In vitro Funktionelle Analyse regulatorischer T-Zellen: Fokus auf Proliferation und Differenzierung

Unser Labor untersuchte die Differenzierung, den Stoffwechsel und die Interaktion der T-Zell-Untergruppen. Treg affect T-Zell-Crosstalk, erhält die Immunhomöostase, was die Treg-Forschung für die Behandlung von Autoimmun- und Entzündungskrankheiten unerlässlich macht. Traditionelle in vitro Treg-Suppressions-Assays übersehen Treg-vermittelte Effekte und die Differentiation der Effektor-T-Zellen.

Dieses modifizierte Protokoll bewertet sowohl Proliferation als auch Polarisation gleichzeitig. Zu Beginn bereiten Sie naive T-Zellen, regulatorische T- oder Treg-angereicherte Zellen sowie antigenpräsentative, nicht CD4-positive Zellen vor. Zentrifugiere die naive CD4-positive T-Zell-Suspension bei 350 G für sieben Minuten bei vier Grad Celsius und entsorge den Supernatanten, um das Zellpellet zu erhalten.

Verdünnen Sie den Zellproliferationsfarbstoff eFluor 450 in PBS, um bei Raumtemperatur eine Konzentration von 20 Mikromolaren zu erhalten. Füge 0,5 Milliliter PBS pro eins mal zehn zur Leistung von sieben Zellen in die Röhre hinzu. Halten Sie das Rohr etwa 45 Grad geneigt und lassen Sie die Zellen vorsichtig durch 50-mal auf- und abpipettern wieder auf- und abhängen.

Anschließend wird ein gleiches Volumen der Zellproliferationsfarblösung schnell in die Zellsuspension gegeben, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren zu erhalten. Halte das Rohr in einem 45-Grad-Winkel und pipettiere die Zellen, um sie gründlich mit dem Zellproliferationsfarbstoff zu vermischen. Wickle das Zentrifugenrohr sofort mit Alufolie um, um Lichteinwirkung zu vermeiden.

Inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur und lassen Sie sie alle fünf Minuten sanft vortexen, um eine Zellansammlung zu verhindern. Gib als Nächstes 10 Milliliter vorgekühltes Zellkulturmedium in das Zentrifugenrohr und wirbel die Zellen vorsichtig vor, um die Färbung zu beenden. Dann zentrifugiere die Zellen und entsorge das Supernatant.

Um die Zellen zu waschen, geben Sie fünf Milliliter vorgekühltes Zellkulturmedium zum Zellpellet. Wiederholen Sie die Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Kulturmedium. Nach der Zellzählung zentrifugieren Sie die Zellen und setzen sie in einem geeigneten Volumen Kulturmedium wieder auf, um eine Zellkonzentration von zweimal zehn auf die Leistung von sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen.

Lass das Rohr auf Eis. Berechnen Sie die Anzahl der für die Zellkultur benötigten Proben. Bereiten Sie eine angemessene Menge Zellkulturmedium mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Anti-Maus-CD3-Antikörper oder geeigneten Induktionszytokinen vor.

Nimm vorbereitete naive T-Zellen und mit Treg angereicherte Zellen und wirbel sie vortex. Fügen Sie 100 Mikroliter CD45.2-positive, CD4-positive, naive T-Zellen und 100 Mikroliter CD4.1-positive, APC-angereicherte nicht-CD4-positive Zellen zur 48-Well-Platte hinzu. Übertragen Sie 100 Mikroliter CD45.1-positive, CD4-positive, CD25-positive Treg-angereicherte Zellen in die Versuchsbohrungen und 100 Mikroliter Zellkulturmedium in die Kontrollbohrungen.

Anschließend pipettiert man 100 Mikroliter Kulturmedium mit einem Antimaus-CD3-Antikörper und 100 Mikroliter Kulturmedium mit den geeigneten Induktionszytokinen in jedes Bohrloch. Geben Sie PBS in die übrigen leeren Brunnen, um die Luftfeuchtigkeit der Platte zu erhalten und die Kanteneffekte zu verringern. Inkubieren Sie die 48-Brunnen-Platte in einem 5%-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für drei Tage.

Pipettieren Sie die kultivierten Zellen vorsichtig, um sie wieder zu suspendieren, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr. Zentrifugiere die Zellen und entferne das Supernatant. Fügen Sie 500 Mikroliter Zellkulturmedium mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat, Ionomycin und GolgiPlug Protein-Transportinhibitor zu jedem Röhrchen hinzu.

Vortexen Sie die Zellen vorsichtig, um die Zellen wieder zu suspendieren, und sie in einem 5%-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für drei Stunden auszubrüten. Nach der Zentrifugation fügen Sie 50 Mikroliter PBS mit einem Test des Zombie-gelben Farbstoffs und 1:100 verdünnten Antimaus-CD16 oder 32 Antikörpern zum Pellet hinzu. Wirbeln die Proben und brüten sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, um tote Zellen zu markieren und FC-Rezeptoren zu blockieren.

Zentrifugiere die Zellen, bevor du das Supernatant entsorgst. Füge der Probe 50 Mikroliter Oberflächenantikörpercocktail hinzu, wirbel sie vortex und brüte 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Dann fügen Sie jedem Zentrifugenröhrchen einen Milliliter fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder FACS-Puffer hinzu.

Nach Zentrifugation und Supernatantenentfernung geben Sie 300 Mikroliter Fixations- und Permeabilisierungslösung zu jedem Zentrifugenrohr und lassen die Proben vortexen. Inkubieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius im Dunkeln für 20 Minuten. Übertragung auf Milliliter Permeabilisierung und Waschpuffer auf jede Zentrifugenröhre, gefolgt von Zentrifugation und Entfernung von Supernatanten.

Nach dem Wiederholen des Waschs geben Sie 50 Mikroliter Zytokin-Antikörper-Cocktail zu jeder Probe und lassen Sie die Proben vortexen. Inkubieren Sie die Proben 40 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Waschen Sie jede Probe mit einem Milliliter Permeabilisierung und Waschpuffer.

Zentrifugiere die Zellen und entferne das Supernatant. Das Zellpellet in 300 Mikrolitern FACS-Puffer wieder suspendieren. Messen Sie die Proliferation und Differenzierung von Responder-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie.

Gate die Lymphozytenpopulation unter den gesamten Zellen, um Zellreste und Verunreinigungen auszuschließen. Wählen Sie die Einzelzellpopulation unter den Lymphozyten basierend auf Streusignalen aus. Anschließend identifiziert man die lebende Zellpopulation unter den einzelnen Zellen, gefolgt von der CD4-positiven T-Zellpopulation unter den lebenden Zellen.

Anschließend wird die CD45.1-Population mit positiver regulatorischer T-Zelle und die CD45.2-positive Effektor-T-Zell-Population unter den CD4-positiven T-Zellen gegatet. Wählen Sie dann die CD45.2-positiven CD4-positiven Interferon-Gamma-positiven T-Helferen-1-Zellen, CD45.2-positive CD4-positive Interleukin-17A-positiven T-Helferzellen 17 sowie die nicht-proliferierten CD4.2-positiven CD4-positiven T-Zellen unter den CD45.2-positiven T-Zellen aus. Führen Sie die Erfassung von Flowzytometriedaten für alle Proben durch.

Analysieren Sie schließlich die Durchflusszytometriedaten mit der FlowJo-Software unter Verwendung derselben Gating-Strategie wie bei der Erfassung von Flusszytometriedaten. Die Häufigkeit nicht-proliferatierter Responder-T-Zellen wurde sowohl unter T-Helfer-1- als auch T-Helfer-17-Induktionsbedingungen nach Kokulturierung mit regulatorischen T-Zell-angereicherten Zellen signifikant erhöht. Die Differenzierung von CD45.2-positiven, CD4-positiven Interferon-Gamma-, positiven T-Helfer-1-Zellen wurde nach Kokultur mit regulatorischen T-Zell-angereicherten Zellen signifikant unterdrückt.

Die Häufigkeit von CD45.2-positiven, CD4-positiven Interleukin-17A-positiven T-Helfer-17-Zellen stieg, wenn Responder-T-Zellen mit regulatorischen T-Zellen-angereicherten Zellen kultiviert wurden. Die in-vitro-funktionale Analyse von Treg-Zellen ermöglicht die Untersuchung biodirektionaler Effekte zwischen Treg- und Effektor-T-Zellen auf Proliferation und Polarisation. Die größte Herausforderung bei der Durchführung dieses Protokolls besteht darin, die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten und gleichzeitig die Reinheit der Treg-Zellen und der naiven T-Zellen zu gewährleisten.

Nach diesem Prozess können ELISA und andere biomedizinische Assays die Produktion von Zytokinen und metabolischen Effektoren bewerten, während FACS-sortierte Zellen eine nachgelagerte RNA-Seq- und Proteomikanalyse ermöglichen.