Reproduzierbare Herstellung von SPOT als Gerüst-basierte Kulturplattform mit hohem Durchsatz

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung von Gerüst-gestützten Plattformen mit hohem Durchsatz für robuste, reproduzierbare, von Patienten stammende orgonomische Kulturen, um den Arbeitsablauf von Wirkstoff-Screening-Assays zu verbessern und die fortschrittliche Krankheitsmodellierung zu unterstützen.

Automatisierte Liquid Handler, gerüstgestützte Hydrogel-Plattformen, Organ-on-a-Chip-Technologien und Einzelzell-Assays wie Durchflusszytometrie und CYTOPs sind einige der derzeit verfügbaren Technologien.

Zu den aktuellen Herausforderungen gehören die Erhaltung der Hydrogelintegrität, die Überwindung des Gelmeniskus für die Echtzeit-Bildgebung und die Sicherstellung einer gleichmäßigen Zellverteilung in organoidbasierten Langzeit-Assays.

Unser Protokoll ermöglicht eine konsistente, gerüstgestützte Hydrogelbeladung, minimiert Meniskusprobleme, unterstützt die langfristige Organoidkultur und lässt sich nahtlos in automatisierte Liquid Handler und High-Content-Bildgebungssysteme integrieren.

Wir freuen uns sehr darauf, unsere Krankheitsmodellierungsplattformen zu nutzen, um die Mechanismen des Krankheitsverlaufs bei Krebs und die Entwicklung von Fettleibigkeit zu erforschen.

[Dozent] Nehmen Sie zunächst ein PMMA-Mustergerüst für 96 oder 384 SPOT. Schneiden Sie das überschüssige Papier um den blauen Bereich des Gerüsts herum ab und lassen Sie einen weißen Rand von fünf Millimetern um den Umfang herum. Stellen Sie sicher, dass das resultierende Blech etwa 760 Millimeter x 1.300 Millimeter misst. Um ein 96 SPOT-Gerüst für die Montage vorzubereiten, legen Sie ein Stück Polyethylenfolie auf einen starren Acrylträger. Legen Sie diese mit Folie bedeckte Stütze auf die Arbeitsfläche und legen Sie das Gerüst auf die Polyethylenfolie. Richten Sie die Kante eines Lineals zwischen den ersten beiden Reihen des Gerüsts aus, um ein Nachzeichnen in die Vertiefungen zu vermeiden. Platzieren Sie das Pausrad am unteren Ende des Gerüsts und rollen Sie es mit dem Lineal nach oben nach oben. Führen Sie bei einem 384 SPOT-Gerüst keine Perforation durch. Legen Sie anschließend das Gerüst mit der rauen Seite nach oben auf eine PDMS-Platte, wobei Sie darauf achten, dass die Reihen horizontal verlaufen. Verwenden Sie die Grundierungslinie, um zu bestimmen, welche Seite rau ist, und glätten Sie dann das Gerüst auf der Platte, um Falten oder Blasen zu entfernen. Entfernen Sie die Schutzschicht von der nicht gravierten Seite des doppelseitigen Klebebandes. Schnallen Sie das Band in der Mitte leicht an und richten Sie die mittleren beiden Spalten des Bandes am Gerüst aus. Drücken Sie nun die Mitte des Klebebandes auf das Gerüst, um die Ausrichtung zu sichern. Glätten Sie das Klebeband von der Mitte nach außen, um es gleichmäßig zu befestigen. Heben Sie das Gerüst mit einer Pinzette vorsichtig von der PDMS-Platte ab. Bewahren Sie die Platte für die zukünftige Verwendung auf. Um das Gerüst am Klebeband der zweiten Vertiefung zu befestigen, drehen Sie das Gerüst so um, dass die glatte, nicht abgeklebte Seite nach oben auf der Werkbank liegt. Entfernen Sie die mittlere Schutzschicht von der gravierten Seite des zweiten Klebebandes, um zwei mittlere Säulen freizulegen. Schnallen Sie die Mitte des zweiten Bandes leicht an und richten Sie es an den mittleren Säulen des Gerüsts aus, dann drücken Sie auf die Mitte des Klebebandes, um es zu fixieren. Wenn Gravurband verwendet wird, entfernen Sie die verbleibenden Schutzschichten neben der freiliegenden Mitte. Glätten Sie das Klebeband, beginnend in der Mitte und nach außen. Um das Gerüst an der bodenlosen Platte zu befestigen, entfernen Sie die Schutzschicht. Richten Sie das Gerüst unter der bodenlosen Platte mit einem Deckel aus. Sobald es ausgerichtet ist, drücken Sie es in der Mitte auf die Platte. Wenn Sie graviertes Klebeband verwenden, entfernen Sie benachbarte Schichten und glätten Sie das Gerüst von der Mitte nach außen auf die Platte. Um das Gerüst an der Polycarbonatfolie zu befestigen, lösen Sie die Schutzschicht vorsichtig mit einer Pinzette von einer Seite der Polycarbonatfolie und ziehen Sie dann die Schutzschicht langsam ab, ohne dass es zu Vertiefungen in der Folie kommt. Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Seite und legen Sie die Folie dann auf die Werkbank. Ziehen Sie die Schutzbandschicht von der Plattenunterseite ab und drücken Sie die Polycarbonatfolie von der Mitte nach außen auf das Gerüst. Drücken Sie dann die Polycarbonatfolie fest auf das Gerüst, um sicherzustellen, dass jede Vertiefung einen definierten Rand hat. Schneiden Sie mit einem Präzisionsmesser vorsichtig überschüssiges Material vom Boden der Platte ab. Legen Sie die 96 SPOT-Platte nach der vollständigen Montage in einen durchsichtigen, wiederverschließbaren Plastikbeutel und bringen Sie sie aus der Biosicherheitswerkbank. Legen Sie eine starre Acrylstütze unter die Platte und klemmen Sie beide an gegenüberliegenden Ecken fest. Lagern Sie die Platte bis zur weiteren Verwendung an einem sauberen, trockenen Ort. Es wurde kein Leck oder Austausch von Medien beobachtet, wenn abwechselnd Wells in der 384 SPOT-Platte während eines 30-tägigen Testzeitraums mit Fluorescein und PBS gefüllt wurden, was die Wirksamkeit der PMMA-Barriere bei der Aufrechterhaltung der Well-to-Well-Isolierung bestätigt. GFP-exprimierende Pankreastumor-Organoide, die in 96 SPOT-Platten ausgesät wurden, blieben lebensfähig und expandierten schrittweise vom Tag Null bis zum 12. Tag der Kultur. An Tag 12 zeigten SPOT-gezüchtete Organoide eine starke Expression von Cytokeratin 19 und Zonula Occludens-1 sowie das Vorhandensein von internen Lumenstrukturen. Suboptimale und optimale Ergebnisse bei der Gewebeaussaat in 384 SPOT-Platten waren visuell durch Kantendefinition und Gleichmäßigkeit der Zellverteilung unterscheidbar. Mit dem automatisierten Liquid Handler wurde eine gleichbleibend gleichmäßige Aussaat über die gesamten 96 SPOT- und 384 SPOT-Platten erreicht.