Charakterisierung der von Adipozyten abgeleiteten extrazellulären Vesikelsekretion mittels eines CD63-GFP-Reporter-Mausmodells in vivo und in vitro

Wir untersuchen von Adipozyten abgeleitete extrazelluläre Vesikel, EVs, um ihre Rolle im Fettgewebe zu definieren, insbesondere wie sie das Übersprechen zwischen reifen Adipozyten und ihren Vorläuferzellen regulieren. Derzeit gibt es keine in-vivo-Systeme zur Untersuchung der EV-Sekrete von Adipozyten, und die bestehenden Reinigungsprotokolle sind noch nicht vollständig optimiert. Zu Beginn verwenden Sie eine sterile Technik, um leistenales Fettgewebe von eingeschläferten Mäusen zu entfernen.

Geben Sie ein Gramm Gewebe in ein Zwei-Milliliter-Rohr mit 0,5 Millilitern Verdauungspuffer. Mit steriler Schere wird das Gewebe in Stücke gehackt, die nicht größer als einen Millimeter sind. Das gehackte Gewebe in 10 Millilitern Verdauungspuffer mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Liberase und 50 Einheiten pro Milliliter DNase I suspendieren. Die Probe bei 37 Grad Celsius auf einem Orbitalshaker inkubieren.

Während der Brutzeit wird das Röhrchen mehrmals sanft umgedreht. Wenn die Lösung trüb erscheint und keine sichtbaren Gewebefragmente mehr übrig sind, ist die Verdauung abgeschlossen. Um die stromale Gefäßfraktion (SVF) zu isolieren, verdünnen Sie die verdaute Suspension mit zwei Volumen Verdauungspuffer.

Drehen Sie das Rohr vorsichtig drei- bis viermal um, damit es gut mischt. Führen Sie die Suspension durch einen sterilen 100-Mikrometer-Filter, um unverdautes Gewebe zu entfernen, und zentrifugieren Sie das Filtrat dann mit 300 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Beschrifte das Pellet als SVF.

Inkubieren Sie die stromale Gefäßfraktion fünf Minuten lang in einem frisch vorbereiteten roten Blutkörperchen-Lysepuffer auf Eis, geschützt vor Licht. Gib zwei Bände Waschpuffer hinzu und zentrifugiere sie mit 400 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Die stromale Gefäßfraktion wird in 80 Mikrolitern Puffer pro Gramm Gewebe wieder suspendiert und der Inhalt in ein neues Rohr übertragen.

Fügen Sie pro Gramm Gewebe 20 Mikroliter Nicht-Adipozyten-Progenitor-Depletionscocktail hinzu. Inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei zwei bis acht Grad Celsius im Dunkeln. Führen Sie die Probe durch eine LS-Säule und sammeln Sie den Durchfluss, der die negative Zellfraktion der Linie enthält.

Zentrifugiere den Durchfluss mit 300 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die Adipozyten-Vorläuferzellen zu erhalten. Inkubieren Sie 250 Mikroliter isolierter Adipozyten-Vorläuferzellen der Maus und Mäusen auf kollagenbeschichtete Objektträger mit acht Brunnen für sechs Stunden. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 10 Minuten, um zelluläre und extrazelluläre Vesikelstrukturen für die Bildgebung zu erhalten.

Wasche die Objektträger dreimal mit PBS und montiere sie dann mit Anti-Fade-Medium. Als Nächstes, nach Zählung der Adipozyten-Vorläuferzellen, suspendieren Sie sie und verdünnen Sie den Lebensfähigkeitsfarbstoff. 20 Minuten auf Eis brüten, geschützt vor Licht.

Wasche die Zellen einmal mit Waschpuffer und Zentrifuge. Die Zellen in einen brillanten Färbepuffer aufhängen, sodass die Endkonzentration 1 Million Zellen pro 100 Mikroliter beträgt. Blockieren Sie die unspezifische Bindung, indem Sie ein Fc-Rezeptor-Blockierungsreagenz im Verhältnis von eins zu 100 hinzufügen und inkubieren.

Lassen Sie den SCA-1-Antikörper bei 6000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius frei drehen. Gib den SCA-1-Antikörper mit einer Verdünnung von 1 bis 100 in das APC-Rohr und lege das Rohr dann auf Eis, geschützt vor Licht. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter Waschpuffer und zentrifugieren Sie dann mit 300g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Die Zellen werden in einem Waschpuffer für die Sortierung der Durchflusszytometrie aufgehängt und anschließend die Daten für SCA-1-positive und GFP-positive Zellen auf einem spektralen Durchflusszytometer mit violettem und blauem Laser erfasst. Um die Differenzierung zu beginnen, bestreichen Sie Gerichte mit 0,2 % Gelatine für 30 Minuten bei Zimmertemperatur. Säe frisch isolierte APCs im ergänzenden DMEM/F12-Medium und brüte bis zur Zusammenfluss aus.

Ersetzen Sie das Medium von Tag eins bis Tag acht durch das MesenCult adipogene Differenzierungsmedium. Am neunten Tag wachen Sie die Adipozyten zweimal mit PBS und ersetzen Sie das Medium durch reife Adipozytenkulturmedium mit DMEM 1 % BSA und 0,2 % Primocin. Um außerzelluläre Vesikel mit Adipozyten zu isolieren, werden zunächst 15 Milliliter Kulturmedium durch einen 40-Mikrometer-Filter geleitet, gefolgt von einem 30-Mikrometer-Filter.

Zentrifugiere das Filtrat bei 500 g für fünf Minuten und zentrifugiere das Supernatant bei 2000 g für 10 Minuten, um eventuelle Restzellen und Ablagerungen zu entfernen. Nachdem das resultierende Supernatant durch einen 0,8-Mikrometer-Filter gelaufen und das Filtrat in eine 15-Milliliter-Ultrafiltrationseinheit überführt wurde, zentrifugieren Sie bei 4000 g für 15 Minuten, um das Medium zu konzentrieren. Laden Sie die konzentrierte Probe auf eine Größenausschlusschromatographiesäule, die an einen automatischen Fraktionskollektor angeschlossen ist, und sammeln Sie die Fraktionen F1 bis F8.To führen Sie Western-Blot-Analyse durch, wobei jede Fraktion von 400 Mikrolitern auf 25 Mikroliter konzentriert wird.

Pipetten Sie 50 Mikroliter Radioimmunpräzipitations-Assaypuffer, ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren zum Konzentrat. Fügen Sie 75 Mikroliter zwei 2x SDS-Ladepuffer hinzu, um die Probe zu denaturieren und Proteine auf einem 4 % bis 12 % Tris-Glycin-Gel aufzulösen. Für die Nanopartikel-Tracking-Analyse werden extrazelluläre Vesikelproben mit 0,1 Mikrometer gefiltertem, sterilem PBS verdünnt und sanft vermischt.

Laden Sie die verdünnte Probe in das NTA-Instrument, das mit einer hochempfindlichen wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiterkamera und einem 532-Nanometer-Grünlaser ausgestattet ist. Stellen Sie die Detektion für Partikel zwischen 10 Nanometern und 1.000 Nanometern und innerhalb einer Konzentration von 10 Potenz von sechs bis zehn Potenz von neun Teilchen pro Milliliter ein. Fettvorläuferzellen von Stop-Flock-Flock/CD63GFP Mäusen zeigten unter der Konfokalmikroskopie keine nachweisbare grüne fluoreszierende Proteinpuncta.

Während die Zellen von AdipCD63-Mäusen zahlreiche markante grüne fluoreszierende Proteinpuncta im gesamten Zytoplasma aufwiesen. Die Analyse der Durchflusszytometrie zeigte, dass 1,2 % der Schädel-1-positiven Zellen in den Reportermäusen grünes fluoreszierendes Protein ausdrückten, verglichen mit 12,6 % bei AdipCD63-GFP-Mäusen. Westliche Blotting der Größenausschlusschromatographiefraktionen zeigte, dass die extrazellulären Vesikelmarker CD63 und HSP70 in den Fraktionen F1 und F2 angereichert waren. Während die Marker des endoplasmatischen Retikulums und der Mitochondrien fehlten, was die vesikale Reinheit bestätigte.

Die Analyse der Nanopartikel-Verfolgung zeigte, dass von Adipozyten abgeleitete extrazelluläre Vesikel eine Größe von 50 Nanometern bis 500 Nanometern hatten, und die Transmissionselektronenmikroskopie bestätigte, dass die Vesikel intakte Doppelmembranstrukturen aufwiesen. Western Blot bestätigte Knockout von STX4 in Adipozyten. Die konfokale Mikroskopie zeigte, dass CD63-GFP-positive Vesikel in Wildtyp-Adipozyten im gesamten Zytosol verteilt waren, sich jedoch in STX4-Knockout-Adipozyten in der Nähe der Plasmamembran ansammelten.

Die Konzentration der sekretierten, von Adipozyten abgeleiteten extrazellulären Vesikeln war in STX4-Knockout-Adipozyten im Vergleich zum Wildtyp signifikant reduziert. Westlicher Blot mit gleichen Proteinmengen intrazellulärer Vesikel zeigte eine reduzierte Expression von CD63 und CD81 in STX4-Knockout-Adipozyten im Vergleich zum Wildtyp. Das Protokoll bietet ein robustes und reproduzierbares System zur Untersuchung der EV-Sekretion von Adipozyten in vivo und in vitro sowie eine optimierte Methode zur EV-Reinigung von Adipozyten.

Das Protokoll beschreibt und validiert erstmals den Einsatz von seriellen langsamen Zentrifugationen in Kombination mit Größenausschlusschromatographie zur Reinigung von EVs, die aus reifen Adipozyten stammen. Unsere Ergebnisse ermöglichen es uns, neue Fragen darüber zu stellen, wie Adipozyten extrazelluläre Vesikel nutzen, um unter physiologischen und pathologischen Bedingungen mit anderen Zelltypen zu kommunizieren.