Entwicklung mesenchymaler Stammzellmembran-umhüllte Nanovesikel zur verbesserten Genlieferung

In diesem Protokoll stellen wir eine Methode zur Herstellung von mesenchymalen Stammzell-abgeleiteten Nanovesikeln vor, die extrazellulären Vesikeln ähneln und AAVs für eine verbesserte Genabgabe kapseln. Wir nennen dies AAV-haltige Nanovesikel CME-AAVs. Im Vergleich zum aufkommenden Genliefervektor EV-AAV bieten CME-AAVs größere Flexibilität bei den Zellquellen und eine höhere Ausbeute.

Zu Beginn entferne das Kulturmedium aus einer Kulturschale mit menschlichen mesenchymalen Stammzellen bei 70 bis 90 % Konfluenz. Mit einem Zellschaber lösen Sie die Zellen von der Kulturschale ab und übertragen sie in ein konisches Rohr mit PBS. Zentrifugiere die gesammelten Zellen bei 300 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren.

Dann das Zellpellet zweimal mit PBS waschen und erneut zentrifugieren. Die Endzell-Pellets in PBS mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail erneut suspendieren. Anschließend wird die Zellsuspension drei Gefrier-Tau-Zyklen unterzogen, um die Plasmamembran zu stören und ein grobes Lysat zu erzeugen.

Mit einer Pipette homogenisieren Sie das Lysat gründlich. Zentrifugiere dann bei 1.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um Zellreste zu entfernen. Übertragen Sie das Supernatant in ein neues Rohr.

Zentrifugiere bei 18.000 g für eine Stunde bei vier Grad Celsius, um die Membranfraktion zu pelletieren. Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie die Membranpellet in PBS erneut, um die grobe mesenchymale Stammzellmembranfraktion zu erhalten. Homogenisieren Sie nun die Membranaufhängung, indem Sie sie nacheinander durch Spritzen mit 20 bis 27 Gauge Nadeln führen.

Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der homogenisierten Membransuspension mit einem Bicinconinsäure-Test. Aliquot die Federung und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis sie benötigt wird. Die Suspension nach jedem Auftauzyklus mit einer 27-Gauge-Spritze wieder homogenisieren.

Mischen Sie die vorbereitete Membransuspension mit adenoassoziiertem Virus, oder AAVs, im Verhältnis von 150 Mikrogramm Protein pro Eins mal 10 zu der Potenz von 10 Genomkopien. Die Mischung bei 37 Grad Celsius 30 Minuten lang mit sanftem Schütteln inkubieren lassen. Laden Sie die Membran- und Virusmischung in einen Mini-Extruder, der mit einer 400-Nanometer-Polycarbonatmembran ausgestattet ist.

Lassen Sie die Mischung 20 Mal durch den Extruder laufen, um die Verkapselung zu fördern. Ersetzen Sie die 400-Nanometer-Membran durch eine 200-Nanometer-Membran und wiederholen Sie die Extrudierung. Sammeln Sie die Prozesssuspension, die das gekapselte Virus enthält, zusammen mit dem ungekapselten Virus und leeren Vesikeln.

Sammeln Sie bei Bedarf mehrere Chargen zusammen und beginnen Sie sofort mit der Reinigung. Verdünnen Sie die Standard-Iodixanollösung mit 10x PBS und sterilem deionisiertem Wasser, um 40- und 25%-Lösungen herzustellen. Mit einer Pipette geben Sie einen Milliliter 40%-Iodixanol an den Boden eines 13,2-Milliliter-Rohrs mit offenem Decken, dünnwandigem Ultra-Clear-Rohr.

Anschließend werden drei Milliliter 25%-Iodixanol über die 40%-Schicht gelegt, um einen diskontinuierlichen Gradienten zu bilden. Vorsichtig sieben Milliliter der verarbeiteten Suspension auf den oberen Rand des Gefälle legen. Balancieren Sie die Röhren und laden Sie sie in einen Schwenkschaufel-Ultrazentrifugenrotor.

Zentrifugiere bei 150.000 g für drei Stunden bei vier Grad Celsius, mit schneller Beschleunigung und langsamer Verzögerung. Dann entferne die Schläuche vorsichtig, ohne den Farbverlauf zu stören. Sammeln Sie einen Milliliter-Anteil von oben nach unten in beschrifteten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren.

Halten Sie alle Fraktionen auf Eis. Identifizieren Sie nun die Fraktionen sieben und acht, die gereinigte CME-AAVs enthalten, in ein neues offenes Ultrazentrifugenrohr. Erhöhe das Volumen auf 11 Milliliter mit PBS.

Dann vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette vermischen. Mit schneller Beschleunigung und Verzögerung zentrifugieren Sie die gesammelten Fraktionen bei 150.000 g für drei Stunden bei vier Grad Celsius. Entsorge das Supernatant vorsichtig.

Je nach gewünschter Konzentration wird das Pellet in 50 bis 200 Mikrolitern sterilem PBS wieder suspendiert. Aliquot die gereinigte Vorbereitung. Lagern Sie dann bei 80 Grad Celsius bis zum weiteren Gebrauch.

Bereite Arbeitslösungen für das gekapselte Virus und Kontrollviren in sterilem PBS vor. Fügen Sie in jedem Bohrloch gleichmäßige Genomkopien eines kapselten Virus oder Kontrollvirus direkt in das Kulturmedium ein. Schließen Sie Negativkontrollbrunnen mit einem äquivalenten Volumen an PBS oder leeren Viruspartikeln ein.

Lassen Sie die Platte vorsichtig wirbeln, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, und inkubieren Sie je nach experimenteller Planung 24 bis 72 Stunden. Als Nächstes aspirieren Sie das Kulturmedium vorsichtig. Wasche die Zellen zweimal mit PBS, ohne sie zu lösen.

Färben Sie Kerne mit Hoechst 33342 gemäß den Herstelleranweisungen. Führen Sie Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtersätzen für verstärktes grünes fluoreszierendes Protein und Hoechst durch. Wählen Sie bei Bedarf 10- oder 20-fache Ziele zur Quantifizierung und 63x Objektive für hochauflösende Bildgebung.

Erfassen Sie mindestens fünf Sichtfelder pro Bohrloch, wobei identische Bildparameter verwendet werden. Speichern Sie alle Bilder in Raw- und Graustufenformaten für quantitative Analysen. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass CME-AAVs Größenabmessungen und membrangebundene Strukturen ähnlich wie extrazelluläre Vesikel aufwiesen.

Die Marker der mesenchymalen Stammzellmembranen, CD73 und CD90, wurden in CME-AAV mittels Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Die drei wichtigsten adenoassoziierten Virus-Kapsidproteine, VP1, VP2 und VP3, wurden in CME-AAV mit SDS-PAGE identifiziert. Die Analyse von NanoSight zeigte, dass CME-AAV9.

EGFP hatte einen mittleren Durchmesser von 128,6 Nanometern und eine Gesamtpartikelkonzentration von 1,32 mal 10 pro Milliliter. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte, dass CME-AAV9. EGFP führte zu einer deutlich höheren Expression der gesteigerten grünen fluoreszierenden Proteinexpression in HEK293T Zellen.

Das membranumhüllte Virus erreichte eine etwa 2,5-fach höhere Genexpression, was auf eine verbesserte zelluläre Aufnahme und potenziell eine verbesserte intrazelluläre Bewegung hindeutet. In vivo biolumineszenzbildende Verfahren zeigten, dass die Leber nach der Verabreichung von CME-AAV das stärkste lumineszente Signal zeigte. Quantitative Analyse der Leberregionen zeigte, dass die Verabreichung von CME-AAV zu signifikant höheren Genexpressionsniveaus führte.

Diese Protokolle beschreiben Schritte zur Gewinnung gereinigter zellmembranumhüllter AAVs, oder CME-AAV, mittels Extrusion und Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Zwei Schlüsselfaktoren erfordern sorgfältige Überlegung: Vorverarbeitung von Zellfragmenten für die Extrusion und Optimierung des Membranfragment-zu-AAV-Mischungsverhältnisses zur Kontrolle des CME-AAV-Teilchen-Genom-Verhältnisses. Zukünftige Studien können das Zellmembrangehäuse weiter erforschen, um den Immunschutz und die funktionellen Oberflächeneigenschaften zu verbessern und CME-AAV als vielseitige Plattform für die AAV-Übertragung zu optimieren.