Mitochondriales Präparat aus Mikroglia für die Glykananalyse

Im Großen und Ganzen konzentriert sich unsere Forschung auf die Bestimmung der mechanistischen Rolle von Zuckern oder Glykanen und darauf, wie wir diese zellulären und subzellulären Glykosylierungswege beim Altern sowie bei Erkrankungen des Gehirns nutzen können. Derzeit gibt es eine Wissenslücke über die Rolle und Modulation subzellulärer Glykane in verschiedenen Pathophysiologien der Krankheit, einschließlich der akuten und chronischen Hirnerkrankungen wie Schlaganfall und Alzheimer. Dieses Protokoll und unsere Forschung zielen darauf ab, das Wissen über die Rolle von Glykanen bei neuroimmunen Interaktionen zu erweitern und wie diese Informationen genutzt werden können, um bessere und effizientere Therapien des zentralen Nervensystems zu entwickeln.

[Erzähler] Zu Beginn erhalten Sie BV-2-Mikrogliazellen, die von C57BL/6-Mäusen stammen. Halten Sie sie in DMEM-Medium mit niedrigem Glukosegehalt, das mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt wird. Züchten Sie die Zellen in T175-Kolben, bis sie eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreichen. Das Medium wird aus dem Kolben abgesaugt. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Wachstumsmedium. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau. Zentrifugieren Sie die Zellen in einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei 500 g für fünf Minuten. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn. Geben Sie 800 Mikroliter mitochondriales Isolationsreagenz A hinzu und wirbeln Sie fünf Sekunden lang bei mittlerer Geschwindigkeit vortexen. Dann inkubieren Sie das Röhrchen genau zwei Minuten lang auf Eis. Fügen Sie 10 Mikroliter mitochondriales Isolationsreagenz B hinzu und wirbeln Sie fünf Sekunden lang mit maximaler Geschwindigkeit vortexen. Inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis und wirbeln Sie jede Minute mit maximaler Geschwindigkeit. Fügen Sie nun 800 Mikroliter mitochondriales Isolationsreagenz C hinzu und drehen Sie das Röhrchen zum Mischen um. Und zentrifugieren Sie bei 700 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Den Überstand in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen umfüllen und bei 3.000 g 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand, der den zytosolischen Teil enthält, in ein neues Röhrchen umfüllen. Das Pellet enthält die isolierten Mitochondrien. Geben Sie 500 Mikroliter mitochondriales Isolationsreagenz C in das Pellet und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 12.000 g. Resuspendieren Sie die isolierten Mitochondrien in 50 Mikrolitern Proteinisolationspuffer. Lassen Sie die Suspension 20 Minuten lang auf Eis. Dreimal aspirieren und dispensieren und 20 Minuten auf Eis ruhen lassen, vor Gebrauch vortexen. Wenn es nicht vollständig löslich ist, fügen Sie weitere 50 Mikroliter Puffer hinzu und sammeln Sie es im selben Röhrchen. Bei 13.000 g 10 Minuten zentrifugieren. Nach der Rückgewinnung und dem Einfrieren des Überstands mit einem Vakuumkonzentrator trocknen. Für den Nachweis freigesetzter Glykane resuspendieren Sie die getrockneten und verknüpften Glykane in 50 Mikrolitern LCMS-Wasser. Pipettieren Sie fünf Mikroliter resuspendierte mitochondriale Glykane auf einen Probenfleck auf einem Teflon-Mikrotiterobjektträger. Ionisieren und detektieren Sie N-Glykane im negativen Ionisationsmodus mit einem Elektrospray-Lösungsmittel, das aus 60 % Acetonitril und einer millimolaren Essigsäure besteht, bei einer Durchflussrate von zwei Mikrolitern pro Minute und einer Spannung von 3,2 Kilovolt. Koppeln Sie IR-MALDESI an ein HRAM-Massenspektrometer, das auf ein Auflösungsvermögen von 240.000° voller Breite bei halbem Maximum bei einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 200 eingestellt ist, um ein Massen-Ladungs-Verhältnis von 502.000 im negativen Ionisationsmodus zu analysieren. Identifizieren Sie die N-verknüpften Glykane manuell, indem Sie nach monoisotopischen Massen suchen. Bestätigen Sie Isotopenverteilungen mithilfe des Masse-Ladungs-Abstands, um doppelt und dreifach geladene Ionen mit einer minimalen Ionenflussschwelle von 1.000 Ionen pro Sekunde zu bestimmen. Konvertieren Sie die Rohmassenspektren für Masse-Ladungs-Verhältnisse in neutrale monoisotopische Massen. Laden Sie dann die Monoisotopenmassen in ein Online-Tool zur Vorhersage der Oligosaccharidstruktur hoch, um die potenzielle Glykanzusammensetzung zu bestimmen. Bestätigen Sie Annotationen mit einer experimentell kuratierten Glykodatenbank. Stellen Sie sicher, dass jede Identifizierung innerhalb einer Toleranzspanne von 2,5 Teilen pro Million liegt, den Kern und die verknüpfte Glykanstruktur enthält und Pentose, 3-Desoxy-d-Manno-oct-2-ulosonicsäure oder Uronsäuremonosaccharide ausschließt. Die mitochondrialen Proteinkonzentrationen, die aus sechs unabhängigen Präparaten gewonnen wurden, zeigten keine signifikanten Schwankungen, was eine hohe Reproduzierbarkeit bestätigt. Die westliche Blutanalyse zeigte eine CoxIV-Expression nur in den mitochondrialen Fraktionen und GAPDH nur in den zytoplasmatischen Fraktionen, was die Reinheit der mitochondrialen Isolierungen und das Fehlen einer nicht-mitochondrialen Kontamination bestätigt. Unterschiedliche sialylierte, phosphorylierte und sulfatierte N-Glykanstrukturen wurden in mitochondrialen Extrakten mit IR-MALDESI nachgewiesen. Hohe quadratische Werte, die die Passgenauigkeit testen, bestätigten den Nachweis von N-verknüpften Glykanen mit einem und zwei Chloraddukten, was den Nachweis dieser Glykanzusammensetzungen mit IR-MALDESI bestätigt.