Etablierung von In-vitro-Modellen der Kultur der Spinalganglien: Komplementäre Ansätze zur Untersuchung der Krebs-Nerven-Wechselwirkung

Unsere Forschung konzentriert sich auf das Crosstalk zwischen Krebs und Nerven, wobei 3D-Spinalganglien oder DRG-Explantate und dissoziierte 2D-Kulturen verwendet werden, um die neurogesteuerte Tumormigration zu quantifizieren und molekulare Strategien zur Begrenzung ihrer Interaktion zu testen. Mit diesem Protokoll haben wir komplementäre 3D- und 2D-DRG-Kulturen etabliert, das Neuritenwachstum optimiert und eine Zunahme der Invasion von Krebszellen entlang der Neuritenfortsätze nachgewiesen. Wir haben den Mangel an reproduzierbaren Modellen, die sowohl komplizierte Interaktionen auf Zellebene als auch eine intakte Nervenarchitektur erfassen, behoben, indem wir komplementäre 2D- und 3D-DRG-Kulturen aus einer einzigen Maus erstellt haben.

Unser Protokoll liefert gepaarte 3D-Explantate und 2D-Neuronenkulturen von einer einzigen Maus, wobei die eckige Textur erhalten bleibt, High-Content-Bildgebung ermöglicht wird, der Einsatz von Tieren reduziert wird und es uns ermöglicht, Daten auf Gewebeebene und Einzelzelldaten in einem Experiment zu erhalten. Unser Modell warf Fragen darüber auf, welche DRG-erzeugten Faktoren die Invasion antreiben, wie die Aktivität der Neuronen, das Alter und der Genotyp sie beeinflussen und ob die gezielte Ausrichtung auf neurotrophe Faktorrezeptoren die Ausbreitung von Krebs verringern könnte. Legen Sie zunächst eine euthanasierte Maus auf ihren Bauch.

Rasieren Sie das Fell und konzentrieren Sie sich dabei auf den Bereich über der Wirbelsäule, um die Rückenfläche freizulegen. Sprühen Sie 70% Ethanol auf den Rücken des Tieres. Wischen Sie mit Papiertüchern vom Schwanz bis zum Schädel ab, um loses Fell zu entfernen und eine Kontamination während der Sektion zu vermeiden.

Machen Sie mit einer sterilisierten Schere einen geraden Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie vom Schwanz bis zum Schädel. Ziehen Sie die Haut auf beiden Seiten des Schnitts mit einer stumpfen Pinzette zurück, um die Wirbelsäule freizulegen. Verwenden Sie nun eine frische Schere und Pinzette, um eine Kontamination zu vermeiden, und machen Sie einen horizontalen Schnitt am hinteren Ende der Wirbelsäule.

Machen Sie dann zwei parallele Längsschnitte auf beiden Seiten der Wirbelsäule, um sie zu lösen. Heben Sie die Wirbelsäule mit einer Pinzette sanft an und entfernen Sie das umliegende Bindegewebe. Um die Wirbelsäule vollständig zu lösen, machen Sie einen Schnitt an der Spitze der Wirbelsäule in der Nähe des Schädels.

Übertragen Sie die Wirbelsäule auf eine vorgekühlte 10-Zentimeter-Platte, die HBSS mit Penicillin-Streptomycin enthält und auf Eis gehalten wird. Anschließend entfernst du mit einer Federschere das restliche Bindegewebe aus der Wirbelsäule und legst die Wirbel frei. Übertragen Sie die getrimmte Wirbelsäule auf einen Mikroskoptisch.

Teilen Sie die Säule vorsichtig mit einer Federschere entlang der Sagittalebene. Entfernen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze das Rückenmark aus der Säule, um die Spinalganglien entlang der Wurzeln der Spinalnerven freizulegen. Schneide die Spinalnerven mit einer Federschere durch.

Anschließend wird das umliegende Bindegewebe aus den Spinalganglien entfernt. Ziehen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Spinalganglien aus den Dorsalwurzeln. Für die Ganztierkultur legen Sie die DRGs in eine drei Zentimeter große Platte, die HBSS mit Penicillin-Streptomycin enthält, das auf Eis gehalten wird.

Verwenden Sie vorgekühlte Pipettenspitzen, um zwei Mikroliter gekühltes Matrigel in jede Vertiefung eines Glasbodenobjektträgers mit acht Vertiefungen zu geben, der in einer 10 Zentimeter großen Platte auf Eis platziert ist. Um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern, pipettieren Sie jeweils nur einen Tropfen. Als nächstes legst du mit einer Pinzette mit feiner Spitze ein Spinalganglion auf eine trockene Platte.

Vorsichtig schwenken, um überschüssiges HBSS zu entfernen. Übertragen Sie dann das saubere Spinalwurzelganglion in das Matrigel-Tröpfchen. Nachdem Sie alle Ganglien in die Tröpfchen übertragen haben, inkubieren Sie den Objektträger mit Glasboden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten, damit das Matrigel polymerisieren kann.

Geben Sie anschließend vorsichtig 200 Mikroliter warmes, ergänztes Nährmedium in jede Vertiefung. Inkubieren Sie den Objektträger bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Verwenden Sie die Hellfeldmikroskopie, um die Spinalganglien täglich auf neuronales Wachstum und Lebensfähigkeit zu überwachen.

Ein konisches 15-Liter-Röhrchen mit gepoolten Spinalganglien wird fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 g zentrifugiert. Spülen Sie die Ganglien nach dem Pipettieren des HBSS mit vorgewärmtem Ergänzungsmedium und klopfen Sie vorsichtig ab. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen fünf Minuten lang bei 200 G, um die DRGs zu pelletieren.

Ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter Papainlösung. Schonend mischen und bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator 20 Minuten lang inkubieren, dabei alle fünf Minuten vorsichtig umrühren. Fügen Sie dann 10 Milliliter ergänztes Medium hinzu, um das Papain zu neutralisieren, und mischen Sie es vorsichtig.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 400 g, um die Spinalganglien zu pelletieren. Nach dem Pipettieren des Überstands wird ein Milliliter Kollagenase Typ IV in Dispase II-Lösung gegeben und erneut inkubiert. Fügen Sie 4,5 Milliliter ergänztes Medium hinzu, um die Enzymlösung zu neutralisieren, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie.

Nach dem Pipettieren des Überstands werden fünf Milliliter ergänztes Medium zugegeben. Fügen Sie dann Dnase I hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Die Spinalganglien sollten nun als lockerer Klumpen erscheinen, was auf eine vollständige Verdauung hinweist.

Für die mechanische Dissoziation verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Filterpipettenspitze, um die Ganglienlösung zu verreiben, indem Sie vier- bis fünfmal auf und ab pipettieren. Wechseln Sie zu einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze und wiederholen Sie die Verreibung, indem Sie vier- bis fünfmal pipettieren. Die entstandene trübe Suspension wird durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen filtriert.

Spülen Sie dann das Sieb nach und nach mit 10 Millilitern Medium aus, um einen vollständigen Transfer der Zellen zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie die gefilterte Zellsuspension fünf Minuten lang bei 1.000 g, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie das Medium aus dem Pellet und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern ergänztem Medium.

Entfernen Sie alle PBS-Reste aus den Vertiefungen des Acht-Well-Glasbodenschiebers. Verteilen Sie die dissoziierte Suspension der Spinalganglien in die kollagenbeschichteten Vertiefungen und inkubieren Sie. Verwenden Sie die Hellfeldmikroskopie, um die aus den Spinalganglien abgeleiteten Zellen täglich zu überwachen und die Zellviabilität und das neuronale Wachstum zu beurteilen. Für die Co-Kultivierung der gesamten Mausganglien mit Krebszellen aspirieren Sie zunächst das Medium aus den DRG-Kulturen auf dem Acht-Well-Objektträger mit Glasboden.

Geben Sie mit einer Pipette vorsichtig 200 Mikroliter der Krebszellsuspension in die Vertiefung, die das Matrigel-Tröpfchen und die Spinalganglien enthält. Inkubieren Sie den Co-Kultur-Objektträger in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Frischen Sie das Medium täglich auf, indem Sie es einmal mit 200 Mikrolitern erwärmtem Ergänzungsmedium waschen und 300 Mikroliter frisches Medium hinzufügen.

Für die Co-Kultur der dissoziierten Ganglien und der Krebszellen aspirieren Sie das Medium aus den dissoziierten DRG-Kulturen auf dem Acht-Well-Glasbodenobjektträger. Verteilen Sie dann vor der Inkubation vorsichtig 200 Mikroliter der Krebszellsuspension in jede Vertiefung. Die Etablierung von DRG war ohne Supplemente weniger effizient und die Neuritenverlängerung war deutlich reduziert.

Whole-Mount-DRGs von älteren Tieren erzeugten weniger üppige und besser unterscheidbare Neuritenerweiterungen und minimale Gliazellen, was die Visualisierung von Interaktionen zwischen Nervenkrebszellen erleichtert. Die Dissoziation von DRG-Neuronen in zwei enzymatischen Schritten führte zu einer höheren Neuronenrückgewinnung. Innerhalb von 24 Stunden nach der Kultivierung wurden nicht-neuronale Zellen wie Schwan-Zellen, Makrophagen und Fibroblasten sichtbar, während Neuriten, die aus DRG-abgeleiteten Zellen sprießen, beobachtet wurden und nach 72 Stunden weiter anstiegen.

Krebszellen, die in Matrigel-beschichteten Transwell-Inserts ausgesät wurden, drangen nach 24-stündiger Inkubation in Richtung HEC293-Zellen ein, aber nicht in Richtung DRG-Neuronen. Ganzmount-DRG-Kulturen, die in ein Matrigel-Tröpfchen getaucht wurden, ermöglichten die Neuritenausdehnung nach außen durch die Matrix in Richtung Peripherie. Mit sorgfältiger Positionierung des DRG mittig im Tröpfchen, um eine maximale Neuritenausdehnung zu gewährleisten, ohne die Grenzen zu überwachsen.

Krebszellen siedelten sich nach 12-stündiger Co-Kultur an der Grenze des Matrigel-Tröpfchens an, das das DRG enthält. Nach 72 Stunden Co-Kultur waren Krebszellen in das Matrigel eingedrungen und hatten sich in Richtung des Ganglion bewegt, wobei eine direkte Interaktion zwischen den Zellfortsätzen der Spinalganglien und den Krebszellen beobachtet wurde. Die Co-Kultur von dissoziierten DRG-abgeleiteten Zellen mit Krebszellen ermöglichte eine detaillierte Visualisierung einzelner Zellinteraktionen.