Fortschritte bei der metabolischen Profilerstellung von dreidimensionalen Hirntumor-Sphäroiden für das Wirkstoffscreening

Die Forschung zielt darauf ab, die 3D-Zellwurzelbildung für die Untersuchung des Energiestoffwechsels mit der Seahorse-Technologie zu optimieren, wobei der Schwerpunkt auf dem Zellverhalten, der Stoffwechselaktivität und den Arzneimittelreaktionen in unserem klinisch relevanten Modell liegt. Diese Ergebnisse werden die Drug-Casting-Modelle verbessern, indem sie eine genauere Darstellung von Hirntumoren ermöglichen, die Therapiebewertung und die Stoffwechselanalyse für bessere Behandlungsstrategien verbessern. Die Ergebnisse ebneten den Weg für die Untersuchung, wie sich der Energiestoffwechsel in 3D-Sphäroidmodellen verändert, wie Medikamente Auswirkungen auf Stoffwechselwege haben und durch welche Mechanismen metabolische Veränderungen zur Entwicklung einer Tumorresistenz gegen die Therapie beitragen.

Nachdem Sie die gesammelten U87-Zellen in DMEM resuspendiert haben, heizen Sie das unbenutzte Medium auf 37 Grad Celsius vor. Halten Sie die Zellsuspensionen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Basierend auf der anfänglichen Zellzahl verdünnen Sie die Zellsuspension mit DMEM mit 10 % FBS auf ein Endvolumen von 20 Millilitern, um etwa 200.000 Zellen zu erhalten.

Mischen Sie die endgültige Zellsuspension durch wiederholte Inversion gründlich an. Geben Sie langsam 200 Mikroliter der Suspension entlang des Randes jeder Vertiefung in eine transparente 96-Well-Platte mit rundem Boden und extrem niedrigem Aufsatz und verschließen Sie die Platte dann fest mit Parafilm, um ein Auslaufen während der Zentrifugation zu verhindern. Legen Sie die versiegelte Platte in die Zentrifuge und lassen Sie sie zwei Minuten lang bei 200 g laufen, um die Zellen am Boden jeder Vertiefung zu pelletieren.

Nehmen Sie die Platte aus der Zentrifuge. Entfernen Sie vorsichtig den Parafilm und legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Um eine Beschichtungslösung herzustellen, lösen Sie fünf Milligramm Poly-D-Lysin in 50 Millilitern sterilem Wasser auf und mischen Sie die Lösung gründlich, bis sie sich vollständig aufgelöst hat.

Geben Sie 30 Mikroliter der Beschichtungslösung in jede Vertiefung der metabolischen Assay-Platte. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen entstehen, indem Sie die Platte vorsichtig schütteln oder die überschüssige Lösung ansaugen. Inkubieren Sie die Platte mit aufgesetztem Deckel 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, saugen Sie dann die Beschichtungslösung an und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 200 Mikrolitern sterilem Wasser.

Trocknen Sie die Platte mindestens 30 Minuten an der Luft und erhitzen Sie die Platte dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid, um die Beschichtung zu stabilisieren. Geben Sie anschließend 175 Mikroliter vorgewärmtes Medium in jede Vertiefung. Bewahren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem kohlendioxidfreien Inkubator auf, bis sie für den Zellsphäroidtransfer bereit ist.

Übertragen Sie die Sphäroidplatten nach fünf Tagen Kultur in ein High-Content-Bildgebungssystem. Um die Bildgebungsparameter zu konfigurieren, stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius und den Kohlendioxidgehalt auf 5 % ein. Passen Sie den Plattentyp, die Kanäle und den Fokusbereich in den Systemeinstellungen an. Nehmen Sie als Nächstes Sphäroidbilder mit einem konfokalen Mikroskop mit 10-fachen Objektiven und der Bildgebungssoftware auf, identifizieren Sie dann Vertiefungen, die intakte Sphäroide enthalten, und zeichnen Sie deren Positionen für den Transfer auf.

Ordnen Sie die intakten Sphäroide zwei Gruppen zu, eine Kontrollgruppe mit sechs Replikatvertiefungen und eine Behandlungsgruppe mit sechs Replikatvertiefungen für die Fenofibratbehandlung. Bereiten Sie die Fenofibrat-Arbeitslösung in frischem Vorwärmmedium in optimaler Konzentration vor. Entfernen Sie vorsichtig die sphäroidhaltige Platte mit niedrigem Anhaftungsgrad aus dem Bildgebungssystem und legen Sie sie auf eine sterile Oberfläche in einer Biosicherheitswerkstatt.

Positionieren Sie die mit Poly-D-Lysin beschichtete Assay-Platte für den Transfer daneben und schneiden Sie dann die Spitze einer 20-Mikroliter-Pipette ab, um eine sanfte Aspiration der Zellsphäroide zu ermöglichen, ohne Schäden zu verursachen. Saugen Sie mit der getrimmten Pipettenspitze jedes intakte Sphäroid vorsichtig aus dem Boden seiner Vertiefung ab. Übertragen Sie jedes Sphäroid in die entsprechende Vertiefung der beschichteten Platte und lassen Sie es 20 Sekunden lang absetzen.

Übertragen Sie die 3D-Sphäroid-Assay-Platten auf ein High-Content-Bildgebungssystem. Um die morphologischen Daten zu analysieren, wenden Sie das Texturregionenmodul an, um 3D-Sphäroide grob vom Hintergrund zu trennen, indem Sie den Bildinhalt basierend auf Texturmerkmalen in drei Cluster unterteilen. Wenden Sie das Modul "Bildbereich suchen" an, um die Trennung von vorisolierten 3D-Sphäroiden mithilfe volumenbasierter Größeneigenschaften zu verfeinern und sicherzustellen, dass Verunreinigungen entfernt und intakte Sphäroide erhalten bleiben.

Messen Sie die morphologischen Parameter der 3D-Sphäroide mit dem Modul Morphologieeigenschaften. Wenden Sie das Modul "Population auswählen" an, um nur echte 3D-Zellsphäroide zu filtern und beizubehalten, und exportieren Sie dann die morphologischen Datenergebnisse. Die Sphäroide wurden am fünften Tag der Kultur sichtbar gebildet, wobei eine einheitliche sphärische Morphologie über alle beobachteten Proben hinweg beibehalten wurde.

Auch am fünften Tag wurde ein desintegriertes Sphäroid mit sichtbar gestörter struktureller Integrität beobachtet. Die Post-Transfer-Analyse zeigte, dass sowohl die Kontroll- als auch die mit Fenofibrat behandelten 3D-Sphäroide in den meisten Fällen intakt blieben, aber einige mit Fenofibrat behandelte Sphäroide zerfallen waren. Die Sauerstoffverbrauchsrate war bei mit Fenofibrat behandelten Sphäroiden über alle Zeitpunkte hinweg im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant reduziert.