Herstellung einer erweiterbaren Gehirnmatrix, die über Entwicklungsstadien hinweg anpassbar ist

Herstellung einer erweiterbaren Gehirnmatrix, die über Entwicklungsstadien hinweg anpassbar ist, von Chapman und Kollegen an der University of Kentucky in Lexington, Kentucky. Die Entwicklung des Ferkelhirns ähnelt in mehreren Aspekten der eines menschlichen Gehirns. Im Vergleich zu Ratten und Mäusen ist das Verhältnis des Gehirngewichts der Ferkel von der Geburt bis zur Reife viel näher wie bei Menschen, und die funktionellen Bereiche von Ferkeln sowie menschlichen Gyri- und Cephal-Gehirnen sind sehr ähnlich.

Aus diesen Gründen nimmt der Einsatz von Schweinen und anderen großen Säugetieren in der neurowissenschaftlichen Forschung zu. Kommerzielle Hirnmatrizen für größere Säugetiere sind jedoch teuer, und die Auswahl ist oft auf eine einzige Größe oder Ebene der Schnitte beschränkt. Folglich bieten kommerzielle Matrizen möglicherweise keine gute Übereinstimmung für verschiedene Stämme, sowohl männlich als auch weiblich, sowie für unterschiedliche Altersgruppen.

Dies ist besonders problematisch für entwicklungsneurowissenschaftliche Studien, in denen sich die Gehirngrößen mit dem postnatalen Wachstum deutlich verändern. Zum Beispiel wachsen die Gehirne von Ferkeln in den ersten drei Monaten schnell und vergrößern ihr Volumen um mehr als das Dreifache. Die kommerzielle Ferkel-Gehirnmatrix ist so konzipiert, dass sie Gehirne von Ferkeln bis zu einem Alter von zwei Wochen aufnehmen kann.

Hier stellen wir eine auf Acrylplatten basierende, anpassbare Matrizenbaumethode als kostengünstige und einfach umsetzbare Lösung für dieses Problem vor. Für dieses Experiment wurden vier naive, vier Tage alte Schweine beschafft. Eine wurde mit fünf Tagen zur Gehirnentnahme verwendet, zwei mit 32 Tagen und eine mit 38 Tagen.

Nach der Entfernung des Gehirns aus dem Schädel wurde das Gehirn zwei Tage lang mit 10%-gepuffertem Formalin in eine 30%ige Saccharoselösung fixiert und für fünf Tage zur Kryokonservierung in eine 30%ige Saccharoselösung gelegt. Als Nächstes werden wir vorstellen, wie man mit Agarose-Gel einen Abguss des Gehirns anfertigt. Der erste Schritt zur Herstellung der Matrix besteht darin, eine Form des Gehirns zu machen.

Wir werden den Prozess zur Herstellung einer Form eines postnatalen Ferkelhirns am fünften Tag veranschaulichen, mit dem eine sagittale Matrix erstellt wird. Legen Sie einen Streifen robustes Plastik am Boden des Glasbehälters und lassen Sie beide Enden aus den Rändern des Behälters herausragen. Dieser Streifen erleichtert die Extraktion des Agarose-Blocks.

Tauchen Sie den Behälter etwa halb in einen Eimer mit nassem Eis. In einem Glasbecher werden 150 Milliliter PBS auf 90 Grad Celsius erhitzt und sechs Gramm Agarose unter ständigem Rühren hinzugefügt. Gießen Sie langsam die 4%ige Agaroselösung, um eine Schicht von einer halben bis einem Zentimeter Dicke am Boden des Behälters zu erzeugen und ihn erstarren zu lassen.

Beschichten Sie das Gehirn vollständig mit einer dünnen Schicht Mineralöl, um zu verhindern, dass die Agarose an der Gehirnoberfläche bindet oder in den Sulci eingeschlossen wird. Das Öl macht es außerdem viel leichter, das Gehirn aus dem Agarosegel zu entfernen. Nach der Beschichtung wird das Gehirn auf die dünne Schicht Agarose in der gewünschten Ausrichtung für eine koronale oder sagittale Form so gerade und aufrecht wie möglich platziert.

Lassen Sie die Agaroselösung auf 50 Grad Celsius abkühlen, während Sie ständig umrühren, um eine gießbare Viskosität zu erhalten. Dann gießen Sie die Agaroselösung über das Gehirn, bis sie vollständig eingebettet ist. Lass die Agarose bei Zimmertemperatur fest werden.

Schneiden Sie die Agaroseschicht über dem Gehirn mit einer chirurgischen Sonde, indem Sie der Hirnumrisse folgen. Sobald der Schnitt rund um das Gehirn abgeschlossen ist, benutzen Sie einen dünnen Pfannenwender, um vorsichtig die oberste Schicht der Agarose abzuheben. Achten Sie darauf, das Gehirn während dieser Schritte nicht zu schneiden oder zu verletzen.

Entferne vorsichtig das ganze Gehirn aus der Form. Es sollte relativ leicht herauskommen, weil das Mineralöl früher auf die Oberfläche aufgetragen wurde. Entfernen Sie alle kleinen Stücke Agarose-Gel, die in den Abdruck gefallen sein könnten.

Erhitze 98 Milliliter PBS in einem Becher auf 9 Grad Celsius und füge vier Gramm Agarose und zwei Milliliter Indische Tinte hinzu. Rühre gut um. Gieße diese schwarze Agaroselösung in den vom Gehirn erzeugten Abdruck und achte darauf, dass der Abdruck nicht überläuft.

Lass das schwarze Gel fest werden. Halten Sie beide Enden des Plastikstreifens fest und heben Sie den gesamten Agaroseblock aus dem Behälter. Wir zeigen Ihnen nun, wie Sie Vorlagenplatten für Ihre Matrix erstellen.

Um die Gehirnform zu schneiden, legen Sie ein Stück Skalenpapier zwischen zwei 76-Millimeter-transparente Acrylplatten und legen Sie sie nahe an den Rand des Tisches. Dann verwenden Sie Klemmen, um vier Eckquadrate und zwei Acrylplatten zu sichern, um zwei Wände zu bauen, die die Agaroseblöcke fest in der gewünschten Ausrichtung halten. Die vorderen Kanten der beiden Metalleckquadrate und der beiden vertikalen Acrylplatten sollten entlang einer Seite des Skalapapiers ausgerichtet sein.

Platzieren Sie den Agarosegelblock so, dass die zu schneidende Kante entlang des Skalenpapiers und mit den Kanten der vertikalen Acrylplatten und Eckquadrate ausgerichtet ist, und legen Sie ein Gewicht auf die gegenüberliegende Seite des Agaroseblocks, um ihn in Position zu halten. Schneide überschüssiges Werk vom Block ab, bis der India-Tinten-Hirngips kurz davor ist, abgeschnitten zu werden. Bewegen Sie den Agarose-Block in den gewünschten Schritten, zum Beispiel zwei oder fünf Millimeter mit Hilfe der Markierungen auf dem darunterliegenden maßstabsbasierten Papier.

Greifen Sie die Klinge mit beiden Händen fest und führen Sie sie an den vorderen Kanten von Acrylplatten und Eckquadraten entlang, um den Block zu schneiden. Lege jede Scheibe auf ein zweites Blatt Schuppenpapier und drücke fest nach unten, um einen Abdruck auf das Papier zu übertragen. Mit einem Stift umreißen Sie die gesamte Scheibe.

Entfernen Sie die Scheibe und umrissen Sie die Gehirnkontur, die mit der Indischen Tinte identifiziert wird. Beachten Sie die Ausrichtung der ersten Scheibe auf dem Skalenpapier, zum Beispiel posterior und anterior bei sagittalen Schnitten, und halten Sie sie konstant, wenn während des Prozesses zusätzliche Gelscheiben dem Papier hinzugefügt werden. Nummerieren sie jeweils nacheinander.

Schneiden Sie die Acrylplatten auf 10 mal 8 1/2 Zentimeter ab. Dann stapeln Sie sie und befestigen Sie sie mit Eckecken und Klemmen an der Bühne einer Bohrmaschine. Bohren Sie drei Löcher durch den Stapel mit den im Manuskript angegebenen Koordinaten.

Entferne die Schutzfolie von den Acrylplatten. Dann legen Sie eine Acrylplatte über eine Schablone auf das Maßstabspapier und richten Sie die oberen Linien der Acrylplatten an den oberen Rändern der Vorlage aus. Zeichnen Sie die Umrisse des Gehirns mit einem Permanentmarker auf die Acrylplatte.

Beschrifte jede Platte so, dass sie der Nummer der Vorlage oder der Gehirnverfolgung entspricht. Mit der Bandsäge schneiden Sie jede Platte entlang der kopierten Schablonelinien. Alternativ kann ein Drehwerkzeug mit Holzschnitzspitze verwendet werden, um unerwünschte Bereiche zu entfernen.

Polieren Sie die Schneide mit einem Drehwerkzeug mit einer Schleifspitze zum Polieren, um die Kanten zu glätten, da scharfe Kanten das Gehirn beim Schneiden schädigen können. Überprüfe die Schnittgenauigkeit erneut, indem du die Acrylplatte über die Vorlage legst. Trimmen und polieren Sie bei Bedarf.

Als Nächstes werden wir die Montage der Platten veranschaulichen. Bauen Sie die Matrix vor, indem Sie die Platten nacheinander stapeln, und überprüfen Sie die Ausrichtung der Platten. Die Matrix-Montage beginnt damit, drei lange Edelstahlbolzen durch die erste Acrylplatte zu führen und dann auf jede Schraube eine Unterlegscheibe zu setzen.

Setzen Sie die zweite Platte ein und fügen Sie Unterlegscheiben an jede Schraube hinzu. Alternativ können die Unterlegscheiben mit Sekundenkleber um die Verankerungslöcher herumgeklebt werden, um zu vermeiden, dass die Unterlegscheiben bei jeder Montage einzeln angebracht werden müssen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Platten nacheinander an die Schrauben angebracht sind.

Ziehe alles mit einer Mutter an jeder Schraube an. Führen Sie ein letztes Polieren der zum Gehirn ausgerichteten Ränder durch, um einen sanfteren Übergang von Platte zu Platte zu schaffen. Verwenden Sie verschiedenfarbige Marker, um die obere Kante der Acrylplatten mit abwechselnden Farben zu färben, um das Schneiden deutlich zu erleichtern.

Hier wechselten wir schwarze, rote und unmarkierte Kennzeichen ab. Abschließend werden wir den Prozess demonstrieren, um das Gehirn entweder in der koronalen oder sagittalen Ebene zu schneiden. Um das Gehirn zu schneiden, platziere es in der Matrix in der gleichen Ausrichtung wie beim Formprozess und so gerade wie möglich.

Du brauchst eine breite, flache Klinge, um das Gehirn zu durchtrennen. Die breite Klinge begrenzt die Möglichkeit von Verdrehungen oder Verbiegungen während des Schneidens. Wir empfehlen eine hochprofilige Kryostat-Klinge.

Zur Sicherheit wickeln Sie etwa zwei Zentimeter lange eines Enden der Klinge mit Laborklebeband, um einen Platz zu schaffen, in dem das umwickelte Ende beim Schneiden des Gehirns sicher gehalten wird. Ein Hinweis zur Warnung. Da jeder Teil des Gehirns nach der Formalinfixierung unterschiedliche Texturen hat, sollte vorsichtig geachtet werden, gleichmäßigen Druck auf die Klinge auszuüben.

Außerdem ist das Gehirn des Ferkels groß, daher ist es besser, mit einer schneidenden Bewegung das Gehirn zu schneiden als mit einem direkten, nach unten drückenden Schnitt. Die Klinge sollte mit konstanter Kraft von einer Seite zur anderen gezogen werden, wobei man darauf achtet, tief genug nach unten zu gehen, um das gesamte Gehirn durchzuschneiden. Geben Sie alle Scheiben in eine mit PBS gefüllte sechsfache Platte oder ein Edelstahlblech.

Leg die Scheiben vorsichtig in das Tablett, bewahre die Reihenfolge und Ausrichtung der Scheiben und bewahre oder fahre je nach Bedarf weiter. Um die Geometrie anzupassen oder die Höhle für eine bessere Passform für das Gehirn zu erweitern, können ausgewählte Acrylplatten entfernt oder hinzugefügt werden, um die Matrix an verschiedene Gehirngrößen anzupassen. Hier veranschaulichen wir die Entwicklung einer sagittalen Matrix, die für ein P5-Ferkelhirn gebaut wurde, indem wir mehrere Platten, hier blau und grün gefärbt, zum mittleren Teil der Matrix hinzufügen.

Die Matrix eignet sich nun für die sagittale Schnitte eines P38-Ferkels. Die Möglichkeit, die Matrix zu vergrößern oder zu verkleinern, erhöht die Flexibilität der Matrix erheblich und kann sowohl Materialien als auch Aufwand sparen. Wie beim koronalen Schneiden schneiden Sie das Gehirn vorsichtig in der sagittalen Ebene mit aufeinanderfolgenden Platten auf, um die Klinge zu führen.

Das Farbcodierungssystem hilft, die korrekte sequentielle Platzierung der Klinge zu identifizieren, was schwierig ist, wenn die Scheiben dünn sind. Entferne das Gehirn aus der Matrix und ziehe die Scheiben vorsichtig auseinander. Abschließend haben wir eine einfache, kostengünstige und flexible Methode entwickelt, um Gehirnmatrizen für Neugeborene zu erstellen.

Dieses Konzept lässt sich auf ältere Schweine und andere Großtiermodelle anwenden.