Mikrostrukturierte magnetorheologische Elastomere zur Verbesserung der Kardiomyozytenausrichtung
10. Juni 2025
Wir präsentieren eine dynamische und reversible Steifigkeitsassay-Plattform, die aus einem ultraweichen Silikonelastomer (Polydimethylsiloxan, PDMS) mit eingebetteten Eisenpartikeln hergestellt wird. Dieser neuartige Assay eignet sich für die Untersuchung emergenter zeitabhängiger physikalischer Veränderungen in Zellphänotypen, einschließlich der Kontaktführung. Hier messen wir die Ausrichtung der Kardiomyozyten von neonatalen Ratten nach der Matrixversteifung mit Hilfe von Magneten.
Wir untersuchen, wie Kardiomyozyten auf dynamische, reversible Veränderungen in ihrer mechanischen Umgebung reagieren und die Schwankungen in Steifheit und Struktur nachahmen, die sie in vivo erleben. Seit der Einführung des MRE haben wir mehrere wichtige Studien in der Kardiologie veröffentlicht. Mit diesen Materialien fanden wir heraus, dass steifigkeitsgetriebene Hypertrophie bei adulten Kardiomyozyten von den Mikrotubulinetzwerken abhängt.
Kürzlich haben wir weitere Informationen über mechanisches Gedächtnis sowohl bei kardialen Fibroblasten als auch bei iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten entdeckt. Das Beste an der Verwendung magnetorheologischer Elastomere ist ihre Einfachheit. Unsere Protokolle sind so unkompliziert, wie es klingt, einfach eine Kombination von handelsüblichen Produkten, die zusammenarbeiten, um etwas Kraftvolles zu schaffen.
Es ist ein einfach zu bedienender Ansatz, der modernste Wissenschaft für alle zugänglich macht. Dies ebnete den Weg für realistischere Krankheitsmodelle, insbesondere für Zustände wie Herzinsuffizienz, bei denen sich die Mechanik des Gewebes ständig verändert. Es hilft Forschern außerdem, intelligentere Biomaterialien zu entwerfen, die hoch anpassbar, dynamisch und reversibel sind.
Unser Team hat sich hauptsächlich auf Herzkrankheiten konzentriert, aber kürzlich haben wir den dynamisch steifsten Bereich unserer MREs von so niedrig wie 5 Kilopascal auf bis zu 400 Kilopascal erweitert. Dieser Durchbruch öffnet uns die Tür, unsere Forschung auszuweiten und an anderen Organen jenseits des Herzens zusammenzuarbeiten. Zunächst mischen Sie Base und Härtemittel in einem Verhältnis von 10 zu 1, um 10 Gramm 184 Polydimethylsiloxan, oder PDMS, herzustellen.
Gießen Sie fünf Gramm der 184 PDMS in eine 35-Millimeter-Petrischale. Dann stellen Sie die Schale in einen Trockener und entfeuchten Sie sie etwa fünf bis zehn Minuten, bis alle Blasen verflogen sind. Lass 184 PDMS für 30 Minuten im Ofen bei 60 Grad Celsius teilweise aushärten.
Wenn noch fünf Minuten bis zum Aushärten verbleiben, tragen Sie eine dünne Schicht von zusätzlich 184 PDMS auf die Oberfläche des Beugungsgitters auf. Geben Sie es etwa fünf Minuten lang in einen Trockener zum Entgasen. Jetzt entferne die 35-Millimeter-Petrischale mit den teilweise gehärteten 184 PDMS aus dem Ofen.
Wenden Sie das Beugungsgitter mit PDMS auf die teilweise ausgehärteten 184 PDMS in der Schale um. Drücke leicht auf das Beugungsgitter, bis eine kleine Menge PDMS es umgibt. Verwenden Sie die übrigen, nicht gehärteten 184 PDMS, um die Schale um das Gitter herum aufzufüllen, damit sie beim Aushärten an Ort und Stelle bleibt.
Dann stellst du die Form für 1,5 Stunden in einen Ofen, der bei 60 Grad Celsius eingestellt ist. Nach dem Pökeln nehmen Sie die Form mit dem Gitter aus dem Ofen. Benutze ein Skalpell, um um das Beugungsgitter herum zu ritzen.
Trage eine kleine Menge Isopropylalkohol auf, um unter das Beugungsgitter einzudringen. Zieh das Gitter vom PDMS in Richtung parallel zu den Mustern ab. Entfernen Sie überschüssiges PDMS und lassen Sie nur den gemusterten Bereich erhalten.
Dann schneiden Sie den PDMS-Stempel auf die gewünschte Größe. Markiere die Richtung des Musters auf der MRE-Schale. Um den Stempel mit Silan zu beschichten, wird der gefertigte 184-PDMS-Stempel in einen Sauerstoffplasmareiniger gelegt, wobei die gemusterte Oberfläche nach oben zeigt.
Behandle die Oberfläche 30 Sekunden lang mit 45 Watt Sauerstoffplasma. Platzieren Sie die behandelten 184 PDMS-Stempel in einen Desikator, der in einer Abzugshaube positioniert ist. Jetzt reiß den Deckel von einer Mikrozentrifugenröhre ab.
Platzieren Sie den Deckel des Mikrozentrifugenrohrs neben die PDMS-Stempel im Desickator. Pipettieren Sie 20 Mikroliter Silan auf den Mikrozentrifugenrohrdeckel. Schließen Sie den Desiccator und ziehen Sie ein Vakuum, um die Dampfbeschichtung einzuleiten.
Für die MRE-Vorbereitung messen Sie die gewünschte Menge an Siliziumverdünner und ECO-Elastomerteil B ab. Mischen Sie sie eine Minute lang mit 2.500 Umdrehungen pro Minute in einem Geschwindigkeitsmixer. Fügen Sie dem ECO-Elastomerteil A und Carbonyl-Eisenpartikel hinzu und mischen Sie erneut mit 2.500 Umdrehungen pro Minute für eine Minute. Mit einer Transferpipette mit Spitzenabschluss geben Sie fünf Gramm der MRE-Mischung in eine neue 35-Millimeter-Petrischale.
Entfetten Sie etwa fünf Minuten lang in einem Desikator und härten Sie dann 10 Minuten teilweise im Ofen bei 60 Grad Celsius aus. Wenn noch fünf Minuten zum Aushärten übrig sind, verwenden Sie eine Transferpipette, um ungehärtetes MRE hinzuzufügen und nur die gemusterte Oberfläche des PDMS-Stempels zu beschichten. Geben Sie den beschichteten Stempel in einen Desiccator zum Entgasen für fünf Minuten.
Nimm die teilweise gehärtete MRE-Form aus dem Ofen. Mit einer Pinzette drehen Sie den beschichteten Stempel mit der vorderen Seite nach unten auf die MRE-Oberfläche und drücken Sie leicht. Markiere die Richtung des Musters auf der MRE-Schale.
Stellen Sie die Zusammensetzung für weitere 25 Minuten bei 60 Grad Celsius zurück in den Ofen. Sobald das Material vollständig ausgehärtet ist, verwenden Sie ein Skalpell, um das MRE an der unteren Kante der Marke in einer Richtung senkrecht zu den Musterlinien zu ritzen. Trage eine kleine Menge Isopropylalkohol auf die Schnittstelle um die Marke auf.
Dann verwenden Sie eine Pinzette, um den PDMS-Stempel in Richtung parallel zum Muster vom MRE abzuziehen. Sterilisieren Sie die Oberfläche des MRE, indem Sie dreimal mit 70 % Ethanol waschen und die dritte Reinigung 20 Minuten einwirken lassen. Waschen Sie dann die MRE-Oberfläche dreimal mit sterilem PBS.
Beschichten Sie die Oberfläche des MRE mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin in PBS, das magnesium und Kalzium enthält, eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um die Zelladhäsion am Gerät zu fördern. Abschließend wird die MRE-Oberfläche dreimal mit PBS mit Magnesium und Kalzium gewaschen und die neonatalen Ratten-Kardiomyozyten mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Quadratzentimeter ausgesät. Die Genauigkeit des Mikromustertransfers vom Master-Guss zum MRE-Substrat wird in dieser Abbildung durch normalisierte Höhenprofile und quantitative Messungen von Feature-Pitch und -Höhe demonstriert.
Der X-Profilvergleich zeigte, dass das normalisierte Merkmalshöhenprofil der MRE dem der Hauptform eng folgte, allerdings mit leicht reduzierten Spitzenhöhen und breiteren Merkmalsformen. Die durchschnittliche Tonhöhe des MRE-Substrats betrug etwa 10 Mikrometer und unterschied sich nicht signifikant vom Tonfall der Masterform. Die durchschnittliche Feature-Höhe auf dem MRE-Substrat war deutlich geringer als die der Masterform, mit durchschnittlichen Werten von 3,81 Mikrometern bzw. 5,49 Mikrometern.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine neuartige Plattform für Steifheitstests unter Verwendung eines ultraweichen Silikonelastomers mit eingebetteten Eisenpartikeln vor. Die Plattform dient der Untersuchung zeitabhängiger physikalischer Veränderungen in Zellphänotypen, wobei der Fokus insbesondere auf der Ausrichtung von Kardiomyozyten als Reaktion auf die Versteifung der Matrix liegt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiologie
- Zellbiologie
- Biomechanik
Hintergrund
- Kardiomyozyten sind empfindlich gegenüber mechanischen Veränderungen in ihrer Umgebung.
- Das Verständnis der steifigkeitsgetriebenen Hypertrophie ist entscheidend für die Herzgesundheit.
- Magnetorheologische Elastomere bieten einen einzigartigen Ansatz, um mechanische Eigenschaften zu untersuchen.
- Frühere Studien haben die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerken in der Antwort von Kardiomyozyten hervorgehoben.
Zweck der Studie
- Untersuchung, wie sich neonatale Rattenkardiomyozyten als Reaktion auf dynamische Steifigkeitsänderungen ausrichten.
- Nachbildung in-vivo-mechanischer Schwankungen in einer kontrollierten Umgebung.
- Verbesserung des Verständnisses mechanischer Speicherprozesse in Herzmuskelzellen.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer Plattform für Steifheitstests unter Verwendung von PDMS und Eisenteilchen.
- Bestimmung der Ausrichtung von Kardiomyozyten bei Matrixversteifung.
- Nutzung von Magnetfeldern zur Induktion von Steifheitsänderungen.
- Analyse zellulärer Reaktionen auf wechselnde mechanische Umgebungen.
Hauptergebnisse
- Kardiomyozyten zeigten eine Ausrichtung, die mit der Matrixsteifigkeit korrelierte.
- Dynamische Änderungen der Steifigkeit beeinflussten das Zellphänotyp-Verhalten.
- Die Assay-Plattform erwies sich als wirksam zur Untersuchung mechanischer Eigenschaften.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Reaktionen von Herzmuskelzellen auf mechanische Reize bei.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Plattform ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Mechanik von Kardiomyozyten.
- Die Ergebnisse zeigen die Bedeutung des mechanischen Milieus für das Verhalten von Herzzellen.
- Zukünftige Studien können diese Plattform nutzen, um andere Zelltypen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die dynamische Steuerung der Substratsteifigkeit und -topographie mittels mikrostrukturierter magnetorheologischer Elastomere (MREs) ermöglicht eine gründliche Untersuchung der Kardiomyozyten-Mechanobiologie unter physiologisch relevanten, zeitlich variablen Bedingungen. Diese Plattform schließt eine entscheidende Lücke beim Modellieren der wechselnden mechanischen Mikroumgebungen, wie sie bei Herzerkrankungen auftreten, und unterstützt eine vorhersagekräftige Zuverlässigkeit in der frühen Entdeckung und Zielvalidierung. Der Ansatz fördert die translationale Kontinuität von mechanistischen Erkenntnissen hin zur modellbasierten Darstellung krankheitsrelevanter Systeme und unterstützt risikoadjustierte Portfolioentscheidungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht präzise Überprüfung von Hypothesen zur Mechanotransduktion in Kardiomyozyten unter dynamischen Belastungsbedingungen.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung, indem die Effekte reversibler Steifigkeit und topographischer Signale isoliert werden.
- Erleichtert die mechanistische Ent风险bewertung für Kardiopathie-Modelle durch Nachbildung in-vivo-artiger biophysikalischer Schwankungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein standardisiertes, reproduzierbares Substrat zur quantitativen Beurteilung von Zellausrichtung und phänotypischen Veränderungen.
- Bietet bereitgestellte Assay-Plattformen mit einstellbaren mechanischen Eigenschaften für die Wirkstoffbewertung in krankheitsrelevanten Kontexten.
- Ermöglicht Skalierbarkeit und Wiederverwendung der Plattform in mehreren Mechanobiologie- und kardialen Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimuliert in vitro mechanische Reize, die mit klinisch relevanten kardialen Pathophysiologien wie Myokardinfarkt assoziiert sind.
- Unterstützt die Kontinuität von mechanistischen Studien im Entdeckungsstadium bis zur präklinischen Validierung therapeutischer Hypothesen.
- Verbessert den prädiktiven Wert für die Entwicklung translationaler Biomarker in der kardialen Gewebeengineering- und Krankheitsmodellierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese auf MRE basierende Methode integriert sich in den Fortschritt von der Entdeckung bis zur präklinischen Forschung, indem sie hypothesengetriebene Untersuchungen zur Mechanobiologie, die Entwicklung von Assays sowie die translationale Modellierung von Herzerkrankungen ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Überprüfung der Nullhypothese bezüglich der Auswirkungen mechanischer Belastung auf die Ausrichtung und das Phänotyp von Kardiomyozyten.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Messgrößen zur Zellausrichtung und Substrattreue zur Standardisierung von Assays.
- Analytik: Unterstützt die quantitative Bestimmung der Strichabstände, Höhe und zellulären Reaktion auf dynamische Steifigkeitsänderungen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-gewonnene mechanistische Erkenntnisse mit krankheitsrelevanten präklinischen Modellen kardialer Pathologien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine modulare und anpassungsfähige Plattform für Mechanobiologie-Studien über kardiale und andere Organsysteme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Validierung kardialer Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Bietet standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Arbeitsabläufe für die Forschung zur Mechanobiologie.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffiziente Weiterentwicklung von kardialen Entdeckungsprogrammen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen und Modellen für kardiale und weiterreichende Mechanobiologie-Pipelines.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mechanobiologie, Substratfertigung und quantitativer Zellanalyse.
- Benötigt Zugang zu Werkzeugen für die Herstellung von PDMS/MRE, magnetfeldgesteuerter Ausrüstung und bildgebender Infrastruktur.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg bei der Substratmusterung und Charakterisierung mechanischer Eigenschaften voraus.
- Kann an andere Zelltypen und Organsysteme angepasst werden, sofern Protokollanpassungen gemäß dem verfügbaren Substratbereich möglich sind.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Genauigkeit der Mikromusterübertragung und die erreichbaren Strukturabmessungen.
