Ein Open-Source-Normotherm-Perfusionssystem, das für Forschungswissenschaftler entwickelt wurde

Die Mikroumgebung des menschlichen Tumors ist ein lebendiger, sich entwickelnder Komplex, der auf Störungen durch Medikamente auf eine Weise reagiert, die auf zellulärer Ebene schwer vorherzusagen ist. Unser Ziel war es, die Mikroumgebung des menschlichen Tumors ex vivo unter nahezu physiologischen Bedingungen für detaillierte Befragungen zu erhalten. Die hier vorgestellte Maschine adressiert den Mangel an erschwinglichen normothermen Profusionssystemen für Forschungsanwendungen und ermöglicht iterative Studien für eine große Anzahl gewünschter experimenteller Endpunkte.

Unser Labor wird weiter daran arbeiten, die Maschine weiter zu verkleinern, um das System für immunonkologische und zelltherapeutische Untersuchungen zu ermöglichen. Platzieren Sie zunächst den Trommeltrichter auf der rechten Seite der Arbeitsstation, wobei der Auslauf über die Vorderkante des Tisches hinausragt. Legen Sie einen kreisförmigen Memory-Schaum an den Boden der Trommel, wobei die Membran unter dem Schaum positioniert ist.

Lassen Sie in der Nähe des Auslaufs einen Abstand von vier Zoll für den Abfluss. Legen Sie dann zwei Wasserheizdecken mit dem Verbindungsschlauch in die obere linke Ecke auf die Schaumstoffeinlage und führen Sie einen 3/16-Zoll-Luer-Widerhaken in jeden Schlauch ein. Nehmen Sie ein gefaltetes, steriles, wärmeres Tuch.

Schneiden Sie zwei Millimeter von der Ecke der Falte ab, um ein Auslaufloch zu erhalten, und platzieren Sie es auf der Trommel. Besorgen Sie sich als Nächstes den 3D-gedruckten Auslassverbinder und setzen Sie den Magneten in seine Nut ein. Platzieren Sie diese Baugruppe unter dem Abdecktuch durch den Auslaufauslauf und richten Sie das geschnittene Loch mit dem Loch im Verbinder und dem Magneten aus.

Heben Sie das überschüssige Tuch an, um den Trommeltrichter abzudecken, und sichern Sie es mit Gummibändern oder elastischen Bändern. Falten Sie das überschüssige Tuch über die Oberseite, um eine sterile Barriere zu schaffen. Lege nun den zweiten Wassermantel auf das vollständig gefaltete Tuch.

Nehmen Sie dann ein 30-Zoll-Stück 1/4-Zoll-Schlauch und verbinden Sie das proximale Ende mit dem Auslass an der Basis des Trommeltrichterauslaufs und legen Sie es in der Nähe des Behälterhalters auf, der später angeschlossen wird. Stellen Sie nun die Pumpen auf einen mobilen Wagen, der in der Nähe der linken Seite des Arbeitsplatzes positioniert ist. Positionieren Sie den Ständer in zwei Klemmen direkt hinter den Pumpen, so dass die Klemmen sechs Zoll über den Pumpen angehoben sind.

Besorgen Sie sich außerdem zwei Pumpenköpfe und befestigen Sie sie jeweils in einer der Pumpen. Setzen Sie zwei Oxygenatoren in horizontaler Ausrichtung in die Klemmen am Ständer ein. Verbinden Sie dann den arteriellen und venösen 1/8-Zoll-Gaszuflussschlauch mit dem oberen rechten unteren Anschluss des jeweiligen Oxygenators.

Entfernen Sie nun alle Schläuche aus dem Hämodialyse-Kit, mit Ausnahme der Leitungen, die direkt in den Filter führen. Platzieren Sie eine große Rollenpumpe unmittelbar rechts neben dem Hämodialysefilter für den Blutzufluss. Platzieren Sie dann zwei kleinere Schlauchpumpen rechts von der Blutrollenpumpe für den Dialysatzu- und -abfluss.

Besorgen Sie sich zwei 1/8-Zoll-Schlauchschläuche und führen Sie sie in die weiße Pumpenklemme ein. Befestigen Sie einen 1/8-Zoll-Luer-Innengewinde an beiden Enden jedes Schlauchs. Um den Dialysatbeutel mit dem Filterzufluss zu verbinden, befestigen Sie einen 1/8-Zoll-Schlauch an den Luer-Anschluss am Beutel.

Befestigen Sie einen männlichen 1/8-Zoll-Luer am Ende des Schlauchs und verbinden Sie ihn mit dem Schlauch der Zuflussperistaltikpumpe. Schließen Sie die Zu- und Abflusskreisläufe an die entsprechenden Hämodialysefilteranschlüsse an. Platzieren Sie den Behälter mit den äußeren Messmarkierungen und dem gelben Stecker nach außen in den Behälterhalter.

Schneiden Sie als Nächstes ein 36-Zoll-Stück 5/16-Zoll-Rohr ab. Befestigen Sie einen Y-Anschluss an das distale Ende dieses Schlauchs und verbinden Sie das proximale Ende mit dem Abflussstutzen am Boden des Reservoirs. Schneiden Sie zwei 4-Zoll-Stücke 5/16-Zoll-Rohre ab und befestigen Sie sie jeweils am Ende des Y-Anschlusses.

Verbinden Sie die anderen Enden dieser Rohre mit den horizontalen Zacken der Pumpenköpfe. Schneiden Sie dann zwei 4-Zoll-Stücke 1/4-Zoll-Schlauch ab und verbinden Sie eines mit jedem vertikalen Widerhaken an den Pumpenköpfen. Befestigen Sie das andere Ende an der linken unteren Zinke jedes Oxygenators.

Nehmen Sie nun ein 30-Zoll-Segment aus 5/16-Zoll-Rohren. Schneiden Sie den Schlauch in zwei Hälften und platzieren Sie einen 5/16-Zoll-Y-Verbinder über dem distalen abgeschnittenen Ende. Befestigen Sie das proximale Ende an der Ausflusstülle des venösen Oxygenators.

Befestigen Sie die andere Hälfte wieder an der oberen Widerhaken des Y-Steckers. Schneiden Sie für den seitlichen Probenahmekreislauf ein 2-Zoll-Stück 1/4-Zoll-Schlauch ab. Und dehnen Sie mit einem Nadeltreiber das proximale Ende.

Befestigen Sie diesen Stretchschlauch an der verbleibenden Tülle des 5/16-Zoll-Y-Anschlusses. Verbinden Sie nach dem Anschließen des Küvetten-Shunt-Sensors den horizontalen Teil einer T-Buchse mit einem 1/8-Zoll-Schlauch, der mit einem männlichen Luer ausgestattet ist. Befestigen Sie eine Probenahmeklappe an der senkrechten Seite des T-Verbinders.

Schließen Sie abschließend einen 1/8-Zoll-Luer-Stecker an die andere horizontale Seite des T-Steckers an. Schneiden Sie dann einen 12-Zoll-Schlauch ab und verbinden Sie das proximale Ende mit dem Probenahmeklav. Befestigen Sie einen männlichen 1/8-Zoll-Luer am distalen Ende und verbinden Sie ihn mit einer zweiten T-Buchse.

Befestigen Sie an einer Seite dieses T-Anschlusses einen 1/4-Zoll-Luer-Stecker und verwenden Sie ein zwei Zoll großes Stück 1/4-Zoll-Schlauch, um ihn mit einem Zuflusswiderhaken des Reservoirs zu verbinden. Schließen Sie am distalen Ende des 5/16-Zoll-Schlauchs einen weiteren 5/16-Zoll-Y-Stecker an. Besorgen Sie sich einen ca. 55 Zoll langen 1/4-Zoll-Schlauch und verbinden Sie ihn mit dem oberen Widerhaken des Y-Steckers.

Befestigen Sie für den Hämodialyse-Blutkreislauf einen 1/4-Zoll-Luer an dem distalen Ende des 1/4-Zoll-Schlauchs. Fädeln Sie diesen Schlauch durch die große Rollenpumpe und verbinden Sie ihn mit der Blutzuflussöffnung an der Oberseite des Hämodialysefilters, die durch rot ausgekleidete Schläuche gekennzeichnet ist. Nehmen Sie als Nächstes ein 24-Zoll-Stück 1/4-Zoll-Schlauch und befestigen Sie einen männlichen Luer am proximalen Ende.

Verbinden Sie diesen Schlauch mit der blau ausgekleideten Blutabflussöffnung des Hämodialysefilters. Befestigen Sie dann das distale Ende an der Zuflusstülle des Reservoirs. Nehmen Sie ein 36-Zoll-Stück 1/4-Zoll-Schlauch und dehnen Sie es so, dass es sicher auf den Widerhaken des 5/16-Zoll-Y-Anschlusses passt.

Besorgen Sie sich als Nächstes drei Vierwege-Absperrhähne und verbinden Sie sie in einer linearen Reihenfolge. Befestigen Sie diese Baugruppe an der senkrechten Öffnung einer T-Buchse. Setzen Sie diese Komponente 12 Zoll von der linken Seite des 1/4-Zoll-Schlauchs entfernt ein.

Befestigen Sie dann externe Durchflusssensoren an den 1/4-Zoll-Schlauch unmittelbar hinter der Infusionsstelle des Arzneimittels. Machen Sie einen Schnitt zwei Zoll distal zu den Durchflusssensoren und führen Sie Drucksensoren mit Widerhakenenden in den 1/4-Zoll-Schlauch ein. Platzieren Sie den distalen Teil des Schlauchs in der Mitte des Trommeltrichters.

Schneiden Sie als Nächstes einen 30 Zoll langen 5/16-Zoll-Schlauch ab und verbinden Sie sein proximales Ende mit dem rechten Ausflusswiderhaken des arteriellen Oxygenators. Schneiden Sie diesen Schlauch in der Mitte ab und setzen Sie einen 5/16-Zoll-Y-Anschluss ein. Schneiden Sie dann ein 36-Zoll-Segment eines 1/4-Zoll-Schlauchs ab und verbinden Sie es mit dem Widerhaken des 5/16-Zoll-Y-Steckers.

Bringen Sie den externen Durchflusssensor wieder an. Machen Sie einen Schnitt zwei Zoll flussabwärts und schließen Sie die Drucksensoren an das Schlauchende an, das in der Mitte des Trommeltrichters für den arteriellen Zufluss positioniert ist. Schneiden Sie dann ein 30-Zoll-Stück 1/4-Zoll-Schlauch ab und befestigen Sie einen 1/4-Zoll-Luer am proximalen Ende, um ihn schließlich mit dem Vena-cava-Abfluss der Probe zu verbinden.

Schneiden Sie diesen Schlauch 6 Zoll vom Reservoir ab und befestigen Sie den 1/4-Zoll-Luer an beiden Enden. Stecken Sie eine T-Buchse mit einer Probenahmeklappe an den senkrechten Anschluss. Führen Sie Perfusat gemäß der zuvor beschriebenen Methode in den Kreislauf ein.

Die Probe wieder erwärmen und anschließen und mit der Perfusion beginnen. In den ersten 24 Stunden der Leberperfusion des Schweins betrugen die Flüsse der Leberarterie und der Pfortader durchschnittlich 107 bzw. 501 Milliliter pro Minute, bei stabilen Zuflussdrücken von 80 und 7,1 Millimetern Quecksilber. Die arterielle, portale und venöse Sauerstoffsättigung in der Leber von Schweinen betrug durchschnittlich 95 %, 85 % und 74 %, wobei der pH-Wert bei 7,2 blieb.

Der Glukosespiegel sank stetig. Hämatokrit und Hämoglobin blieben stabil und Kalium sank leicht. Die Leber der Schweine produzierte 41 Milliliter Galle und zeigte eine moderate Laktaterhöhung in der menschlichen Perfusion.

Die arteriellen und venösen Zuflüsse betrugen durchschnittlich 113 und 317 Milliliter pro Minute und die Sauerstoffsättigung erreichte 98 %, 92 % und 86 % in den arteriellen, portalen und Lebervenen. Die menschliche Leber behielt den physiologischen pH-Wert, den stabilen Hämatokrit und das Hämoglobin bei und zeigte einen Glukose- und Laktatanstieg mit einer Gallenproduktion von durchschnittlich 1,4 Millilitern pro Stunde. Die Histologie bestätigte das lebensfähige Leberparenchym und die Tumormorphologie nach der Perfusion.

Ein mobiles Setup ermöglichte die CT-Bildgebung von perfundierten Lebern und lieferte eine röntgenologische Qualität, die mit In-vivo-Scans vergleichbar ist. Das System unterstützte auch die Perfusion von Nieren und Bauchspeicheldrüse mit konservierten glomerulären und Langerhans-Inseln.