Schnelle hochauflösende Bildgebung des Gefäßsystems von Kleintieren für quantitative Studien

Wir arbeiten daran, die Mechanismen der Krankheitsentstehung zu verstehen, insbesondere im Zusammenhang mit angeborenen Herzfehlern und ob Veränderungen des hämodynamischen Flusses zur Krankheitsentstehung beitragen oder diese verstärken. Nano-Computertomographie, Magnetresonanztomographie bei kleinen Tieren, 4D-Ultraschall und optische Kohärenzdemografie werden alle verwendet, um hochauflösende, quantitative Bildgebungsscans für die Computermodellierung zu sammeln.

Unser Protokoll adressiert den Bedarf an einer schnellen und leicht zugänglichen quantitativen Gefäßbildgebungstechnik, die auf eine Vielzahl von Tiermodellen, einschließlich ihrer Embryonen und Organe, angewendet werden kann. Unser Protokoll ist zeiteffizient und verkürzt die Probenvorbereitungszeit von vier Wochen auf nur drei Tage. Es verwendet minimal gefährliche Clearing-Verbindungen und verlässt sich nicht auf Gefäßmarker, die in frühen Embryonen nicht vorhanden sind.

Jetzt, da wir eine Technik zur routinemäßigen Erfassung hochauflösender, subjektspezifischer volumetrischer Scans etabliert haben, können wir uns auf die Erstellung neuer Krankheitsmodelle konzentrieren, die aus genetischen und mechanischen Störungen resultieren.

[Erzähler] Positionieren Sie zunächst den Vogelembryo vom Hamburger Hamilton Stadium 18 bis zum Stadium 34 unter einem Stereoskop oder auf einem Seziertisch. Schneiden Sie den Embryo mit einer Schere mit gebogener Spitze aus dem Eigelb herum und geben Sie den Embryo dann mit einer Transferpipette oder einem Spatel in eine 35-Millimeter-Petrischale, die mit warmer Tyrode-Lösung gefüllt ist. Unter dem Stereoskop werden mit einer Pinzette mit feiner Spitze etwa 0,1 Millimeter große Schnitte in die Membranen vorgenommen, um das Chorion und den Lantus zu entfernen, die den Embryo bedecken. Ziehen Sie vorsichtig die Membranen zusammen mit der Perikardmembran, die das Herz umgibt, weg. Übertragen Sie den Embryo in eine neue, saubere Petrischale, die mit warmer Tyrode-Lösung gefüllt ist, um die Herzaktivität aufrechtzuerhalten. Fülle nun eine Fünf-Milliliter-Plastikspritze mit warmer Tyrode-Lösung. Schneiden Sie das breite Ende einer Pipettenspitze aus Kunststoff ab und befestigen Sie sie sicher am flachen Ende der Spritze. Um eine Injektionsleitung zu konstruieren, befestigen Sie ein Segment eines Silikonschlauchs mit einem Innendurchmesser von 0,03 Zoll an der Pipettenspitzenspritzenbaugruppe, gefolgt von einer Glaskapillar-Mikronadel am gegenüberliegenden Ende des Schlauchs. Montieren Sie dann die Mikronadel auf den Mikroinjektionshalter, der mit einem Mikromanipulator verbunden ist, und entfernen Sie alle Luftblasen aus dem Silikonschlauch und der Mikronadel. Führen Sie die Mikronadel mit dem Mikromanipulator in die Spitze des Herzens ein und injizieren Sie langsam die Lösung von Tyrode, um den Embryo zu perfundieren. Verwenden Sie anschließend den Mikromanipulator, um die Einspritzleitung zurückzuziehen und die Mikronadel neu auszurichten, damit sie bei weiteren Präparationen stabil bleibt. Löse dann den Silikonschlauch sowohl von der Nadel als auch von der Spritze. Bereiten Sie sich auf die Endomalerei vor, um das Gefäßendothel mit grüner Fluoreszenz zu markieren. Laden Sie mit einer Mikropipette 20 bis 40 Mikroliter FITC Poly-L-Lysin-Stammlösung in den Silikonschlauch. Bringen Sie die mit Lösung gefüllte Spritze des Tyrode wieder an und injizieren Sie die Lösung mit dem Mikromanipulator langsam in die Herzspitze und führen Sie die Nadel bei Bedarf wieder ein. Entfernen Sie dann die Nadel, nachdem FITC Poly-L-Lysin diffundiert wurde, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in das Herz gelangen. Lassen Sie das FITC Poly-L-Lysin 5 bis 10 Minuten im Embryo verbleiben. Füllen Sie dann eine Fünf-Milliliter-Spritze mit 4% Paraformaldehyd und befestigen Sie diese an den Silikon-Injektionsschlauch, um einen dritten Injektionsschritt vorzubereiten. Perfundieren Sie den Embryo mit 4% Paraformaldehyd, bis die kardiovaskulären Strukturen vollständig gefüllt sind und das Gewebe undurchsichtiger wird. Legen Sie den Embryo vorsichtig in ein zwei bis fünf Milliliter fassendes Fläschchen, das mit ausreichend 4 % Paraformaldehyd gefüllt ist, um die Probe einzutauchen und über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Schüttler zu inkubieren. Pipettieren Sie vorsichtig das 4%ige Paraformaldehyd aus der Durchstechflasche heraus. Geben Sie frischen PBS in den Embryo und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, während Sie die Probe vorsichtig schütteln, um sie zu waschen. Um den Embryo zu dehydrieren, legen Sie ihn unter einen Abzug und pipettieren Sie das PBS vorsichtig heraus. Der Embryo wird nacheinander in einer abgestuften Reihe von Methanolkonzentrationen jeweils eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann inkubieren Sie den Embryo über Nacht bei Raumtemperatur in frischem 100%igem Methanol. Um Lipide zu entfernen, geben Sie dem Embryo eine Dichlormethan-Methanol-Lösung von zwei zu einem Volumen. Und drei Stunden lang unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubieren. Nehmen Sie das Ethylzimt bei vier Grad Celsius aus dem Kühlschrank und lassen Sie es auf Raumtemperatur auftauen. Waschen Sie den Embryo in frischem 100% Dichlormethan 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln. Entfernen Sie Dichlormethan mit einer Pipette und inkubieren Sie den Embryo in 100%igem Ethylzimt, bis der Embryo sich klärt, was etwa eine Stunde dauert. Montieren Sie die Glaskapillare auf den Probenhalter und füllen Sie die Bildgebungskammer mit Ethylzimt. Senken Sie nun den Embryo vorsichtig in die Kammer ab. Passen Sie die Bildgebungsparameter gemäß den Spezifikationen an und führen Sie eine Lichtblattbildgebung durch. Erstellen Sie ein neues SV-Projekt unter Datei und laden Sie einen hochauflösenden Lightsheet-Imaging-Stack hoch, nachdem Sie mit der rechten Maustaste auf Bilder geklickt und Bild hinzufügen oder ersetzen ausgewählt haben. Um eine Pfadlinie zu erstellen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Pfade und wählen Sie Pfad erstellen. Platzieren Sie Pfadmarkierungen entlang eines Gefäßes, das Sie interessiert, und wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes zu analysierende Gefäß. Klicken Sie für jede Pfadlinie mit der rechten Maustaste auf Segmentierungen, und wählen Sie Konturgruppe erstellen aus, um mit der Segmentierung zu beginnen. Wählen Sie den Schiffspfad aus und doppelklicken Sie unter Segmentierung auf den Schiffsnamen, um die manuelle Segmentierung der 2D-Querschnitte zu starten. Nachdem Sie alle Schiffe segmentiert haben, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Modelle und wählen Sie Modell erstellen. Wählen Sie abschließend den PolyData-Typ aus, geben Sie einen Modellnamen ein, klicken Sie auf Volumenmodell erstellen, und wählen Sie alle relevanten Segmentierungen aus. Mit Hilfe des optimierten Bildgebungsprotokolls wurden klar umrissene Gefäßlumen über verschiedene Embryonalstadien hinweg erhalten, die die Rachenbogenarterien, die dorsale Aorta und kardiale Strukturen wie Ventrikel und Vorhöfe in grüner Fluoreszenz sichtbar machten. Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine detaillierte 3D-Rekonstruktion des Ausflusstrakts, der Pharynxbogenarterien und der dorsalen Aorta und ermöglicht querschnitts- und tiefenaufgelöste Ansichten der Gefäßanatomie. Die optische Reinigung der Embryonen verbesserte die Sichtbarkeit des inneren Gefäßsystems unter Fluoreszenz signifikant, insbesondere im GFP-Kanal, wo die markierten Gefäße nach der Reinigung deutlicher wurden. Anatomische Rekonstruktionen und Computersimulationen der Pharynxbogenarterien des fünften Hühnerembryos zeigten unterschiedliche Blutflusswege zu kranialen und kaudalen Regionen und zeigten Spitzenwerte für die Wandscherspannung, die mit früheren Nano-Computertomographie-Studien übereinstimmten.