Generierung ganzer bakterieller Genome aus klinischen Proben unter Verwendung eines Target Enrichment-Workflows

Genome können Informationen über die Abstammung, Übertragung und Fähigkeiten eines Krankheitserregers liefern. Bei nicht kultivierbaren Bakterien kann diese Information nur durch gezielte Anreicherung gewonnen werden. Die Sequenzierung bakterieller Krankheitserreger direkt aus klinischen Proben ist aufgrund der überwältigenden menschlichen DNA, der vielfältigen Mikrobiota und der extrem geringen Bakterienlast eine Herausforderung.

In vielen Fällen ist eine Kultur aufgrund der Probenahmemethode und der anspruchsvollen Bakterien keine Option. Bei der Anwendung dieser Technologie auf sexuell übertragbare Bakterien entdeckten wir eine neuartige Chlamydia trachomatis LGV-Linie namens ompA-Genotyp L4 und bestätigten die globale Expansion der dominanten LGV-Linie, was wichtige Erkenntnisse für die molekulare Diagnostik und epidemiologische Überwachung liefert. Dieses Fortschrittsanreicherungsprotokoll ermöglicht die vollständige Wiederherstellung des Genoms aus positiv diagnostizierten klinischen STI-Proben.

Wir fanden heraus, dass diese Technik die metagenomische Tiefensequenzierung, die Depletion der Wirts-DNA und die adaptive Sequenzierung von Nanoporen übertrifft. Wir untersuchen die zirkulierenden Stämme dieser Erreger in Europa und Argentinien. Dies hat das Potenzial, über die Übertragung und den verantwortungsvollen Umgang mit antimikrobiellen Mitteln zu informieren.

Messen Sie zunächst die DNA-Konzentration der DNA-Extrakte aus klinischen Proben mit einer empfindlichen und genauen fluoreszenzbasierten Methode. Verdünnen Sie jede DNA-Probe mit nukleasefreiem Wasser auf 10 bis 200 Nanogramm in einem Endvolumen von 17 Mikrolitern in jedem PCR-Röhrchenstreifen. Geben Sie 3 Mikroliter Fragmentierungs-Mastermix in jede Vertiefung, die die 17 Mikroliter verdünnte DNA enthält.

Pipettieren Sie 20 Mal auf und ab, um gründlich zu mischen. Versiegeln Sie dann den PCR-Röhrchenstreifen. Wirbeln Sie den Streifen 10 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit vor und drehen Sie ihn kurz, um den Inhalt aufzufangen.

Legen Sie dann den PCR-Röhrchenstreifen in den Thermocycler und starten Sie das vorprogrammierte Protokoll für die Fragmentierung und Inkubation. Bereiten Sie als Nächstes die Endreparatur und den dA-Tailing-Mastermix vor, wie in der Tabelle gezeigt. Wirbeln und drehen Sie die Röhre wie zuvor gezeigt und halten Sie sie auf Eis.

Pipettieren Sie dann 20 Mikroliter des Endreparatur- und dA-Tailing-Mastermixes in jede Vertiefung mit 50 Mikrolitern DNA-Fragmenten. Versiegeln Sie das Band und den Wirbel acht Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit. Nachdem Sie den Streifen kurz gedreht haben, legen Sie ihn wieder in den Thermocycler.

Sobald das Thermocycler-Programm abgeschlossen ist, legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen auf Eis. Geben Sie anschließend 25 Mikroliter Ligations-Mastermix bei Raumtemperatur, der 30 bis 45 Minuten im Voraus zubereitet wurde, in jede Vertiefung mit den DNA-Fragmenten. Geben Sie 5 Mikroliter Adapter-Oligo-Mix für NBC-getaggte Bibliotheken in jede Vertiefung.

Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen sofort wieder in den Thermocycler und setzen Sie das Programm fort. Um mit der DNA-Aufreinigung zu beginnen, holen Sie die magnetischen Kügelchen aus 4 Grad Celsius und lassen Sie sie vor der Verwendung auf Raumtemperatur kommen. Geben Sie dann 80 Mikroliter in jede Probenvertiefung.

Legen Sie den PCR-Röhrchenstreifen auf den Magnetständer und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 Mikrolitern 70%igem Ethanol. Warten Sie bei jeder Wäsche eine Minute und entfernen Sie das Ethanol vorsichtig, ohne die magnetischen Kügelchen zu stören. Nachdem Sie die Kügelchen fünf Minuten lang mit 35 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser gemischt und inkubiert haben, aspirieren Sie den geklärten Überstand vorsichtig aus jeder Vertiefung und überführen ihn in einem neuen PCR-Röhrchenstreifen in eine entsprechende Vertiefung.

Legen Sie den neuen PCR-Röhrchenstreifen auf Eis und entsorgen Sie die magnetischen Kügelchen. Nehmen Sie die vorbereitete PCR-Reaktionsmischung vor der Wiederaufnahme und geben Sie 11 Mikroliter davon in jede Probenvertiefung, die die gereinigte DNA-Bibliothek enthält. Geben Sie 5 Mikroliter des ausgewählten Index Prime Repair zu jeder Reaktion und versiegeln Sie den PCR-Röhrchenstreifen.

Starten Sie das Thermocycler-Programm für die PCR-Amplifikation wie in der Tabelle angegeben, um die Pre-Capture-PCR durchzuführen. Fügen Sie den PCR-Röhrchenstreifen erst hinzu, wenn der Thermocycler 98 Grad Celsius erreicht hat. Führen Sie nach Abschluss der Pre-Capture-PCR eine weitere beadbasierte Reinigung durch, um die Bibliothek zu reinigen.

Inkubieren Sie das PCR-Produkt mit magnetischen Kügelchen. Legen Sie dann das PCR-Streifenröhrchen auf ein magnetisches Trenngerät und warten Sie 5 bis 10 Minuten, bis die Lösung klar wird. Während der Streifen auf dem Magnetständer verbleibt, entfernen und entsorgen Sie vorsichtig den durchsichtigen Überstand aus jeder Vertiefung.

Eluieren Sie dann die DNA in 15 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser und messen Sie die DNA-Konzentration der gereinigten DNA-Bibliothek. Für die Probenhybridisierung programmieren Sie den Thermocycler gemäß dem hier angegebenen Protokoll. Starten Sie das Programm und unterbrechen Sie den Lauf sofort.

500 bis 1.000 Nanogramm der vorbereiteten DNA-Bibliotheken werden mit nukleasefreiem Wasser auf ein Endvolumen von 12 Mikrolitern verdünnt. Nach dem Vortexen und Schleudern der Oligonukleotidblocker-Mischung geben Sie 5 Mikroliter in jedes Probenröhrchen. Versiegeln Sie den PCR-Röhrchenstreifen und legen Sie ihn in den Thermocycler.

Halten Sie den Thermocycler an, wenn er Schritt drei des Protokolls erreicht. Geben Sie 13 Mikroliter der vorbereiteten Hybridisierungsmischung für Raumtemperaturfühler zu jeder Probe, während Sie den Streifen im Thermocycler belassen. Pipettieren Sie zum Mischen langsam 8 bis 10 Mal auf und ab.

Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind, und legen Sie den Streifen wieder in den Thermocycler. Vergewissern Sie sich dann, dass alle Röhrchen fest verschlossen sind. Um die hybridisierte Bibliothek zu erfassen, übertragen Sie das gesamte Volumen aus jedem Röhrchen in die entsprechenden Röhrchen mit 200 Mikrolitern vorgewaschener Streptavidin-Kügelchen.

Sammeln Sie die Streptavidin-Kügelchen, bevor Sie sie mit Waschpuffer bei Raumtemperatur waschen. Sobald der PCR-Röhrchenstreifen aus dem Magnetabscheider entfernt wurde, fügen Sie 200 Mikroliter Hochtemperatur-Waschpuffer hinzu, der auf 70 Grad Celsius vorgewärmt wurde, und suspendieren Sie die Kügelchen erneut, indem Sie sie auf und ab pipettieren. Versiegeln Sie den Rohrstreifen, wirbeln Sie mit hoher Geschwindigkeit vor und drehen Sie sich schnell, wie bereits gezeigt.

Legen Sie den versiegelten Schlauchstreifen bei 70 Grad Celsius in den Thermocycler-Block und inkubieren Sie ihn 5 Minuten lang. Übertragen Sie den PCR-Röhrchenstreifen aus dem Thermocycler bei Raumtemperatur zurück in den Magnetabscheider. Warten Sie eine Minute, bis die Lösung klar wird.

Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Geben Sie dann 25 Mikroliter nukleasefreies Wasser in jedes Röhrchen mit den Kügelchen. Programmieren Sie den Thermocycler wie in der hier gezeigten Tabelle angegeben.

Geben Sie 25 Mikroliter des vorbereiteten PCR-Reaktionsgemisches nach der Erfassung in jedes Probenröhrchen. Mischen Sie die Reaktion, bis die Suspension gleichmäßig ist, und verschließen Sie den PCR-Röhrchenstreifen sicher, ohne ihn nach unten zu schleudern. Legen Sie den versiegelten PCR-Röhrchenstreifen in den Thermocycler.

Nachdem Sie das PCR-Produkt in ein frisches Röhrchen umgefüllt haben, geben Sie 50 Mikroliter Bead-Suspension in jedes Probenröhrchen und führen Sie die DNA-Reinigung wie zuvor gezeigt durch. Messen Sie die DNA-Konzentration der endgereinigten Bibliotheks-DNA mit einer fluoreszenzbasierten Quantifizierungsmethode. Die Target-Anreicherung führte zu einem signifikant höheren Prozentsatz an On-Target-Reads und damit zu vollständigen Genomen im Vergleich zur direkten Sequenzierung aller getesteten Krankheitserreger, einschließlich Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum und Mycoplasma Genitalium.

Der Erfolg der Genomsequenzierung wurde überwiegend in Proben mit qPCR-Zyklus-Schwellenwerten unter 30 für alle vier Erreger beobachtet. Mit einer klaren inversen Korrelation zwischen CT-Werten und dem Prozentsatz der On-Target-Reads für Chlamydia trachomatis. Bei einer Hybridisierungstemperatur von 62,5 Grad Celsius im Vergleich zu den vorherigen 65 Grad Celsius konnte die Genomabdeckung für Mycoplasma genitalium verbessert werden, ohne die Leistung der anderen Zielerreger zu beeinträchtigen.

Die phylogenetische Analyse von Chlamydia trachomatis-Genomen aus Argentinien zeigte viele Proben, die sich innerhalb der L2b-Klade gruppieren, und enthüllte eine neue Abstammungslinie, die als ompA-Genotyp L4 vorgeschlagen wurde und von allen früheren LGV-Genomen durch etwa 600 Einzelnukleotid-Polymorphismen getrennt ist.