Name: Microfabrication der Chip-Größe Gerüste für die dreidimensionale Kultivierung der Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-12T19:12:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Lernen Sie die Mikrofabrikation poröser Polymer-Chips für die dreidimensionale Zellkultur. Diese Methoden vereinfachen die Herstellung und fördern die biologische Forschung.

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Die Autoren möchten sich Dirk Herrmann, Oliver Wendt, Siegfried Horn, Hartmut Gutzeit, und Jörg Bohn für ihre substantielle Hilfe über die Lösemitteldampf Schweißen danken. Darüber hinaus möchten wir Michael Hartmann, Alex Gerwald und Daniel Leisen für ihre technische Unterstützung zu bestätigen.

Prozess Sequence # 1: Hot Embossing, Bearbeitungs-und Solvent Vapour Welding Die CellChip in seine kubische Design ist durch Heißprägen oder Mikrospritzguss repliziert. Dafür verwenden wir eine mikromechanische Messing Form mit der inversen Geometrie des Chips. Die Container - in einer regelmäßigen Anordnung von bis bis 1156 Containern angeordnet - eine kubische Design mit einer Kantenlänge von 300 um. Für Heißprägen, ist die Replikation auf einem herkömmlichen WUM02 (Jenoptik Mikrotechnik, Deutschland) durchgeführt. Das Tool besteht aus zwei kreisförmigen Metallplatten. In einem ersten Schritt wird eine dünne PMMA-Platte (Lucryl, G77Q11, BASF) in der Mitte der unteren Platte des geöffneten Werkzeug eingelegt. Die mikrostrukturierten Formeinsatz ist mittig in der oberen Platte montiert. Dann wird das Werkzeug für die Evakuierung der Form geschlossen und auf eine Temperatur oberhalb der Glasübergangstemperatur des Polymers. Durch Drücken der Platten zusammen, ist das viskose Polymer in die evakuierte Hohlräume gedrückt, bis sie vollständig gefüllt sind genau die Replikation der Geometrie der Form. Nach dem Abkühlen des Werkzeugs, kann die mikrostrukturierte Polymer Teil entformt werden. Der Prozess erfordert mehr Polymermasse, als tatsächlich benötigt, um die Kavitäten zu füllen. Das Polymer Überschuss bildet eine Restschicht, die verwendet werden, um die Entformung des Teils erleichtern können. Um jedoch Poren mit einem Durchmesser kleiner als 3 um in den Boden der Container zu schaffen, hat die dicken Restschicht nach unten verdünnt werden, oder sogar komplett entfernt und durch eine poröse Membran abgelöst. Zur Vereinfachung des Prozesses der Pore Integration, ist die Rückseite der replizierten CellChip vollständig durch die Bearbeitung mit einem Diamanten Mühle entfernt. Hierzu werden die Teile auf einer gekühlten Montageplatte befestigt und zusätzlich die fragile Strukturen sind in VE-Wasser eingefroren, um sie vor Beschädigung zu schützen. In einem letzten Verfahrensschritt schließlich ein kommerzielles Ionen-track-geätzten Membran (Polycarbonat, Dicke 10 um, Porengröße 3 mu m, 2x10 6 Poren / cm ², Pieper Filter GmbH) ist auf der Rückseite des Arrays von Containern verbunden nun eröffnet sowohl auf oben und unten. Die Bonding-Prozess ist ein Lösungsmittel, Dampf-Schweißverfahren in einem gasdichten, beheizten Kammer [Abb. durchgeführt. 1], bestehend aus einem oberen Kolben und einer beweglichen unteren Platte mit integriertem Vakuum-Spannfutter. 4 Bis zu vier bearbeiteten CellChips und Track-geätzten Membranen sind parallel zu einer verdampfte Lösungsmittel ausgesetzt, nachdem die Kammer wurde evakuiert. Dann werden die Formteile und Membranen, die durch den oberen Kolben gepresst. Nach einer kurzen Exposition (&lt;15 s), wird die Kammer evakuiert wieder damit das Lösungsmittel entfernt. Aufgrund der kurzen Kontaktzeit, ist nur Oberfläche in der Nähe Material gelöst und eine Verformung des Bulk-Struktur durch die mechanische Belastung vermieden werden kann. Schließlich wird die Kammer geöffnet und das Lösungsmittel verschweißt CellChips entfernt werden können und bereit für die Zellkultur [Abb.. 2]. <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_7/Giselbrecht-Fig1.png" alt="Abbildung 1" width="100" /></a> Abbildung 1. <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_8/Giselbrecht-Fig2.png" alt="Abbildung 2" width="100" /></a> Abbildung 2. Prozessablauf # 2: Schwerionen-Bestrahlung, microthermoforming und verfolgen Ätzen (SMART-Prozess) Der neue Prozess namens SMART ist eine neu entwickelte Technologie zur Herstellung von Mikro-funktionalisierte Membran Mikrostrukturen. 5 Die Technologie auf einer mikrotechnischen Thermoformen, genannt &quot;microthermoforming&quot; beruht. 6,7 In dieser zentralen Prozessschritt, die aus der makroskopischen angepasst wurde gefangen Blatt Thermoformen wird ein erhitzter dünnen Polymerfilm in seiner erweicht, gummielastischen Zustand durch Gasdruck in einen Formhohlraum [Abb. gebildet. 3]. Im Gegensatz zu Heißprägen oder Spritzgießen, ist dieses Verfahren nicht eine primäre Bildung und das Polymer wird nicht geschmolzen. Aufgrund der Tatsache, dass der Film noch in einen festen Zustand mit einer dauerhaften Material Zusammenhalt gebildet, können wesentliche Änderungen mit hoher lateraler Auflösung zunächst auf planaren Polymerfilmen erzeugt werden und sind während der Umformung erhalten. Nach dem microthermoforming Schritt können diese Modifikationen weiter selektiv bearbeitet werden, zB durch nasschemische Behandlung. <img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_9/Giselbrecht-Fig3.png" alt="Abbildung 3" width="400" height="217" /> Abbildung 3 Die SMART-Prozess besteht im Prinzip aus drei Prozessschritte: <ol><li> Erstellung von hoch aufgelösten Modifikation Muster auf planaren dünner Polymerschichten in einem Pre-Prozess </li><li> 3D ShapIng. Filme von microthermoforming ohne Verlust der (Muster) Änderungen </li><li> Post-Prozess (optional) für eine endgültige Funktionalisierung von dünnwandigen Teilen mikrostrukturierten </li></ol> Die SMART Prozess, den wir derzeit geltenden sind für die Herstellung von porösen CellChips umfasst die folgenden Verfahrensschritte [Abb.. 4]. Ein dünner Polymerfilm, z. B. aus Polycarbonat (Pokalon OG461Gl, 50 um, LOFO High Tech Film GmbH, Deutschland), wird mit einem beschleunigten schweren Ionen (z. B. Xe, Au oder U-Ionen) an den Beschleunigeranlagen der GSI bestrahlt (Darmstadt, Deutschland) mit Energien von rd. 1 GeV und Einflüsse in der Größenordnung von 106 8 Nach dem Abkühlen des Werkzeugs können die dünnwandigen Teil entformt werden. Ionen / cm ². Wenn durchdringt den Film, produziert jedes Ion einer nahezu geraden Strecke von verändertem Material genannte latente Spur. Das vorbehandelte Filme werden dann auf ein Array von 25x25 dünnwandigen Mikrocontainer, jede mit einem Durchmesser und Tiefe von 300 um tiefgezogen. Der Prozess ist derzeit auf einem modifizierten Heißprägen drücken Sie [Abb. durchgeführt. 5], wo der Polymerfilm in zwischen zwei Metallplatten eingespannt ist. Die obere Platte wird mit der mikromechanischen Werkzeug ausgestattet und die untere enthält die Druck-und Vakuum-Anschlüsse. Der Film ist in zuvor evakuierten Mikrokavitäten der Form von Stickstoff mit einem Druck von bis zu 5 MPa gestreckt. Die Filme sind in der Nähe ihrer Glasübergangstemperatur verhindert track Glühen gebildet. <img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_10/Giselbrecht-Fig4.png" alt="Abbildung 4" width="400" height="119" /> Abbildung 4 <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_11/Giselbrecht-Fig5.png" alt="Abbildung 5" width="100" /></a> Abbildung 5 In einer post-Verfahren werden die Ionen-Tracks selektiv an Poren, die durch das Eintauchen des gesamten Gefüges in ein geeignetes Ätzmedium (zB 5 mol / l NaOH, 10% w / v MeOH) geätzt. Durch die Steuerung der Ätzzeiten und Ätzen Bedingungen, wie Konzentration, Temperatur und speziellen Additiven (zB etch-Promotoren), kann die Größe und Form der entstehenden Poren [Abb. eingestellt werden. 6]. <a href="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png"><img style="border: 1px solid black;" src="/files/ftp_upload/old/699_2008_5_12_12/Giselbrecht-Fig6.png" alt="Abbildung 6" width="100" /></a> Abbildung 6

<ol><li>Knedlitschek, G., Schneider, F., Gottwald, E., Schaller, T., Eschbach, E., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-like+culture+system+using+microstructures%3A+influence+of+extracellular+matrix+material+on+cell+adhesion+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A tissue-like culture system using microstructures: influence of extracellular matrix material on cell adhesion and aggregation.</a> J Biomech Eng. 121, 35-39 (1999).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmüller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Heckele, M., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+micro+molding+of+thermoplastic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+And+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Review on micro molding of thermoplastic polymers.</a> Journal of Micromechanics And Microengineering. 14, (2004).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Guber, A. E., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microthermoforming+as+a+novel+technique+for+manufacturing+scaffolds+in+tissue+engineering+%28CellChips%5BTitle%5D)+AND+%22IEE+Proc.-Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Microthermoforming as a novel technique for manufacturing scaffolds in tissue engineering (CellChips.</a> IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 151-157 (2004).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmüller, R., Weibezahn, K. -F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed Microdevices. 8, 191-199 Forthcoming.</li>
<li>Truckenmüller, R., Rummler, Z., Schaller, T., Schomburg, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+thermoforming+of+micro+fluidic+analysis+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Low-cost thermoforming of micro fluidic analysis chips.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 12, 375-379 (2002).</li>
<li>Truckenmüller, R., Giselbrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microthermoforming+of+flexible%2C+not+buried+hollow+microstructures+for+chip-based+life+sciences+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEE+Proc.-Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Microthermoforming of flexible, not buried hollow microstructures for chip-based life sciences applications.</a> IEE Proc.-Nanobiotechnol. 151, 163-166 (2004).</li>
<li>Fleischer, R. L., Price, P. B., Walker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+tracks+in+solids%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nuclear tracks in solids.</a> , University of California Press. Berkeley. Forthcoming.</li>
</ol>

Obwohl etablierten Methoden der Polymer Mikroreplikation, wie Mikro-Spritzguss oder Heißprägen, geeignet zur Herstellung von Mikrostrukturen sind, sind sie nicht wirklich effektiv bei der Herstellung von Mikrostrukturen mit einem integrierten und sehr kontrollierter Porosität, wie es für die CellChip benötigt. Sperrige Strukturen, zB erfordern kostspielige Bearbeitung der Wanddicke für eine anschließende Laser-Perforation reduzieren oder Wände sind vollständig von Track-geätzten Membranen ersetzt werden. SMART ist eine neue und viel verspre...

microfabrication der chip-größe gerüste für die dreidimensionale kultivierung der zellen

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Mit Mikro-Herstellungsverfahren ist eine Voraussetzung für Gerüste reproduzierbarer Geometrie und konstante Qualität für dreidimensionale Zellkultivierung zu schaffen. Diese Technologien bieten ein breites Spektrum von Vorteilen nicht nur für die Fertigung, sondern auch für verschiedene Anwendungen. Die Größe und Form der gebildeten Zellhaufen kann durch die exakte und reproduzierbare Architektur des mikrofabrizierten Gerüst und damit die Verbreitung Weglänge von Nährstoffen und Gasen können controlled.1 werden Dies ist zweifellos ein nützliches Instrument zur Apoptose und Nekrose verhindern beeinflusst werden Zellen auf eine unzureichende Nährstoff-und Gasversorgung oder Entfernung von zellulären Metaboliten. Unser Polymer-Chip, genannt CellChip hat die äußeren Abmessungen von 2 x 2 cm mit einer zentralen mikrostrukturierten Bereich. Dieser Bereich ist in einem Array von bis auf das Jahr 1156 Mikrocontainer mit einer typischen Dimension von 300 m Kantenlänge der kubischen Design (cp-oder CF-Chip) oder von 300 m Durchmesser und Tiefe für die runde Form (r-chip) unterteilt. 2 Bisher war Heißprägen oder Mikro-Spritzguss (in Kombination mit weiteren mühsamen Bearbeitung der Teile) für die Herstellung der mikrostrukturierten Chips verwendet. Grundsätzlich Mikrospritzguss einer der einzigen Polymer basierte Replikation Techniken, die bis jetzt in der Lage ist für die Massenproduktion von Polymer microstructures.3 jedoch ist, haben beide Techniken bestimmte unerwünschte Einschränkungen aufgrund der Verarbeitung einer viskosen Polymerschmelze mit der Erzeugung von sehr dünnen Wänden oder durch Löcher integriert. Im Falle der CellChip werden dünne Bodenschichten notwendig, um das Polymer zu perforieren und bieten kleinen Poren definierter Größe, um Zellen mit Kulturmedium z. B. die Lieferung von mikrofluidischen Perfusion der Behälter. Um diese Einschränkungen zu überwinden und die Herstellkosten wir einen neuen mikrotechnischen Ansatz entwickelt auf der Grundlage eines nach unten skaliert Tiefziehverfahren zu reduzieren. Für die Herstellung von hochporösen und dünnwandigen Polymer-Chips verwenden wir eine Kombination von schweren Ionen Bestrahlung microthermoforming und verfolgen Ätzen. In diesem so genannten &quot;SMART&quot;-Verfahren (Substrat Änderung und Replikation durch Thermoformen) dünner Polymerschichten mit energiereichen, schweren Geschossen von einigen hundert MeV Einführung sogenannter bestrahlt werden &quot;latente Spuren&quot; Anschließend wird der Film in einer gummielastischen Zustand in drei gebildet dimensionalen Teilen ohne Änderung oder Glühen des Tracks. Nach der Umformung, selektive Ätzen schließlich wandelt die Tracks in zylindrische Poren von einstellbaren Durchmesser.

Wir präsentieren zwei Prozesse für die Mikrofabrikation von porösen Polymer-Chips für dreidimensionale Zellkultivierung. Die erste ist Heißprägen mit einem Lösemitteldampf Schweißverfahren kombiniert. Die zweite nutzt ein neu entwickeltes microthermoforming Prozess mit Ionen-Track-Technologie führt zu einer wesentlichen Vereinfachung der Herstellung kombiniert.

Microfabrication der Chip-Größe Gerüste für die dreidimensionale Kultivierung der Zellen

Die Nutzung von Mikrofertigungstechnologien ist eine Voraussetzung für die Herstellung von Scaffolds mit reproduzierbarer Geometrie und konstanter Qualität für die dreidimensionale Zell...

Hallo, mein Name ist Stefan Re. Ich arbeite am Institut für Biologische Grenzflächen und im folgenden Artikel sehen Sie den Herstellungsprozess eines mikrostrukturierten Gerüsts namens Ship, wobei wir zwei verschiedene Methoden zur Produktion dieser Chips verwenden. Derzeit ein Herzprägeverfahren in Kombination mit bestimmten nachfolgenden Prozessen und ein Mikrothermoumformverfahren, das kürzlich hier im Forschungszentrum Squi entwickelt wurde. Und jetzt befinden wir uns in einem Reinraumzelt und was Sie hier auf der rechten Seite sehen, ist eine typische Vakuum-Heißlaminiermaschine, die wir für die Herstellung des mikrostrukturierten Zellchips verwenden. Zunächst führen wir eine mikrostrukturierte Form ein.Dies wird hier in einer solchen Platte montiert, und Sie können hier zwei Formen sehen. Diese Form wird durch Mikrozerspanung hergestellt und besteht aus Atemluft. Nun montiere ich die Mikrostrukturform in die Maschine.Für den Hotboxing-Prozess verwenden wir Polymerplatten wie diese hier und typischerweise Polycarbonat oder PMA zur Herstellung des Zellchips. Nun setzen wir die Polymerplatte in die Maschine, genau in die Mitte der Platte, und schließen das Werkzeug. Nach dem Sch

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine Chip-basierte Plattform für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen in Mikro-Bioreaktoren. Ein Chip kann bis zu 10 Mio. Zellen, die unter genau definierten Bedingungen im Hinblick auf die Strömung, Sauerstoffspannung etc. in einem sterilen, geschlossenen Kreislauf kultiviert werden können.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

In der Vergangenheit haben viele in-vitro-Kultur-Systeme - vor allem Monolayerkulturen - oft den Nachteil erlitten, dass differenzierte primären Zellen eine relativ kurze Lebensdauer hatten und während der Kultur de-differenziert. Als Folge davon wurden die meisten ihrer organ-spezifischen Funktionen verloren schnell. So, um bessere Bedingungen für diese Zellen in vitro zu vervielfältigen, haben Änderungen und Anpassungen zu herkömmlichen Monolayerkulturen worden.

Interview: Bioreaktoren und Aufgetaucht-Modified 3D-Gerüste für Stammzellforschung

In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie basiert, und wie diese Basistechnologie können modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und dreidimensionalen Kultur durchzuführen Paradigmen.

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Biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren können in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste eingebracht werden. Die hergestellten Selbstberichts Gerüste können für die in situ Überwachung von Mikroumgebungsbedingungen, während die Kultivierung von Zellen auf dem Gerüst verwendet werden. Dies ist vorteilhaft, da die 3D-Zellkonstrukt kann in Echtzeit, ohne den Versuch zu stören überwacht werden.

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In dieser Arbeit wird ein Herstellungsprotokoll für eine neue Art von Kultursubstrat mit Hunderten von Mikrobehältern promm2 vorgestellt, in dem Organoide kultiviert und mittels hochauflösender Mikroskopie beobachtet werden können. Die Zellimpf- und Immunfärbungsprotokolle sind ebenfalls detailliert.

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