Nachweis zielgerichteter Veränderungen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs mittels Next-Generation-Sequencing
10. Oktober 2025
Dieses Protokoll beschreibt einen automatisierten, ISO15189-akkreditierten Next-Generation-Sequencing-Workflow zum Nachweis zielgerichteter genomischer Veränderungen in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben des nicht-kleinzelligen Lungenkrebses (NSCLC).
Meine Forschung entdeckt genetische Mutationen bei Krebs, um Diagnose und Behandlung zu verbessern. Um zu beginnen, registrieren Sie die Probeninformationen im Laboratory Information Management System und füllen Sie das Informed Consent-Formular für Genmutationstests aus. Mit Einweg-Mikrotom-Klingen wurden Schnitte aus nicht-kleinzelligem Lungenkrebs geschnitten, formelle und fixierte Paraffinprobe geschnitten.
Anschließend führen Sie routinemäßige Hämatoxylin- und Eosinfärbungen durch, um den Tumorzellinhalt zu bewerten. Für die Nukleinsäureextraktion wird mit einem Mikrotom der formale und mit fest eingebettete Paraffinblock geschnitten, um ein Band zu erhalten, und das Band in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr gelegt. Übertragen Sie das Rohr an den vorgesehenen Eingangsort der Probe auf dem automatisierten Extraktionsinstrument.
Als Nächstes verwenden Sie ein automatisches Extraktionsinstrument mit einem automatischen Extraktionsset. Ersetzen Sie manuelle Pipettierungsschritte durch ein automatisches magnetisches Perlenextraktionssystem. Wählen Sie dann das C1102-Programm auf dem Instrument aus.
Wähle die Inkubationszeit für das Entwachsen der Probe mit 16 Stunden und stelle das Elucian-Volumen auf 100 Mikroliter. Verwenden Sie Spektrophotometrie, um die DNA-Reinheit zu überprüfen. Anschließend verwenden Sie ein Detektionskit mit sequenzspezifischen fluoreszierenden Farbstoffen, um einen fluorometrischen Test für eine präzise DNA-Konzentrationsmessung durchzuführen.
Um fragmentierte genomische DNA mittels Ultraschalltechnik herzustellen, mischen Sie 200 Nanogramm genomische DNA in 50 Mikrolitern Puffer mit niedrigem Tris-EDTA. Stellen Sie das Probenröhrchen in ein vorgekühltes Probengestell, das bei acht Grad Celsius gehalten wird. Stellen Sie die Instrumentenparameter gemäß dem Protokoll ein und starten Sie die DNA-Fragmentierung.
Um die automatische Bibliotheksvorbereitung zu starten, drücken Sie den Power-Knopf, um das System zu aktivieren, und warten Sie auf Abschluss der Initialisierung. Navigiere zur Programmeinstellung, wähle Run-Protokoll und wähle Protokoll BurningRock HS. Stellen Sie den Probentyp auf hochwertige DNA ein, die Eingabemenge auf 50, die Pre-PCR-Zyklen auf 12 und die Post-PCR-Zyklen auf 12. Dann klicke auf Laufen, um fortzufahren.
Dann wird die vorverpackte Reagenzkartusche in den vorgesehenen Schlitz des Instruments eingesetzt, der automatisch die Erstattung und den Status des Reagenzes überprüft. Nachdem die Proben geladen wurden, drücken Sie Start, um den autonomen Lauf zu starten. Beobachten Sie die LED-Anzeigen am System, um den Fortschritt zu überwachen.
Nach Ende des Programms klicken Sie auf OK, um zu bestätigen, und das System überträgt automatisch die letzte Bibliothek in die Bibliotheksröhre, womit die Bibliotheksvorbereitung abgeschlossen ist. Missen Sie die Konzentration sowohl der Präbibliothek als auch der Gesamtbibliothek mittels Fluorometrie. Verdünnen Sie die Sequenzierungsbibliothek auf 1,6 Pikomolar und 1300 Mikroliter für Sequenzierungsoperationen.
Kontrollieren Sie die Sequenzumgebung, indem Sie eine Innentemperatur und Luftfeuchtigkeit halten. Vollständige Qualitätskontrolle der Instrumentenausgabedaten durch Überprüfung der Basisqualität oberhalb von Q 30 und Cluster-Dichte-Durchgangsfilter. Der optimierte Detektionsworkflow identifizierte zuverlässig mehrere klinisch umsetzbare genomische Veränderungen in repräsentativen Tumorproben.
Die Sequenzierungsergebnisse zeigten ein hochfrequentes EGFR p. L858R-Missense-Mutation, begleitet von einer signifikanten EGFR-Gen-Kopienzahl-Amplifikation. Eine moderate Amplifikation des MET-Gens wurde beobachtet, eine niedrige Amplifikation des BRAF-Gens.
Die Probe zeigte eine intermediäre Tumormutationslast und einen mikrosatellitenstabilen Status. Alle gezielten Genloci, darunter ALK, BRAF, KRAS und ROS1, erreichten eine Nachweisrate von 100 % über vier Replikationsexperimente. Jede Mutation wurde in allen vier wiederholten Experimenten konsistent nachgewiesen, wobei die erwarteten Häufigkeitswerte im normalen Fluktuationsbereich blieben; NJS liefert ein kompressives genetinisches Profil für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, indem gemeinsame, seltene und neuartige Gene gleichzeitig erkannt werden.
Unsere zukünftige Forschung wird sich darauf konzentrieren, molekulare Pathologie mit künstlicher Intelligenz zu kombinieren, um neue Biomarker für Lungenkrebs zu erforschen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Überblick
Dieses Protokoll beschreibt einen automatisierten, ISO15189-akkreditierten Next-Generation-Sequencing-Workflow zur Erkennung von targetablen genomischen Veränderungen in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC). Der Prozess umfasst die Probenregistrierung, Sektionierung und die Nukleinsäureextraktion.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Onkologie
- Genomik
- Pathologie
Hintergrund
- Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) ist eine häufige Form von Lungenkrebs.
- Die Identifizierung genomischer Veränderungen ist entscheidend für zielgerichtete Therapien.
- Formalinfixiertes, paraffineingebettetes Gewebe wird häufig in der Krebsforschung verwendet.
- Automatisierte Workflows können die Effizienz und Genauigkeit bei genomischen Tests verbessern.
Zweck der Studie
- Einen zuverlässigen Sequenzierungs-Workflow für NSCLC-Proben zu etablieren.
- Die Erkennung von targetablen genomischen Veränderungen zu verbessern.
- Die Einhaltung der ISO15189-Standards zu gewährleisten.
Verwendete Methoden
- Registrierung von Probeninformationen im Laborinformationsmanagement-System.
- Sektionierung von formalinfixierten, paraffineingebetteten Proben mit Mikrotomklingen.
- Durchführung einer routinemäßigen Hämatoxylin- und Eosin-Färbung zur Bewertung des Tumorzellgehalts.
- Extraktion von Nukleinsäuren mit einem automatisierten Extraktionsinstrument.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Extraktion von Nukleinsäuren aus NSCLC-Proben.
- Erhalt hochwertiger genomischer Daten für targetable Veränderungen.
- Der Workflow hat die Einhaltung der ISO15189-Akkreditierung gezeigt.
- Verbesserte diagnostische Möglichkeiten für die NSCLC-Behandlung.
Schlussfolgerungen
- Der automatisierte Sequenzierungs-Workflow ist für NSCLC effektiv.
- Die Einhaltung von ISO15189 erhöht die Zuverlässigkeit der Ergebnisse.
- Dieses Protokoll kann für andere Krebsarten angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Comprehensive detection of actionable genomic alterations in non-small cell lung cancer (NSCLC) is critical for precision oncology and portfolio advancement. Automated, ISO15189-certified next-generation sequencing (NGS) workflows enable high-confidence identification of mutations, fusions, and amplifications, supporting robust target validation and risk-adjusted decision-making. Standardized, reproducible NGS processes reduce technical variability and accelerate translational research integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise identification of driver mutations and gene amplifications for functional target validation.
- Supports biological de-risking by detecting both common and rare genomic alterations in NSCLC samples.
- Facilitates predictive confidence in target selection through rigorous quality control and replicate concordance.
Screening & Assay Development
- Prepares validated genomic profiles for downstream compound screening and biomarker assay development.
- Standardizes sample processing and library preparation to ensure reproducibility and quantitative reliability.
- Automated workflows minimize human error, supporting scalable and high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant biomarkers for translational continuity in NSCLC research.
- Enables risk-adjusted advancement by providing comprehensive mutation and amplification data for preclinical models.
- Supports integration of molecular pathology and emerging biomarker discovery for future translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
This NGS workflow bridges early discovery, target validation, and translational research by delivering high-fidelity genomic data from clinical NSCLC samples.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing and pathway clarification through comprehensive mutation detection.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative genomic outputs suitable for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Generates high-quality, statistically validated readouts for cross-condition comparison and decision support.
- Translational Research: Ensures biomarker alignment and continuity from discovery through preclinical validation in NSCLC.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for ongoing molecular profiling across oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and rigorous QC.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing reliable genomic data for portfolio triage.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of NSCLC and other oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular pathology, NGS instrumentation, and bioinformatics analysis.
- Demands access to automated extraction and library preparation systems with validated protocols.
- Necessitates cross-team standardization for sample input, QC thresholds, and data interpretation.
- Must adapt protocols for varying tumor cellularity and FFPE sample quality.
- Turnaround time and technical complexity remain practical considerations for clinical and translational deployment.
