Name: Generierung ganzer bakterieller Genome aus klinischen Proben unter Verwendung eines Target Enrichment-Workflows (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie ganze bakterielle Genome aus klinischen Proben mittels Target Enrichment sequenzieren. Diese Methode ermöglicht die Genomüberwachung von Chlamydia trachomatis und anderen STI-Erregern trotz hoher menschlicher DNA-Last.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Lefterova, M. I., Suarez, C. J., Banaei, N., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+for+infectious+disease+diagnosis+and+management%3A+a+report+of+the+Association+for+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing for infectious disease diagnosis and management: a report of the Association for Molecular Pathology.</a> J Mol Diagn. 17 (6), 623-634 (2015).</li>
<li>Gwinn, M., Maccannell, D., Armstrong, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+of+infectious+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing of infectious pathogens.</a> JAMA. 321 (9), 893-894 (2019).</li>
<li>Hasman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+whole-genome+sequencing+for+detection+and+characterization+of+microorganisms+directly+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples.</a> J Clin Microbiol. 52 (1), 139-146 (2014).</li>
<li>Gautam, S., KC, R., Leong, K. W. C., Mac Aogáin, M., O'Toole, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step-by-step+beginner%27s+protocol+for+whole+genome+sequencing+of+human+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Methods%22%5BJournal%5D)">A step-by-step beginner's protocol for whole genome sequencing of human bacterial pathogens.</a> J Biol Methods. 6 (1), e110(2019).</li>
<li>Baert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+document+on+the+use+of+whole+genome+sequencing+%28WGS%29+for+source+tracking+from+a+food+industry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Guidance document on the use of whole genome sequencing (WGS) for source tracking from a food industry perspective.</a> Food Control. 130, 108148(2021).</li>
<li>Didelot, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 601-612 (2012).</li>
<li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+laboratory+maintenance+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and laboratory maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. 11, (2006).</li>
<li>Edmondson, D. G., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+the+syphilis+spirochete+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum.</a> Curr Protoc. 1 (2), e44(2021).</li>
<li>Pitt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+in+vitro+propagation+and+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Challenges of in vitro propagation and antimicrobial susceptibility testing of Mycoplasma genitalium.</a> J Antimicrob Chemother. 77 (11), 2901-2907 (2022).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+methods+for+genome+sequencing+of+Chlamydia+trachomatis+and+other+sexually+transmitted+bacteria+directly+from+clinical+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Evaluating methods for genome sequencing of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria directly from clinical swabs.</a> Microb Genom. 11 (2), 001353(2025).</li>
<li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Res. 23 (5), 855-866 (2013).</li>
<li>SureSelect XT HS2 DNA kits: library preparation (+/-MBC) / fast-Hyb target enrichment / post-capture pooling workflow for Illumina platform NGS. , Agilent Technologies. 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf</a> (2023).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+genomes+from+rectal+samples%3A+description+of+a+new+clade+comprising+ompA-genotype+L4+from+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis genomes from rectal samples: description of a new clade comprising ompA-genotype L4 from Argentina.</a> Microb Genom. 11 (2), 001350(2025).</li>
<li>Brown, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+whole-genome+sequencing+by+SureSelect+target+enrichment%3A+a+robust+and+sensitive+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Norovirus whole-genome sequencing by SureSelect target enrichment: a robust and sensitive method.</a> J Clin Microbiol. 54 (10), 2530-2537 (2016).</li>
<li>Dao, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+SureSelect+target+enrichment+system+for+next-generation+sequencing+to+obtain+the+complete+genome+sequence+of+bovine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of the SureSelect target enrichment system for next-generation sequencing to obtain the complete genome sequence of bovine leukemia virus.</a> Arch Virol. 163 (11), 3155-3159 (2018).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SureSelect+targeted+enrichment%2C+a+new+cost+effective+method+for+the+whole+genome+sequencing+of+Candidatus+Liberibacterasiaticus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">SureSelect targeted enrichment, a new cost effective method for the whole genome sequencing of Candidatus Liberibacterasiaticus.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-8 (2019).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ompA+sequencing+and+multilocus+sequence+typing+of+lymphogranuloma+venereum+cases+in+Buenos+Aires+reveal+new+Chlamydia+trachomatis+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">ompA sequencing and multilocus sequence typing of lymphogranuloma venereum cases in Buenos Aires reveal new Chlamydia trachomatis genotypes.</a> Microorganisms. 12 (3), 587(2024).</li>
<li>La Rosa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+anorectal+infections+by+LGV+%28L1%2C+L2+and+L2b%29+and+non-LGV+serotypes+in+symptomatic+patients+in+Buenos+Aires+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis anorectal infections by LGV (L1, L2 and L2b) and non-LGV serotypes in symptomatic patients in Buenos Aires Argentina.</a> Int J STD AIDS. 32 (14), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Rodríguez Fermepin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+L2b+in+rectal+lymphogranuloma+venereum%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Microbe%22%5BJournal%5D)">More than L2b in rectal lymphogranuloma venereum.</a> Lancet Microbe. 2 (2), e55(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>8-Kanal-Pipette 0,5-10 &Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000010</td><td>Eppendorf Research&nbsp; Plus, 8-Kanal, 0,5-10 & Mikro; L, mittelgrau, variables Volumen.</td></tr><tr><td>8-Kanal-Pipette 10-100 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td>Eppendorf Research&nbsp; Plus, 8-Kanal, 10-100 & Micro; L, gelb, variables Volumen.</td></tr><tr><td>Adapter Oligo Mix für MBC-getaggte Bibliotheken</td><td>Agilent Technologien</td><td>5500-0147</td><td>Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).</td></tr><tr><td>Automatisiertes Nukleinsäure-Extraktionssystem unter Verwendung eines DNA-Extraktionskits für Viren/Krankheitserreger</td><td>Qiagen</td><td>937036 (Bausatz) / 9001297 (Instrument)</td><td>Das QIAsymphony SP/AS-Instrument wird mit dem QIAamp DSP Virus/Pathogen Kit für die automatisierte DNA-Extraktion verwendet.</td></tr><tr><td>Bindungs-Puffer</td><td>Agilent Technologien</td><td>5190-9687</td><td>Teil des SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).</td></tr><tr><td>DNA-Extraktionskit und automatisiertes Instrument</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>Nr. D3024/D3025</td><td>Quick-DNA Miniprep Kit für die vollständige DNA-Extraktion aus klinischen Proben. Kompatibel mit manuellem oder automatisiertem Workflow.</td></tr><tr><td>End Repair - Eine Tailing-Enzymmischung</td><td>Agilent Technologien</td><td>5500-0147</td><td>Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).</td></tr><tr><td>Endreparatur-Tailing-Puffer</td><td>Agilent Technologien</td><td>5500-0147</td><td>Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>20816.298</td><td>Ethanol absolut &ge; 99,5% Ph. Eur., USP</td></tr><tr><td>Fluorometer mit hochempfindlichem dsDNA-Assay / Fluoreszenzbasierte Methode zur Quantifizierung von DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>Q33238, Q33231</td><td>Qubit 4 Fluorometer mit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit.</td></tr><tr><td>Fragmentierungs-Puffer</td><td>Agilent Technologien</td><td>5191-4080</td><td>Teil des SureSelect Enzymetic Fragmentation Kit mit dem Namen ''5X Fragmentation Buffer''.</td></tr><tr><td>Fragmentierungs-Enzym</td><td>Agilent Technologien</td><td>5191-4080</td><td>Teil des SureSelect Enzymetic Fragmentation Kit.</td></tr><tr><td>High-Fidelity-DNA-Polymerase-Puffer</td><td>Agilent Technologien</td><td>5500-0147</td><td>Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre PCR) mit dem Namen ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>High-Fidelity-DNA-Polymerase-Puffer mit dNTPs (5X)</td><td>Agilent Technologien</td><td>5190-9687</td><td>Teil des SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) mit dem Namen ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>High-Fidelity-Fusionsenzym für die PCR-Amplifikation</td><td>Agilent Technologien</td><td>5191-5688</td><td>Teil des SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) mit dem Namen ''Herculase II''.</td></tr><tr><td>Hochtemperatur-Waschpuffer</td><td>Agilent Technologien</td><td>5190-9687</td><td>Teil des SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) mit dem Namen ''Wash buffer 2''.</td></tr><tr><td>Hybridisierungs-Puffer&nbsp;</td><td>Agilent Technologien</td><td>5500-0147</td><td>Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).</td></tr><tr><td>Indizierte Sequenzierungsprimer</td><td>Agilent Technologien</td><td>5500-0147</td><td>Teil des SureSelect XT HS2 Index Primer Paares 1-96 für ILM (Prä-PCR).</td></tr><tr><td>Hauseigener Multiplex-Real-Time-PCR-Assay</td><td>Tib Molbiol</td><td>N/A</td><td>Eigenentwickelter und akkreditierter Assay auf Basis von Lightmix Kits für den STI-Nachweis</td></tr><tr><td>Ligations-Puffer</td><td>Agilent Technologien</td><td>5500-0147</td><td>Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).</td></tr><tr><td>Magnetische Kügelchen für die Reinigung</td><td>Agilent Technologien</td><td>5191-5740</td><td>SureSelect DNA AMPure XP Perlen.</td></tr><tr><td>Magnetischer Ständer</td><td>Permagen Laborgeräte</td><td>MSRLV08</td><td>0,2 mL PCR 8 Streifen Magnetabscheider 5 & Mikro; L ~ 0,2 ml Volumen.</td></tr><tr><td>Next-Generation-Sequencing (NGS): Kurz-Read-Sequenzierungssystem mit hohem Durchsatz&nbsp;</td><td>Illumina, Inc.</td><td>N/A</td><td>Paired-End-Sequenzierung mit 150 bp (PE150), die auf den Plattformen Illumina NextSeq1000 und MiSeq durchgeführt wird.</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>BioConcept</td><td>3-07F04-H</td><td>Wasser für die Molekularbiologie, DNA/DNAse/RNase-frei, steril, frei von PCR-Inhibitoren.</td></tr><tr><td>Oligonukleotid-Blocker-Mix&nbsp;</td><td>Agilent Technologien</td><td>5500-0147</td><td>Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).</td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen-Streifen</td><td>avantor, geliefert von VWR&nbsp; &nbsp;</td><td>732-3608</td><td>PCR-Röhrchenstreifen mit aufgesetzten Schieberkappen.</td></tr><tr><td>Post-Capture Primer Mix</td><td>Agilent Technologien</td><td>5190-9687</td><td>Teil des SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).</td></tr><tr><td>RNA-Sonde</td><td>Agilent Technologien</td><td>5191-6916&nbsp;</td><td>SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mb Sonde, z. B. Design-ID S3465164).</td></tr><tr><td>RNase Blocker</td><td>Agilent Technologien</td><td>5500-0147</td><td>Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre-PCR).</td></tr><tr><td>Waschpuffer bei Raumtemperatur</td><td>Agilent Technologien</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Modul Box 1 (Post PCR) mit dem Namen ''Wash buffer 1''.</td></tr><tr><td>Streptavidin-Kügelchen</td><td>Agilent Technologien</td><td>5191-5742</td><td>SureSelect Streptavidin Perlen.</td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase</td><td>Agilent Technologien</td><td>5500-0147</td><td>Teil des SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit für ILM (Pre PCR) .</td></tr><tr><td>Methode zur Anreicherung von Zielen / Methode zur DNA-Erfassung</td><td>Agilent Technologien</td><td>Nr. G9983-90000</td><td>SureSelect XT HS2 DNA-Kit mit Bibliotheksvorbereitung, schneller Hyb-Zielanreicherung und Pooling-Workflow nach der Aufnahme. Protokoll Version F0, Mai 2023. Für Illumina Platform NGS</td></tr><tr><td>Zielanreicherungssonde für C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum und M. genitalium</td><td>Agilent Technologies / Enriching Microbiology Laboratory (IMM, UZH)</td><td>Design-ID-S3465164</td><td>Kundenspezifisches Sondenset (~242.000 Sonden) für die Multiplex-Erfassung von vier STI-Erregern. Design basierend auf mehreren Referenzgenomen.</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Thermofischer</td><td>4375305</td><td>Veriti 96-Well-Thermocycler.</td></tr></tbody></table>

generierung ganzer bakterieller genome aus klinischen proben unter verwendung eines target enrichment-workflows

Generating Whole Bacterial Genomes from Clinical Samples using a Target Enrichment Workflow

Eine Studie über den Ausbruch von C. trachomatis LGV in Buenos Aires, Argentinien, zeigte einige neue Merkmale in den Proben, nämlich 10 Nukleotidsubstitutionen im ompA-Gen im Vergleich zum ompA-Genotyp L1 und eine ungewöhnliche Multi-Locus Sequence Typing (MLST) Sequenz Typ 2 17,18,19. Unser Ziel war es, die Genome dieser klinischen Proben zu untersuchen und sie in den Kontext globaler Daten zu stellen. Um dies zu erreichen, verglichen wir die Leistung eines Target-Enrichment-Ansatzes mit der direkten metagenomischen Sequenzierung für WGS von bakteriellen STIs aus klinischen Proben, um die Herausforderungen zu überwinden, die sich aus der geringen bakteriellen Belastung und der reichlich vorhandenen menschlichen und mikrobiellen DNA ergeben.
Die verwendete DNA stammte entweder aus rektalen Abstrichproben, die zwischen 2017 und 2023 in Buenos Aires, Argentinien, entnommen und in 2-SP-Medium (Saccharose-Phosphat-Medium) gegeben wurden, das mit 2 % fötalem Kälberserum (FCS) und Antibiotika (Gentamicin 25 μg/ml, Vancomycin 0,5 mg/ml und Amphotericin B 2,5 μg/ml) ergänzt und bei -80 °C gelagert wurde, oder gepoolte Harnröhren-, anorektale, und Rachenabstriche, die am Universitätsspital Zürich (USZ) in NAATs (Nucleic Acid Amplification Tests) gesammelt wurden. Die DNA aus den Proben von Buenos Aires wurde mit einem manuellen Extraktionskit auf Siliziumdioxidbasis extrahiert, während die DNA aus den USZ-Proben mit einem automatisierten System auf Basis von magnetischen Beads extrahiert wurde.
Alle klinischen Proben, die in diese Studie eingeschlossen waren, wurden durch einen intern entwickelten Multiplex-Real-Time-PCR-Assay (siehe Materialtabelle) mit qPCR-Zyklus-Schwellenwerten (Ct) wie folgt bestätigt: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae:  24-31, T. pallidum: 27-36 und M. genitalium:  30-37. Die DNA-Konzentration wurde vor der Sequenzierung mit einem hochempfindlichen fluorometrischen Assay quantifiziert, um das Eingangsmaterial der klinischen Proben zu charakterisieren (siehe Materialtabelle).
Um die direkte metagenomische Sequenzierung mit der Zielanreicherung zu vergleichen, verwendeten wir 32 Proben, von denen 29 positiv für C. trachomatis, neun für N. gonorrhoeae, fünf für T. pallidum und drei für M. genitalium waren. Die direkte metagenomische Sequenzierung führte zu keinem vollständigen Genom und erreichte in der Tat kaum Zieldaten, die über dem Ausgangswert der negativen Proben lagen. Die Zielanreicherung mit Hybridisierung bei 65 °C führte zu deutlich besseren Ergebnissen für jeden Erreger, und in vielen Fällen wurden mit dieser Methode erfolgreiche Genome erzielt (Abbildung 1). 
Um die optimale Probenauswahl für die Zielanreicherung zu bewerten, untersuchten wir die Beziehung zwischen diagnostischen qPCR-Ct-Werten und der Effizienz der Genomwiederherstellung, gemessen am Prozentsatz der On-Target-Reads (%OTR). Diese Metrik spiegelt den Anteil der Sequenzierungs-Reads wider, die dem Genom des Zielorganismus zugeordnet sind, und wird häufig zur Bewertung der Anreicherungsleistung verwendet. Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen der Erregerlast und dem Sequenzierungserfolg für C. trachomatis gefunden, mit einem Ct-Cut-off für den Erfolg um Ct30. Obwohl die Daten für die anderen Zielerreger begrenzt waren, wurde ein ähnlicher Trend beobachtet, bei dem der Erfolg der Genomsequenzierung überwiegend in Proben mit einer Erregerlast unter Ct30 auftrat (Abbildung 2).
Dieses Experiment mit einer Hybridisierungstemperatur von 65 °C ergab Erfolgsraten bei der Genomsequenzierung mit einer angestrebten Anreicherung von 75 % bis 80 % für C. trachomatis, N. gonorrhoeae und T. pallidum, basierend auf Proben mit Ct-Werten unter 30. Die drei M . genitalium-positiven Proben wiesen Ct-Werte von 30-37 auf und erreichten eine geringere Genomabdeckung und mittlere Lesetiefe. Um diese Ergebnisse zu verbessern, experimentierten wir mit der Reduzierung der Hybridisierungstemperatur, was die Hybridisierung aufgrund des niedrigen %G+C-Gehalts im M . genitalium-Genom verbessert. Durch die Verwendung niedrigerer Hybridisierungstemperaturen, wie z. B. der jetzt empfohlenen Temperatur von 62,5 °C, können wir die Wiederherstellung von M. genitalium-Genomen verbessern, ohne die Wiederherstellung anderer Genome zu beeinträchtigen (Abbildung 3). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Target-Anreicherung ein effektiver Ansatz ist, um wertvolle genomische Informationen aus klinischen Proben zu gewinnen, und dass sie an eine Vielzahl von Genomen angepasst werden können, auch über ein panelbasiertes Design hinweg.
Die phylogenetische Analyse der erfolgreich angereicherten C. trachomatis-Genome zeigte, dass sich die Mehrzahl der Proben aus Buenos Aires innerhalb der ompA-Genotyp-L2b-Klade gruppiert, was auf eine erfolgreiche Abstammungslinie mit globaler Zirkulation hindeutet. Die Analyse ergab auch das Vorhandensein einer neuen, eigenständigen Abstammungslinie in Argentinien, die LGV verursacht. Die Proben aus dieser Gruppe unterscheiden sich um etwa 600 SNPs von den anderen LGV-Linien, und diese Linie wird als ompA-Genotyp L4 vorgeschlagen (Abbildung 4). Eine detaillierte Beschreibung der in Abbildung 1, Abbildung 2 und Abbildung 4 verwendeten Beispiele finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1.
Diese Ergebnisse unterstreichen den Wert der Zielanreicherung bei der Untersuchung der Erregerdiversität und zeigen einen hohen Grad an Erfolg bei der Genomsequenzierung aus klinischen Proben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Anreicherung von Genomen mittels Zielanreicherung im Vergleich zur direkten metagenomischen Sequenzierung. Der Prozentsatz der On-Target-Reads (%OTR), definiert als der Prozentsatz der Sequenzierungs-Reads, die dem Genom des Zielorganismus zugeordnet werden, zeigt den Grad der Anreicherung, der mit der Zielanreicherung erreicht wird. Die Linie stellt den Median aller Datenpunkte dar, und das Feld gibt den Interquartilsabstand (IQR) von 50 % an. Die Farben der Datenpunkte entsprechen der Probenquelle: Hellblau für Argentinien und Rot für die Schweiz. Der Erfolg der Genomsequenzierung, definiert als Abdeckung &gt;95 % und mittlere Lesetiefe &gt;10, wird durch große Punkte dargestellt, während das Scheitern durch kleine Punkte angezeigt wird. Beachten Sie die unterschiedlichen Maßstäbe auf der y-Achse. Abkürzungen: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Diese Zahl wurde von10 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Korrelation von %OTR aus der Zielanreicherung mit diagnostischen qPCR-Ct-Werten. Die Farben der Datenpunkte stellen die Stichprobenquelle dar: Hellblau für Argentinien und Rot für die Schweiz. Der Erfolg der Genomsequenzierung, definiert als Abdeckung &gt;95 % und mittlere Lesetiefe &gt;10, wird durch große Punkte angezeigt, während das Scheitern durch kleine Punkte dargestellt wird. Beachten Sie die unterschiedlichen Maßstäbe auf der y-Achse. Abkürzungen: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Diese Zahl wurde von10 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Einfluss der Hybridisierungstemperatur auf die Wiederfindung vollständiger Genome über alle bakteriellen STI-Krankheitserreger in zehn Proben. Menschliche DNA im Bereich der in klinischen Proben wurde mit bekannten Konzentrationen von bakterieller Ziel-DNA separat (einzeln) und auch insgesamt versetzt, um eine Probe mit mehreren Infektionen (gepoolt) darzustellen. Es wurden zwei Experimente mit jeweils den fünf Erregern/Kombinationen durchgeführt: 0,01 % und 0,03 %, um den ungefähren Prozentsatz der DNA jedes Mikroorganismus im Verhältnis zur Gesamt-DNA in der Probe darzustellen (die verbleibende DNA entspricht der menschlichen DNA). Die Rückgewinnung von M. genitalium wird bei niedrigeren Temperaturen verbessert. C. trachomatis Die DNA wurde in einer niedrigen Konzentration gespickt; weitere Experimente zeigen, dass die Temperaturen die Wiederherstellung des Genoms von C. trachomatis nicht beeinflussten (Daten nicht gezeigt). Abkürzungen: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Rekombinationsadjustierte Phylogenie von LGV-Stämmen aus Argentinien. Die Analyse umfasst alle verfügbaren LGV-Genome mit veröffentlichten Daten. Zu den Metadaten, die rechts neben der Phylogenie angezeigt werden, gehören doppelte Patientenproben, die Bayes'sche Analyse der Populationsstruktur (BAPS; Cluster = Klade, wobei der polyphyletische BAPS-Cluster 6 die genetische Vielfalt der Population darstellt), die Genomsequenzierungsmethode (Daten aus dieser Studie), der ompA-Genotyp , das Land und das Jahr, wie im Schlüssel oben links angegeben. Fehlende Daten werden weiß dargestellt. Die Genomnamen aus dieser Studie sind für Argentinien hellblau und für Finnland dunkelblau hervorgehoben (nicht durch Zielanreicherung erhalten). Diese Farben werden ausschließlich zur Unterscheidung der in dieser Studie generierten Genome verwendet. Bootstrap-Werte von 1000 ultraschnellen Bootstraps werden als Prozentsätze auf den Hauptzweigen angezeigt. Diese Zahl wurde von13 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Beschreibung der in der Studie verwendeten Materialien, Reagenzien, Instrumente und Geräte. Die Tabelle enthält detaillierte Informationen über den Handelsnamen, den Hersteller und die Katalognummer der Komponenten, die für die DNA-Extraktion, die Bibliothekserstellung, die Zielanreicherung und die Sequenzierung verwendet werden. Es umfasst auch Artikel, die für hauseigene qPCR-Assays und allgemeine molekularbiologische Verfahren verwendet werden. Gleichwertige Alternativen können für Elemente verwendet werden, die mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/Supplementary_Table_1_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Generierung ganzer bakterieller Genome aus klinischen Proben unter Verwendung eines Target Enrichment-Workflows

Obtaining complete genomes of bacterial sexually transmitted infections (STIs) directly from clinical samples is challenging due to the presence of human ...

generating-whole-bacterial-genomes-from-clinical-samples-using-target

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese und Sequenzierung des gesamten Genoms basiert durchzuführen. Außerdem wird ein System zum Austausch DNA in infizierten Zellen beschrieben, die für die genetische Kartierung verwendet werden. Diese Methode ist breit anwendbar zu mikrobiellen Systemen fehlt Transformation Systeme und molekulargenetische Werkzeuge.

Vorwärts Genetische Ansätze in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Dieses Video Artikel beschreibt ein in vitro-Mikroarray-basierte Methode, um die Gen-Targets und Bindungsstellen für Zweikomponentensystem Antwortregulatoren bestimmen.

DNA-Affinitäts-gereinigten Chip (DAP-Chip)-Methode, um Gene für bakterielle Ziele fest, Zwei-Komponenten-Systeme Regulatory

gDNA-Anreicherung für die NGS-Sequenzierung ist ein einfaches und leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von konstitutionellen Mutationen. In diesem Artikel stellen wir das Verfahren vor, mit dem einfach die vollständige Sequenz von 11 Genen analysiert werden kann, die an der Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind.

gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von BRCA1, BRCA2 Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden

Ein integriertes System für die gezielte Next-Generation-Sequenzierung von onkologischen Proben wird beschrieben. Dieses plattformübergreifende System ist für Tumorbiopsien von geringer Qualität und geringen Mengen optimiert, ermöglicht geringe DNA-Eingaben, umfasst gut charakterisierte Mehrvariantenkontrollen und verfügt über einen neuartigen Variantenaufrufer, der auf quantitativen präanalytischen Qualitätskontrollmaßnahmen basiert.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Wir beschreiben eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern zur Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften Extraktion unter Verwendung von 16S rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung. Das Verfahren ermöglicht eine gemeinsame Verarbeitungsansatz für mehrere Probenarten und beherbergt eine Reihe von nachgelagerten analytischen Prozessen.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Dieses Protokoll ist zu erholen und molekulare genetische Charakterisierung der Ebene der einzelligen seltene Zielzellen aus einer Mischung mit Nichtziel-hintergrundzellen vorbereiten. DNA-Qualität entspricht nicht behandelten Einzelzellen und einzellige Anwendung (sowohl Screening basiert und gezielte Analyse) ermöglicht.

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Dieses Manuskript beschreibt ein detaillierte standardisierte Protokoll von Hochdurchsatz-16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung. Das Protokoll stellt eine integrierte, uniformierte Machbare und preiswerte Protokoll Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen ab. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Proben mit strengen Standards und mehrere Steuerelemente.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

Dieses Protokoll beschreibt einen umfassenden Ansatz für die Kultivierung, Sequenzierung und De-novo-Hybridgenomassemblierung von Harnbakterien.   Es bietet ein reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung vollständiger, zirkulärer Genomsequenzen, die bei der Untersuchung sowohl chromosomaler als auch extrachromosomaler genetischer Elemente nützlich sind, die zur Kolonisierung im Urin, zur Pathogenese und zur Verbreitung antimikrobieller Resistenzen beitragen.

Hybride De-Novo-Genomassemblierung zur Erzeugung vollständiger Genome von Harnbakterien unter Verwendung von Kurz- und Langzeitsequenzierungstechnologien

Die klinische Metaproteomik bietet Einblicke in das menschliche Mikrobiom und seinen Beitrag zur Krankheit. Wir nutzten die Rechenleistung der Galaxy-Plattform, um einen modularen bioinformatischen Workflow zu entwickeln, der eine komplexe, massenspektrometriebasierte metaproteomische Analyse und Charakterisierung verschiedener klinischer Probentypen ermöglicht, die für Krankheitsstudien relevant sind.

Ein klinischer Metaproteomik-Workflow, der innerhalb der Galaxy Bioinformatics-Plattform implementiert ist, um Wirt-Mikrobiom-Interaktionen zu analysieren, die menschlichen Krankheiten zugrunde liegen

Die aktuelle Studie beschreibt einen Workflow für die Nanoporensequenzierung von Plasmiden, wenn die chromosomale Sequenz bereits bekannt oder von Interesse ist. Ein anfänglicher Plasmid-DNA-Anreicherungsschritt sorgt für eine optimale Plasmidsequenztiefe und maximiert die Anzahl der pro Flusszelle sequenzierbaren Proben.

Langlesen-Plasmid-Sequenzierung und -Montage mit Workflows auf Basis von Nanoporensequenzierungen

Erfahren Sie, wie Sie ganze bakterielle Genome aus klinischen Proben mittels Target Enrichment sequenzieren. Diese Methode ermöglicht die Genomüberwachung von Chlamydia trachomatis und anderen STI-Erregern trotz hoher menschlicher DNA-Last.

Generierung ganzer bakterieller Genome aus klinischen Proben unter Verwendung eines Target Enrichment-Workflows

Weitere Videos entdecken