzellen nach der Behandlung die höchsten durchschnittlichen Mindestabstände aufwiesen und M1-Makrophagen häufiger um CD8-T-Zellen herum auftraten.