Nicht-virales Engineering von primären humanen T-Zellen durch Homologie-vermittelte Endverknüpfung und gezielte Integration großer DNA-Templates

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie zur Erzielung eines hocheffizienten gezielten Knock-ins von großen, multicistronischen Konstrukten in primären humanen T-Zellen über den Homologie-vermittelten Endverbindungsweg (HMEJ) zur Verfügung gestellt. T-Zellen, die mit diesem cGMP-adaptierbaren Protokoll hergestellt wurden, behalten eine hervorragende Zellexpansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion bei.

Dieses homologievermittelte End-Joining- oder HMEJ-basierte Protokoll bietet einen GLP-kompatiblen Ansatz für das gezielte nicht-virale Engineering von hochfunktionellen CAR-T- oder TCR-transgenen T-Zellen für die Immuntherapie.

Die derzeitige GMP-Herstellung von CAR-T- und TCR-transgenen T-Zellen für Immuntherapien ist nach wie vor teuer und erfordert eine lange Produktionszeit. Diese nicht-virale Methode reduziert sowohl die Kosten als auch die Herstellungszeit erheblich.

Dieses Protokoll ermöglicht die nicht-virale gezielte Integration großer DNA-Templates in primäre humane T-Zellen. Im Gegensatz dazu zeigen viele andere Techniken eine verminderte Wirksamkeit bei größeren DNA-Templates oder erfordern die Verwendung von zufällig integrierenden viralen Vektoren.

Diese nicht-virale Methode erreicht eine effiziente gezielte Integration von Transgenen in primäre T-Zellen mit geringer Toxizität und erhaltener Funktion in vitro und in vivo und unterstützt die klinische Entwicklung von technisch hergestellten T-Zelltherapien.

Effizientes nicht-virales zielgerichtetes Engineering in primären menschlichen T-Zellen schafft die Möglichkeit, neuartige Immunzelltherapien sicherer und effektiver zu entwickeln, wobei sich zukünftige Forschung auf die Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit bei mehreren Krankheitsindikationen und Immunzelluntergruppen konzentriert.

[Erzähler] Bereiten Sie zunächst eine Rückgewinnungsplatte vor, indem Sie 300 Mikroliter Rückgewinnungsmedium in eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte geben. Erwärmen Sie die Platte in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Zur Herstellung von T-Zellen wird die stimulierte T-Zell- und T-Zell-Aktivierungsperlenmischung geerntet, indem sie im Kolben gemischt und dann in ein geeignetes Volumenröhrchen gebracht werden. Legen Sie das Röhrchen in den Magneten, um die Kügelchen von den Zellen in Suspension zu isolieren. Lassen Sie es mindestens eine Minute lang inkubieren. Übertragen Sie das Medium und die T-Zellen in ein neues Röhrchen, ohne das Rohr vom Magneten zu entfernen. Zählen Sie die T-Zellen und geben Sie sie entweder in konische 14-Milliliter- oder 50-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie das Röhrchen mit PBS auf und bewahren Sie die Zellen bis zur Zentrifugation in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf. Bereiten Sie als Nächstes die T-Zellmischung vor, indem Sie die primäre Zelllösung und das Supplement kombinieren, um den Mastermix-Puffer zu erstellen. Die T-Zellen in PBS bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Dekantieren oder aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die T-Zellen im Mastermix-Puffer in einer Konzentration von 1 Million Zellen pro 18 Mikroliter Mastermix-Puffer. Geben Sie auf Eis für jede Bedingung Reagenzien in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte. Bereiten Sie nun die Elektroporationsmischung vor, indem Sie nach Bedarf 18 Mikroliter T-Zellmischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte geben. Fügen Sie zusätzlichen Mastermix-Puffer hinzu, um ein endgültiges Gesamtvolumen von 22 Mikrolitern für alle Elektroporationsbedingungen zu gewährleisten. Markieren Sie ein Ende der Elektroporationsküvette und ihre Kappe, um die Elektroporation durchzuführen. Entfernen Sie die Kappe von der Küvette. Pipettieren Sie die Elektroporationsmischung vorsichtig ein- bis zweimal aus den Vertiefungen der 96-Well-Platte auf und ab und laden Sie sie in Küvetten. Verschließen Sie die Küvette mit der zuvor vorgenommenen Markierung, um zu vermeiden, dass die Kappe verkehrt herum aufgesetzt wird. Klopfen Sie drei- bis fünfmal auf die Küvette, um mögliche Luftblasen zu entfernen. Legen Sie die Küvetten in die Elektroporationsanlage und führen Sie die Elektroporation durch. Nehmen Sie die Küvette vorsichtig aus dem Gerät und setzen Sie sie in die Haube ein. Lassen Sie die Zellen 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Entnehmen Sie nach der Ruhephase 80 Mikroliter erwärmtes Erholungsmedium aus der Auffangplatte. Geben Sie das Medium vorsichtig in die Küvette und vermeiden Sie dabei den direkten Kontakt mit den Zellen. Pipettieren Sie einmal vorsichtig auf und ab und übertragen Sie das gesamte Reaktionsvolumen zurück auf die Auffangplatte. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Fügen Sie TCM hinzu, um die Zellen auf eine Konzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter zu verdünnen. Nach der Verdünnung stimulieren Sie die Zellen erneut, indem Sie T-Zell-Aktivierungskügelchen in einem Verhältnis von 0,5 Kügelchen pro Zelle zu jeder Vertiefung hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen gewaschen wurden, um ihren Speicherpuffer zu entfernen, und suspendieren Sie sie dann wieder in TCM, bevor Sie sie in jede Vertiefung geben. Entfernen Sie schließlich am dritten Tag die T-Zell-Aktivierungskügelchen und analysieren Sie die Zellen. Mit CRISPR-Cas9 wurde ein hocheffizienter Knock-in des riesigen Minikreis-Konstrukts in den TRAC-Locus primärer humaner T-Zellen erreicht, was zu einer GFP-Expression von 23,35% führte. Die Negativkontrolle zeigte keine GFP-Expression. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Faltenexpansion zwischen den experimentellen und den Kontrollbedingungen. Ebenso wurden keine signifikanten Unterschiede in der Zellviabilität zwischen den Versuchs- und Kontrollbedingungen beobachtet.