Name: Mitochondriales Präparat aus Mikroglia für die Glykananalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Mitochondrien aus Mikrogliazellen für die Glykananalyse mittels Massenspektrometrie. Diese Methode unterstützt die Erforschung neuroimmunologischer Interaktionen bei Hirnerkrankungen.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham 600 Imager</td><td>Cytvia&nbsp;</td><td>29194217</td><td>Gel- und Membran-Imager</td></tr><tr><td>Countess 3 automatisierter Zellzähler</td><td>Fisher Scientific</td><td>X003SZ1LY9</td><td></td></tr><tr><td>Trockenbad Stdrd 4 blck 100-120V</td><td>Thermofisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td></td><td></td>88870003</tr><tr><td>i-Blot2 Geltransfergerät</td><td>Invitrogen</td><td>IB21001</td><td>Western-Blot-Transfersystem</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Cell Treat</td><td>04355223EA</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td></td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Gel-Tank</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Open Air Rocker</td><td>Fisher Marke</td><td>88861025</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenjunge&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Integra- VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrien-Isolationsreagenzien&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrien-Isolationskit</td><td>Thermofisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td>89874</td><td></td></tr><tr><td>Phosphotase-Hemmer</td><td>Thermofisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td></td><td></td>1861274</tr><tr><td>Proteasehemmer</td><td>Thermofisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>N-Glykan-Isolierung und IR-MALDESI-Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11350</td><td>50% in ESI-Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Acetonitril&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851-4L</td><td>1 mM in ESI-Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A643500</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Kalibrierlösung</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A39239</td><td>Pierce FlexMix</td></tr><tr><td>Dithiothreitol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AC426380100</td><td>1 M</td></tr><tr><td>Jodacetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A322-10VL</td><td></td></tr><tr><td>LC/MS Wasser</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>047146.M6</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>Bulldog Bio</td><td>NZPP010</td><td>75000 U/ml, Enzym für die Freisetzung von N-Glykan&nbsp;</td></tr><tr><td>N-Glykan-Isolierung und IR-MALDESI Verbrauchsmaterialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Zentrifugalfilter</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>UFC501024</td><td>10 kDa MWCO</td></tr><tr><td>Massenspektrometer</td><td>Orbitrap Exploris 240</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mid-IR Laser</td><td>JGM Associates, Burlington, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflon-Mikrotiterobjektträger</td><td>Prosolia, Indianapolis, IN, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>N-Glykananalysesoftwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoMod&nbsp;</td><td>Expasy&nbsp;</td><td></td><td>https://web.expasy.org/glycomod/</td></tr> <tr><td>GlyConnect</td><td>Expasy&nbsp;</td><td></td><td>https://glyconnect.expasy.org/</td></tr><tr><td>Proteinisolierung und Western-Blot-Verbrauchsmaterialien&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basix Gel-Ladespitzen ( 10 & Mikro; L)&nbsp;</td><td>Basix</td><td>13-611-102</td><td></td></tr><tr><td>Basix Gel-Ladespitzen ( 200 & Mikro; L)&nbsp;</td><td>Basix</td><td>13-611-116</td><td></td></tr><tr><td>Zellabstreifer</td><td>VWR Labs</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>i-Blot NC reguläre Stacks</td><td>Invitrogen</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>i-Blot2 PVDF Regular Stacks</td><td>Invitrogen</td><td>IB24001</td> 10&<td></td></tr><tr><td>nbsp; &micro; L Mikropipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBE00010</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L Mikropipette</td><td>Invitrogen</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &Mikro; L Mikropipette&nbsp;</td><td>Fisher Brand</td><td>FBE00200</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Mikropipette</td><td>Marke Fisher FBE01000</td><td></td> 10&<td></td></tr><tr><td>nbsp; &micro; L Pipettenspitzen&nbsp;</td><td>VWR Labore</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>20&nbsp; &micro; L Pipettenspitzen</td><td>VWR labs</td><td>76322-134</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &micro; L Pipettenspitzen&nbsp;</td><td>VWR Labore</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>1000&nbsp; &Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>VWR labs</td><td>76322-154</td><td></td></tr><tr><td>Well-Platte&nbsp;</td><td>Fisher Marke</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td><stark>Proteinisolierung und Western Blot Reagenzien&nbsp; Aktin-Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>( Wirt : Kaninchen )</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>8457T</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG HRP verknüpft</td><td>Cell Signaling</td> Technologies <td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus</td><td>Invitrogen</td><td>NW04120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP9700-100</td><td></td></tr><tr><td>COXIV Antikörper ( Wirt : Kaninchen )</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4844S</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Antikörper ( Wirt : Kaninchen)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>MicroBCA-Protein-Assay-Kit</td><td>Thermofisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nupage MOPS SDS Laufpuffer [20x]</td><td>Thermofisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>PAGE Lineal vorgefärbte Proteinleiter</td><td>Thermofisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td>815-968-0747</td><td>Verdünnung = Verwenden Sie 7&nbsp; &micro; L zum Laden in die erste Vertiefung</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Aniara Diagnostics</td><td>A12-9423-5</td><td>Bereiten Sie 1x PBS aus 10x Pulver zu</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrat</td><td>Thermofisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td>32106</td><td>Chemilumineszenz-Substrat-Kit</td></tr><tr><td>RIPA Puffer</td><td>Thermofisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Probenpuffer</td><td>Novex</td><td>B0007</td><td>Der Bolzen-LDS-Probenpuffer wird im Verhältnis von Probe zu Probenpuffer von 3:1 hergestellt</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Verbrauchsmaterialien für Gewebekulturen&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Slides</td><td>Avantor</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen</td><td>Cell Treat</td><td>414004-265612-5884</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Aspirationspipette</td><td>Vista lab</td><td>5090-0010E</td><td></td></tr><tr><td>5 mL serologische Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipette</td><td>Basix</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serologische Pipette</td><td>Vista lab</td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>50 mL serologische Pipette</td><td>Vista lab</td><td>14955233</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konisches Röhrchen</td><td>Avantor</td><td>229225A</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td>Cell treat</td><td>4190-0050</td><td></td></tr><tr><td>T-75 cm2 Gewebekulturflasche</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FB012937</tr><tr><td>T-180 cm2 Gewebekulturkolben</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> FB012939<td></td></tr><tr><td>Reagenzien für Gewebekulturen&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV2 Mikroglia-Zelllinie&nbsp;</td><td>Kreatives Bioarray&nbsp;</td><td>CSC-I2227Z</td><td>Immortalisierte Maus-Mikroglia (BV2) aus C57/BL6-Mikroglia für Neugeborene&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzyme zur Zelldissoziation</td><td>Thermofisher wissenschaftlich&nbsp;</td><td>12563029</td><td>TrypLE&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Medium mit niedrigem Glukosegehalt&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10567014</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Cytiva</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Minimum an essentiellen Medien (MEM) Nicht-essentiellen Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillium Streptomycin</td><td>Cytivia</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Färbung 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>Nr. T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondriales präparat aus mikroglia für die glykananalyse

Mitochondrial Preparation from Microglia for Glycan Analysis

Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über die Schritte, die bei der Isolierung von Mitochondrien aus der BV2-Mikrogliazelllinie für die massenspektrometrische Glykananalyse erforderlich sind. Die Reproduzierbarkeit der mitochondrialen Proteinisolierung zwischen verschiedenen mitochondrialen Präparaten aus der gleichen Ausgangsdichte der Mikrogliazellen ist in Abbildung 2 dargestellt, die keinen signifikanten Unterschied zwischen der mitochondrialen Pr...

Mitochondriales Präparat aus Mikroglia für die Glykananalyse

Understanding the glycosylation patterns of mitochondrial proteins in microglia is critical for determining their role in neurodegenerative diseases. ...

mitochondrial-preparation-from-microglia-for-glycan-analysis

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Isolieren primären Mikroglia aus der zellulären Heterogenität des Gehirns ist wichtig, um deren Rolle bei physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt eine mechanische Isolation und gemischten Zellkultur-Technik, die eine hohe Ausbeute und hoher Reinheit liefert, lebensfähigen primären Mikrogliazellen...

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

Mikroglia sind Makrophagen, die die erste Linie der Verteidigung und Immunüberwachung des zentralen Nervensystems liefern. MicroRNAs sind regulatorische Moleküle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen Prozessen einschließlich Aktivierung und Differenzierung von Makrophagen. In diesem Artikel beschreiben wir die Methode zur Messung von Mikro-RNAs in Mikroglia.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Das Video demonstriert eine Technik zur Isolierung von Mikroglia aus der Rinde eines erwachsenen Mäusegehirns. Zunächst wird der Kortex segmentiert und homogenisiert, um Neuronen und andere Gliazellen zu entfernen und die Mikroglia zu erhalten. Anschließend wird die Zellsuspension magnetischen Anti-Myelin-Mikrokügelchen und einem Magnetfeld ausgesetzt, wodurch Mikroglia und myeloische Zellen effektiv von Myelin-Trümmern und myelinhaltigen Zellen getrennt werden.

Isolierung von Mikroglia aus der Hirnrinde eines adulten Mausgehirns

Dieser Vorgang zeigt, wie aus dem erwachsenen Gehirn der Maus die Mitochondrien-assoziierte ER Membranen oder MAMs und den Glykosphingolipid angereicherten Mikrodomänen Fraktionen aus MAMs und mitochondrialen Vorbereitungen zu isolieren.

Mitochondrien-assoziierte ER Membranen (MAMs) und Glycosphingolipid Angereichert Mikrodomänen (GEM): Isolation aus Mäusehirn

Wir skizzieren Methoden für die effiziente und schnelle Isolierung / Kultur lebensfähiger Mikroglia aus dem Neugeborenen Hirnrinde und erwachsenen Rückenmark. Die Präparation und Beschichtung der kortikalen Mikroglia kann innerhalb von 90 Minuten erreicht werden, mit der anschließenden Mikroglia Ernte stattfindet ~ 10 Tage nach der ersten Sektion.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet.

Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Hier wird ein Protokoll (MitoCeption) dargestellt Mitochondrien zu übertragen, isoliert aus humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC), zu Glioblastom Stammzellen (GSC), mit dem Ziel, ihre biologischen Wirkungen auf Stoffwechsel und GSC Funktionen studieren. kann ein ähnliches Protokoll Mitochondrien zwischen anderen Zelltypen zu übertragen, angepasst werden.

MitoCeption: Übertragen von isolierten humanen MSC Mitochondrien an Glioblastom Stammzellen

Hier ist ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen nativer Form, Präfibrillar und reifen Amyloidfibrillen verschiedener Peptide und Proteine mit Mitochondrien aus verschiedenen Geweben und verschiedenen Bereichen des Gehirns isoliert.

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

Diese Studie stellt eine Methode zur Analyse der Morphologie von Mitochondrien vor, die auf Immunfärbung und Bildanalyse in Maushirngewebe in situ basiert. Es wird auch beschrieben, wie man damit Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie erkennen kann, die durch Proteinaggregation in Parkinson-Modellen induziert werden.

Histologische Untersuchung der mitochondrialen Morphologie in einem Parkinson-Modell

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente Methode zur Durchführung eines Glykolyse-Stresstests zur Quantifizierung der metabolischen Umprogrammierung in primären Maus-Mikroglia. Nach Isolierung und entzündlicher Stimulation wird die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) mit frisch hergestellten, pH-angepassten Reagenzien gemessen, gefolgt von einer Proteinnormalisierung, um eine genaue und reproduzierbare Bewertung glykolytischer Verschiebungen zu ermöglichen.

Untersuchung der Glykolyse in primären Mikroglia mittels extrazellulärem Flussassay

Erfahren Sie die Isolierung von Mitochondrien aus Mikrogliazellen für die Glykananalyse mittels Massenspektrometrie. Diese Methode unterstützt die Erforschung neuroimmunologischer Interaktionen bei Hirnerkrankungen.

Mitochondriales Präparat aus Mikroglia für die Glykananalyse

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