Ein multimodales Bildgebungs-Framework zur Verbesserung der Phänotypisierung von lebenden markierungsfreien Brustkrebszellen

In unserem Protokoll präsentieren wir nun die multimodale Bildgebung mittels konfokaler Raman-Mikrospektroskopie und tomographischer Phasenmikroskopie für eine schnelle und unvoreingenommene morphochemische Phänotypisierung von menschlichen Brustkrebszellen in ihrer nativen physiologischen Umgebung. Die Kombination von Raman-Mikrospektroskopie und Tomographie-Phasenmikroskopie ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung unter physiologischen Bedingungen, liefert biochemische und morphologische Informationen über Zellen und überwindet die Grenzen herkömmlicher perturbativer Methoden, wie z. B. Fluoreszenzmarkierung oder chemische Fixierung. Unsere Ergebnisse zeigen ein hohes Potenzial der Implementierung eines multimodalen Ansatzes bei der morphochemischen Phänotypisierung von Brustkrebszellen. Darüber hinaus machten seine Vielseitigkeit, Reproduzierbarkeit und Nicht-Invasivität es zu einem vielversprechenden Werkzeug für eine breite Palette biomedizinischer Anwendungen, von grundlegenden zellbiologischen Studien bis hin zur Diagnostik.

Unser Ziel ist es, einen Atlas optischer Biomarker für die nicht-invasive embryonale Qualitätskontrolle, den Nachweis zellulärer Seneszenz und das Wirkstoffscreening in Organoidmodellen zu erstellen, um die regenerative Medizin und Krankheitsforschung voranzutreiben.

[Dozent] Geben Sie zunächst die Probe der menschlichen Brustkrebszellprobe MDA-MB-231 in den Inkubator auf der Bühne. Fügen Sie Wasser für das Wasserimmersionsziel hinzu. Schalten Sie die automatische Wasserimmersionszuführung ein, um die Objektivlinse mit Wasser zu versorgen. Überprüfen Sie regelmäßig den Wasserstand, um Verdunstung zu vermeiden und konsistente Bildbedingungen während der gesamten Messung zu gewährleisten. Schalten Sie nun den Pumplaser ein und stellen Sie seine Leistung so ein, dass eine Laserleistung von 75 Milliwatt in der Probenebene erreicht wird. Öffnen Sie die Micro-Manager Mikroskopsteuerungssoftware. Wählen Sie in den Konfigurationseinstellungen BF aus und klicken Sie auf Live auf der linken Seite des Softwarefensters. Wählen Sie die gewünschte einzelne Zelle aus und klicken Sie dann auf Stopp, um die Hellfeld-Visualisierung zu beenden. Öffnen Sie die CCD-Kamerasteuerungssoftware. Stellen Sie in der Experimenteinstellung die Belichtungszeit auf 1,5 Sekunden ein. Klicken Sie in der Werkzeugleiste des Experiments auf Ausführen, und aktivieren Sie den Laserstrahl. Passen Sie als Nächstes die Z-Position an, um die Signalanzahl im Fingerabdruckbereich von 600 bis 1.800 inversen Zentimetern zu maximieren, und schalten Sie dann den Laser aus. Klicken Sie in der Symbolleiste des Experiments auf Stopp und beenden Sie die Software. Starten Sie den Datenerfassungsprozess mit dem MATLAB-Skript, das die Raman-Kanäle bei mehrdimensionalen Messungen automatisch verwaltet und die Daten speichert. Stellen Sie das Sichtfeld auf 50 x 50 Mikrometer im Quadrat mit einer Auflösung von 40 x 40 Pixeln ein, wobei jedes Pixel 1,25 x 1,25 Mikrometer im Quadrat abdeckt. Legen Sie die Belichtungszeit für jedes Raman-Spektrum auf 1,5 Sekunden fest und führen Sie das MATLAB-Skript aus. Für die Nachbearbeitung von Raman-Hyperspektralkarten starten Sie das webbasierte Tool RamApp. Importieren Sie die hyperspektralen Daten, indem Sie auf der Registerkarte "Meine Analysen" auf "Neu" klicken und die .mat-Datei hochladen, die die räumlichen und spektralen Datenvariablen sowie die Variable der X-Achse enthält. Um das Spektrum zu kürzen, wählen Sie im Menü "Zuschneiden und Drehen" die Option "Spektraler Zuschnitt". Definieren Sie die unteren und oberen Grenzen des Raman-Verschiebungsbereichs als 600 bzw. 1.800 inverse Zentimeter. Um kosmische Strahlung zu korrigieren, gehen Sie zum Entrauschen, klicken Sie auf Despike, wählen Sie Z-Score als Methode und stellen Sie den Schwellenwert auf acht ein. Aktivieren Sie die Optionen Erste Differenz verwenden und Spitzen korrigieren, und klicken Sie dann auf Ausführen, um die Korrektur anzuwenden. Um Rauschen aus den Maps zu entfernen, klicken Sie auf "Karte glätten", wählen Sie den Medianfilter aus, legen Sie die Größe des Quadrats auf drei Pixel fest, und klicken Sie dann auf "Ausführen". Um das Spektrum der einzelnen Pixel zu glätten, wählen Sie den Savistky-Golay-Filter. Legen Sie die Länge des Filterfensters auf sieben und die polynomiale Reihenfolge auf zwei fest und klicken Sie dann auf Ausführen. Um das durchschnittliche Hintergrundsignal zu subtrahieren, öffnen Sie die optische Substratentfernung und klicken Sie auf Substrat identifizieren. Legen Sie k-means als Methode mit zwei Clustern fest. Klicken Sie dann auf Erweiterte Optionen. Wählen Sie "Morphologische Bereinigung" aus, um kleine Blobs aus dem Vordergrund zu entfernen, und klicken Sie dann auf "Ausführen". Um das durchschnittliche Hintergrundsignal zu entfernen, klicken Sie auf Substrat entfernen, wählen Sie dann den globalen Durchschnitt oder den Mittelwert der Methode der zentralen 95 % der Werte und klicken Sie auf Ausführen. Um die Baseline-Fluoreszenz zu korrigieren, öffnen Sie das Baseline-Fenster, klicken Sie auf Correct Baseline, wählen Sie Adaptive Smoothness PLS, setzen Sie dann Lambda auf 5 Million und klicken Sie auf Run. Um die Normalisierung jeder Raman-Hyperspektralkarte zu erhalten, gehen Sie zu Verschiedenes, wählen Sie Normalisieren, wählen Sie Frobenius-Methode und klicken Sie auf Ausführen. Um ein Falschfarbenbild zu erzeugen, das die subzelluläre Verteilung zeigt, klicken Sie im Bilderbedienfeld auf das Symbol zum Öffnen des Menüs unter Intensitätsbild und dann auf Bild bearbeiten. Wählen Sie im Bearbeitungsfenster ein einzelnes Band aus und definieren Sie den Spektralbereich. Wählen Sie nun die Option "Doppelte Farbe" auf der Farbkarte und definieren Sie dann die Farbe, den Intensitätsschwellenwert und die Deckkraft, bevor Sie auf "Bestätigen" klicken. Wählen Sie für den Download eines einzelnen Punktspektrums ein Pixel von Interesse aus, und klicken Sie dann im Bereich "Spektrallegende" auf "Spektrum herunterladen". Um schließlich Vordergrund- und Substratspektren zu exportieren, navigieren Sie zur Spektrallegende und klicken Sie dann auf Spektrum herunterladen für die Vordergrund- und Substratabschnitte. Geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die Objektivlinse des Mikroskops. Positionieren Sie die Probe auf dem Translationstisch des Mikroskops und passen Sie dann die Probenposition an, um sie mit der Objektivlinse auszurichten. Schalten Sie das Mikroskop ein und starten Sie die Bildgebungssoftware. Klicken Sie auf das Mikroskop-Symbol in der Symbolleiste. Klicken Sie nach der Initialisierung auf Konfiguration, wählen Sie im Job-Panel Live-Zelle und PBS als Medium aus. Greifen Sie als Nächstes auf die Registerkarte Kalibrierung in der Systemsteuerung der Imaging-Software zu. Legen Sie die axialen Positionen des Objektivs und der Kondensorlinse fest, indem Sie den Fokus bzw. die Oberfläche auswählen. Klicken Sie nun auf den Scanmodus, um die Linsen manuell anzupassen und sicherzustellen, dass die Beleuchtungsmuster zentriert und nahezu statisch sind. Wählen Sie den Normalmodus und passen Sie dann den Translationstisch an, um die Zelle in das Sichtfeld zu bringen und auf das Muster zu fokussieren. Passen Sie die Verschiebungsstufe an, um einen Bereich ohne Zellen zu lokalisieren. Wählen Sie "Kalibrieren", um mehrere 2D-Hologramme mit unterschiedlichen Beleuchtungswinkeln zu erfassen. Passen Sie die Verschiebungsstufe an, um die Zelle zu zentrieren, navigieren Sie dann zur Registerkarte "Erfassung" und wählen Sie "3D-Schnappschuss" aus, um das Tomogramm der Zelle zu erfassen. Um die holografischen Tomogramme zu visualisieren, wählen Sie die Daten im Datennavigationsbereich aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie im Datenmanager-Panel auf RI-Tomogramm. Wählen Sie im Bereich "Volumenvisualisierung" RI aus, und zeichnen Sie vier rechteckige Farbfelder innerhalb der RI-Arbeitsfläche. Legen Sie die minimalen und maximalen Werte des RI-Bereichs für jedes Farbfeld fest und ordnen Sie dann jedem Feld eine Deckkraft und eine Farbe zu. Klicken Sie auf Speichern, um die definierten RI-Bereiche und Farbfelder zu speichern. Um quantitative Deskriptoren der Zellmorphologie zu erhalten, verwenden Sie die Analyseschnittstelle. Wählen Sie im Bereich "Segmentierung" die Option "Manuell" aus, legen Sie dann 1,3450 als RI-Schwellenwert fest und klicken Sie auf "Anwenden". Klicken Sie auf Speichern, um die berechneten morphologischen Indizes zu speichern. Die spektrale Raman-Kartierung zeigte die räumliche Verteilung von Zytoplasma, Zellkern, Phenylalanin und Lipiden innerhalb einzelner MDA-MB-231-Zellen. Ausgeprägte Raman-Spektralpeaks, die dem Zytoplasma, dem Zellkern, dem Phenylalanin und den Lipiden entsprechen, wurden im Fingerabdruckbereich zwischen 600 und 1.800 inversen Zentimetern bestätigt. Brechungsindex-Heatmaps einzelner Zellen zeigten die interne Verteilung subzellulärer Komponenten in der axialen XY-Ebene, der sagittalen YZ-Ebene und der koronalen XZ-Ebene. Eine tomographische 3D-Rekonstruktion identifizierte Bereiche mit volumetrischem Brechungsindex, die den internen Substrukturen entsprechen. Quantitative morphologische Messungen einer einzelnen MDA-MB-231-Zelle zeigten unterschiedliche Deskriptoren der Zellmorphologie, mit einem Gesamtvolumen von 4024,189 Kubikmikrometern und einer Oberfläche von 2383,707 Quadratmikrometern mit einem mittleren Brechungsindex von 1,356.