Modellierung mitochondrialer Erkrankungen anhand von Hirnorganoiden: Ein Fokus auf mitochondriale Enzephalomyopathie, Laktatazidose und schlaganfallähnliche Episoden
10. Oktober 2025
Hirnorganoide dienen als wertvolles Modell für Studien zu mitochondrialer Enzephalomyopathie, Laktatazidose und schlaganfallähnlichen Episoden (MELAS), indem sie Einblicke in ihre zugrunde liegende Pathophysiologie bieten und eine Plattform für das Wirkstoffscreening bieten. Organoide, die aus Zelllinien mit unterschiedlichem Grad an Heteroplasmie von krankheitsverursachenden Genen stammen, weisen signifikante phänotypische Unterschiede auf.
Der Umfang unserer Forschung besteht darin, Messgeräte für mitochondriale Erkrankungen zu verstehen und Medikamente zur Behandlung zu finden. Die Herausforderung besteht darin, die Fähigkeit für Hochdurchsatz-Assays zu erhalten, obwohl die Technik die Bildung von Organoiden enthält. Zu Beginn werden Sie das Medium von induzierten pluripotenten Stammzellkulturplatten entfernt, wenn diese etwa 70 bis 80 % konfluent sind.
Wasche die Zellen mit PBS. Gib 350 Mikroliter Enzymlösung zu den Zellen und inkubiere sie. Füge 800 Mikroliter Stem-Fit-Medium hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
Nachdem die Zellsuspension in ein frisches Rohr übertragen wurde, zentrifugieren Sie sie bei 190 G für fünf Minuten bei 22 Grad Celsius. Anschließend wird das Pellet in einem Milliliter Differenzierungsmedium wieder suspendiert. Nach der Zählung der Zellen werden 3000 Zellen in 100 Mikrolitern in jede Mulde einer U-förmigen 96-Wellen-Platte mit niedriger Befestigung gesaat.
Inkubieren Sie sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation verwenden Sie eine Breitrohrpipette, um die Organoide von der 96-Well-Platte in eine 10-Zentimeter-Schale zu übertragen. Pipett 50 Mikroliter ergänztes DMEM/F12-Medium in jede Mulde einer neuen 96-Well-Platte.
Sammeln Sie die Organoide in zwei Milliliterröhren. Entferne das Medium vorsichtig, ohne die Organoide zu aspirieren, und gib 1,5 Milliliter zugefügtes DMEM/F12-Medium hinzu. Nach dem Pipettieren der letzten Wäsche fügen Sie 500 Mikroliter frisches Medium hinzu.
Dann überträgt man die Organoide in eine 10 Zentimeter große Schelle. Fügen Sie fünf Milliliter Medium hinzu, um das Picken jedes Organoids zu erleichtern. Übertragen Sie alle Organoide mit einer auf 50 Mikroliter eingestellten Mikropipette in jede Mulde einer 96-Bohrloch-Platte und inkubieren Sie sie drei Tage lang.
Am neunten Tag sammeln Sie die Organoide in zwei Milliliter-Röhrchen und waschen Sie dreimal mit DMEM/F12. Dann werden die Organoide im Differenzierungsmedium wieder suspendiert. Übertragen Sie etwa 10 Organoide pro Bohrloch auf eine sechsfache Platte und passen Sie das Endvolumen des Mediums in jedem Bohrloch auf zwei Milliliter an.
Kulturelle die Platte sechs Tage lang statisch bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Am 15. Tag sammeln Sie die Organoide in 15-Milliliter-Röhren. Nachdem die Röhren sich gesetzt haben, fügen Sie nach dem Auslösen des Supernatants ein frisches Differenzierungsmedium mit B27 und Vitamin A hinzu.
Übertragen Sie etwa 10 Organoide pro Bohrloch in eine Sechs-Wellen-Platte. Kultivieren Sie das Organoid 15 Tage lang statisch bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Überziehen Sie die Kulturplatten mit der verdünnten Poly-L-Ornithin-Lösung.
Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag die Brunnen dreimal für fünf Minuten mit PBS waschen. Gib nun verdünnte Lamininlösung zu den Brunnen.
Inkubieren Sie die Platten drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius oder über Nacht. Zentrifugiere die Organoid-Suspension bei 200 G für fünf Minuten. Entfernen Sie das Supernatant und fügen Sie einen Milliliter Enzymlösung hinzu.
Gut mischen und fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, bevor man zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Supernatants und dem Zufügen eines Milliliters Dispersionslösung schichten Sie die Isolationslösung sorgfältig unter die Suspension. Dann zentrifugiere die Suspension bei 200 G für fünf Minuten.
Jetzt pipettiere einen Milliliter neuronales Medium in das Rohr. Mische die Lösung und führe die Federung durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein 50-Milliliter-Rohr. Nach dem Zählen der Zellen wird die Zellsuspension mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf Poly-L-Ornithin- und Laminin-beschichtete Platten ausgesaat.
Wechsel das Medium alle vier bis sieben Tage bis Tag 60. Um die Organoide für die Immunfluoreszenz zu fixieren, entnehmen Sie sie zunächst in Mikroröhren. Spülen Sie die Organoide mit PBS aus und fixieren Sie sie dann 30 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd bei Zimmertemperatur.
Nach der Fixierung die fixierten Organoide dreimal mit PBS waschen. Lagere die Organoide bei vier Grad Celsius, bis sie verwendet werden. 30 Tage nach der Aussäung für eine 2D-Neuronenkultur entferne das Kulturmedium von den Platten.
Dann waschen Sie die Zellen mit PBS. Fixiere die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Zimmertemperatur. Pipette das Paraformaldehyd aus und wasche die Zellen dreimal mit PBS.
Bewahren Sie die festen Zellen bei vier Grad Celsius auf, bis sie verwendet werden. Um die Organoide für RTQPCR zu sammeln, werden sie in Mikroröhren übertragen. PBS in die Tuben pipetten, um die Organoide zu waschen.
Gib nun 350 Mikroliter Lysispuffer zu den Organoiden und friere sie dann in flüssigem Stickstoff ein. Lagere die Röhren bei minus 80 Grad Celsius, bis sie verwendet werden. Hirnorganoide mit FOXG1-positiven Neuronen wurden am 30. Tag erfolgreich aus der gesunden Kontroll-IPSC-Linie 414C2 induziert, und am Tag 60 wurden 2D-kultivierte neuronale Netzwerke erhalten.
Die Heteroplasmiewerte der M.3243A-zu-G-Variante wurden durch QPCR bestätigt. Linien zwei bis acht hatten eine niedrige Heteroplasmie, die Linien zwei bis sechs eine hohe Heteroplasmie. Hirnorganoide, die aus der niedrigen Heteroplasmie-Linie zwei bis acht stammen, wiesen Größen und Morphologien auf, die denen gesunder Kontrollpersonen ähnelten.
Organoide, die aus der Hochheteroplasmie-Linie zwei bis sechs erzeugt wurden, zeigten eine verringerte Größe von 0,3 Quadratmillimetern und eine unregelmäßige Morphologie mit einem Zirkularitätswert von 0,82. Die meisten Neuronen, die aus der 414C2-Linie und die zwei- bis acht-Linie induziert wurden, waren an den Tagen 30 und 60 FOXG1-positiv. FOXG1-positive Neuronen wurden selten in Organoiden oder 2D-kultivierten Neuronen aus der Zwei- bis Sechs-Linie nachgewiesen.
Unsere Ergebnisse legen nahe, dass patientenbasierte IPSC-basierte Organoid-Modelle eine nützliche Plattform für die Untersuchung von Spiegeln, Mechanismen und für Drogentests darstellen. Unsere konventionellen Methoden mit kurzer Kulturzeit und Kosteneffizienz bieten praktische Werkzeuge zur Untersuchung der Pathophysiologie von MELIS. Wir möchten nach potenziellen Medikamenten für MELIS suchen, indem wir Verbindungen verwenden, deren Patienten in Zukunft organisiert verabreicht werden.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Verwendung von Gehirnorganoiden als Modell für mitochondriale Enzephalomyopathie, laktoazide Azidose und schlaganfallartige Episoden (MELAS). Die Forschung zielt darauf ab, die zugrundeliegende Pathophysiologie von MELAS zu verstehen und die Arzneimittelscreening durch Organoidtechnologie zu erleichtern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Wirkstoffforschung
Hintergrund
- Mitochondriale Erkrankungen sind komplex und schwierig zu untersuchen.
- Organoiden bieten ein relevantes Modell, um diese Erkrankungen zu erforschen.
- Heteroplasmie in krankheitsverursachenden Genen führt zu unterschiedlichen phänotypischen Äußerungen.
- Hochdurchsatzanalysen sind entscheidend für eine effektive Wirkstoffscreening.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Mechanismen mitochondrialer Erkrankungen.
- Identifizierung potenzieller therapeutischer Wirkstoffe für MELAS.
- Nutzung von Organoiden für das Hochdurchsatz-Screening von Wirkstoffen.
Verwendete Methoden
- Kultur von induzierten pluripotenten Stammzellen.
- Techniken zur Organoidbildung.
- Entwicklung von Hochdurchsatzanalysen.
- Phänotypische Analyse von Organoiden.
Hauptergebnisse
- Organoiden weisen signifikante phänotypische Unterschiede basierend auf Heteroplasmiegraden auf.
- Es wurden Erkenntnisse über die Pathophysiologie von MELAS gewonnen.
- Arzneimittelscreening-Plattformen wurden mithilfe von Organoidmodellen etabliert.
- Potenzielle therapeutische Kandidaten wurden identifiziert.
Schlussfolgerungen
- Hirnorganoiden sind wirksame Modelle zur Untersuchung von MELAS.
- Sie liefern wertvolle Erkenntnisse über die Mechanismen mitochondrialer Erkrankungen.
- Diese Modelle erleichtern die Identifizierung neuer therapeutischer Strategien.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Aus patientenabgeleiteten Gehirnorganoiden, die MELAS modellieren, ermöglichen die Aufklärung von Wirkmechanismen und die Entwicklungsrisikominimierung sowie die Validierung von Zielstrukturen für die Arzneimittelforschung bei mitochondrialen Erkrankungen. Diese Plattform unterstützt eine vorhersagekräftige Bewertung in der frühen Screening-Phase, indem sie krankheitsrelevante Phänotypen nachbildet, die mit der mitochondrialen Heteroplasmie verknüpft sind. Der Ansatz verbessert die translationale Durchgängigkeit von der Entdeckung bis zur präklinischen Evaluierung seltener neurologischer Erkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von mitochondrialer Dysfunktion und der Bildung neuronaler Netzwerke in einem für den Menschen relevanten System.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem Heteroplasmie-Level mit phänotypischen Ergebnissen korreliert werden.
- Vereinfacht die mechanistische Absicherung von Hypothesen zu Mitochondrienerkrankungen.
- Bietet eine Plattform zur Vorselektion von Kandidatenzielen basierend auf für die Krankheit relevanten Messgrößen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte Organoid- und 2D-Neuronensysteme für die reproduzierbare Wirkstoffprüfung.
- Ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von Wirkstoffen unter Verwendung dissociierter Neuronen aus patientenabgeleiteten Organoiden.
- Unterstützt die quantitative Beurteilung der Effizienz der neuronalen Induktion und der Netzwerkbildung.
- Bereitet validierte biologische Modelle für skalierbare Screening-Workflows auf.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt die Krankheitsmodellierung mit patientenspezifischen genetischen Hintergründen für die translationale Biomarker-Entwicklung ab.
- Gewährleistet Kontinuität von der auf iPSCs basierenden Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in krankheitsrelevanten Systemen.
- Verringert das translatorische Risiko, indem Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in vitro modelliert werden.
- Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung therapeutischer Kandidaten für mitochondriale Erkrankungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser auf Organoiden basierende Modellierungsansatz verbindet die frühe Entdeckung, die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten und die präklinische Forschung für mitochondriale Erkrankungen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen bei mitochondrialer Dysfunktion in neuralen Geweben.
- Screening: Bietet für Assays vorbereitete, reproduzierbare Systeme zur quantitativen Arzneimittelbewertung.
- Analytik: Ermöglicht die Messung von Organoidgröße, Morphologie, neuronaler Induktion und Netzwerkbildung als quantitative Endpunkte.
- Translationale Forschung: Verbindet genetische Hintergründe von Patienten mit präklinischer Krankheitsmodellierung und der Abstimmung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für mechanistische Untersuchungen und Substanz-Screenings in verschiedenen Programmen zu Mitochondrienerkrankungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Modellierung mitochondrialer Erkrankungen.
- Operativer Wert: Standardisiert Protokolle zur Organoid-Generierung und zur Vorbereitung auf Hochdurchsatz-Screenings.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch und die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühzeitige Risikominderung therapeutischer Hypothesen ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Kandidaten, die auf mitochondriale Erkrankungen abzielen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von iPSCs, der Organoidbildung und der neuronalen Differenzierung.
- Benötigt Zugang zu Zellkultur-, Bildgebungs- und qPCR-Geräten.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg für die Reproduzierbarkeit von Organoid- und 2D-Neuronen-Assays voraus.
- Kann eine Anpassung an verschiedene mitochondriale Varianten oder Krankheitsmodelle erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Kulturdauer, die Quantifizierung der Heteroplasmie und die Skalierbarkeit für große Substanzbibliotheken.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:23
Generation of Cerebral Organoids and Early Differentiation
3:34
Dissociation of Cerebral Organoids and Seeding for 2D Neuronal Culture
5:14
Fixation and Collection of Cerebral Organoids and Cells for Immunofluorescence and RT-qPCR
6:49
Results
8:18
Conclusion
