A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue

Hallo, ich bin Amish Matan und ich komme aus dem Labor von Dr. Sha Mc Barian hier in der Psychiatrieabteilung der UMass Medical School. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur Chromatin-Immunpräzipitation in postmortalem menschlichem Hirngewebe. Das folgende Verfahren ist jedoch nicht sehr kompliziert.

Das Spannendste ist, dass sich Expressionsstudien im menschlichen Gehirn bis vor kurzem auf die einfache Quantifizierung von mRNA und Protein beschränkten. Diese spezielle Technik wird uns ein besseres Verständnis der mechanistischen Grundlagen der Genexpression sowohl im normalen als auch im kranken menschlichen Gehirn ermöglichen. Fangen wir also an: Um Chromatin immunauszufällen.

Wir begannen mit zuvor präpariertem postmortalem menschlichem Hirngewebe. Es ist wichtig, eine Schutzbrille zu tragen und in einem dafür vorgesehenen Bereich für den Umgang mit menschlichem Gewebe zu arbeiten. Bei der Verarbeitung dieser Proben wird das Hirngewebe mit dem fünffachen Hirnvolumen des Daunenpuffers abgesenkt.

Sobald das gesamte Gewebe in der Lösung homogen geworden zu sein scheint, können wir es in ein Zwei-Mil-Röhrchen übertragen, nachdem das Gewebe homogenisiert wurde. Geben Sie fünf Einheiten Mikrokocal-Nuklease pro mil in die Probe und mischen Sie die Lösung, indem Sie auf und ab pipettieren. Dann auf Eis legen.

Es ist wichtig, den Schritt schnell zu machen. Denn die mikrokokale Nuklease hat die Fähigkeit, sogar bei vier Grad Celsius zu wirken. Sobald alle Proben mit Mikrokokalnuklease behandelt wurden, begeben wir uns schnell in das 37 Grad Celsius heiße Wasserbad und inkubieren die Proben sieben Minuten lang.

Nach der siebenminütigen Inkubation fügen wir 0,5 molare EDTA zu einer Konzentration von 10 Millimol hinzu, um die Aktivität der mikrokokalen Nuklease zu stoppen. Jetzt sind wir also bereit, mit dem Digitalisierungsschritt fortzufahren. Nachdem wir die Mikrokokal-Nuklease behandelt haben, beginnen unsere Proben, die unsere nukleosomale DNA enthalten, mit der Isierung.

Nava nimmt ein 15-mil-Falcon-Röhrchen auf, in das wir 4,5 mil 0,2 millimolare EDTA, 2,5 Mikroliter 0,2 molare Benadin und 4,5 Mikrogramme 0,1 molare PMSF in dieses Röhrchen geben. Wir werden unsere Probe übertragen. Jetzt inkubieren wir unsere Probe eine Stunde lang auf Eis, während wir sie alle 10 Minuten vortexen.

Am Ende der einstündigen Inkubation werden wir 2,5 Mikroliter dreimolares DTT hinzufügen. Die Probe wird erneut vortext und dann in einem Ausschwingrotor bei 3.175 RCF für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verteilt, so dass 500 Mikroliter als Eingangskontrolle verwendet werden, die nur genomische DNA enthalten würden, und der Rest wird in zwei Röhrchen mit jeweils 1.600 Mikrolitern Probe aufgeteilt, die unsere Chromatin-Immunpräzipitationsproben sein werden.

Der Eingangsregler wird bis zur weiteren Nutzung über Nacht auf minus 80 Grad Celsius eingestellt. Als nächstes fügen wir 160 Mikroliter 10 XFSB hinzu, ein Zehntel des Volumens unserer Probe. Dazu fügen wir vier Mikrogramm des Antikörpers hinzu.

Wirbeln Sie nun die Proben vor und drehen Sie sie dann über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation über Nacht werden wir das Protein Giros waschen, das zur Isolierung unserer nukleosomalen DNA verwendet wird. Da diese Agro-Kügelchen sehr empfindlich sind, ist es notwendig, die Köpfe der Pipettenspitzen abzuschneiden, wenn man mit ihnen arbeitet.

Damit soll sichergestellt werden, dass die Kügelchen beim Pipettieren mehr Platz haben. Geben Sie nun 1,6 mil einer XFS-Kugel zu 245 Mikrolitern Protein-Jaguars in ein zwei mil Mikrozentrifugenröhrchen. Dies sollte für vier Röhrchen Probe ausreichen.

Trennen Sie anschließend die Bead-Lösung in zwei Röhrchen mit je zwei mil und füllen Sie jeweils bis zu 1,6 mil mit einem XFSB nach. Drehen Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur 30 Sekunden lang auf einem Rotator und zentrifugieren Sie sie dann 30 Sekunden lang bei 0,1 RCF. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das ATE mit einem Vakuum.

Fügen Sie 1,6 mils eines XFSB hinzu. Drehen Sie die Proben erneut 30 Sekunden lang auf einem Rotator und zentrifugieren Sie sie dann erneut 30 Sekunden lang bei 0,1 RCF FS. Nach der Zentrifugation entfernen wir den Überstand wieder und kombinieren beide Röhrchen mit 1,5 mil eines XFSB.

Fügen Sie auch 15 Mikroliter Spermien-DNA hinzu. Drehen Sie nun 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann 30 Sekunden lang bei 0,1 RCF. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter eines XFSB hinzu.

Geben Sie nun 90 Mikroliter Agro-Geschwindigkeiten in jede Chromatin-Fällungsprobe und drehen Sie sie dann eine Stunde lang um vier Grad. Für eine Negativkontrolle geben Sie 1 mil eines XFSB in die verbleibenden Acro-Geschwindigkeiten und drehen sie zusammen mit der Chromatin-Immunpräzipitationsprobe eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Während der einstündigen Inkubation können wir die Gelegenheit nutzen, um einen frischen Auflösungspuffer zu erstellen.

Dies wird später im Experiment nach der einstündigen Länge verwendet. In der Inkubationszentrife werden die Proben und eine Negativkontrolle bei 0,1 CFS für 30 Sekunden durchgeführt und der Überstand wird verworfen. Als nächstes waschen wir die Kügelchen mit vier verschiedenen Arten von Waschlösungen, einem salzarmen Waschpuffer, einem salzreichen Waschpuffer, einer Lithiumchloridlösung und schließlich einem TE-Puffer mit einem pH-Wert von acht.

Für jeden Puffer mit Ausnahme der Lithiumchloridlösung drehen wir die Proben drei Minuten lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren sie dann 30 Sekunden lang bei 0,1 R Cs. Für die Lithiumchlorid-Wäsche drehen Sie die Proben nur eine Minute lang bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie nach jedem Waschen das Supinat und verwenden Sie ein Vakuum.

Jetzt sind wir bereit, mit der Eluierung unserer Samples fortzufahren. Um den Elutionsschritt zu beginnen, fügen wir jeder Probe 250 Mikroliter frisch zubereiteten elu-Puffer hinzu. Drehen Sie die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und dann eine Minute lang bei 0,4 RCF.

Bewahren Sie nun den Überstand in einer zwei Mil Orang Röhre auf. Geben Sie dann 250 Mikroliter Evolutionspuffer zu jeder Probe. Wirbeln Sie sie alle wieder einige Sekunden lang von Hand ein.

Dann die Proben 15 Minuten lang wirbeln, nachdem sie 15 Minuten lang vortexiert wurden, drehen Sie die Röhrchen in der Zentrifuge. Fügen Sie 16 RCF für vier Minuten hinzu und bewahren Sie die Schlinge in demselben Oring-Rohr mit zwei Mühlen auf. Um das Protein in unseren Proben zu verdauen, geben Sie zunächst 10 Mikroliter 0,5 molare A DTA, 25 Mikroliter 0,8 molare Twist HCL L bei einem pH-Wert von 6,5 und 2,5 Mikroliter 10 Milligramm pro Milli Proteinase K zu jeder Chromatin-Immunpräzipitationsprobe.

Neben jeder Eingangskontrolle werden 15 Mikroliter Lysepuffer und 2,5 Mikroliter 10 Milligramm pro ml zugegeben. Proteinase K inkubiert sowohl Eingangs- als auch Chromatin-Immunpräzipitationsproben mindestens drei Stunden lang bei 52 Grad Celsius. Jetzt, da die dreistündige Inkubation vorbei ist, können wir mit der Extraktion von Phenylchlor-Fromm beginnen.

Nach der dreistündigen Inkubation fügen wir jeder Probe 500 Mikroliter Phenylchlor Fromm hinzu. Dies geschieht in der Haube aufgrund der Tatsache, dass Phenylchloroform eine organische Chemikalie ist, die sowohl schädlich ist, wenn sie mit der Haut in Berührung kommt, als auch einatmet. Als nächstes wirbeln wir alle Proben mehrere Sekunden lang vor und zentrifugieren sie nach der Zentrifugation fünf Minuten lang bei 13 RCF.

In den Röhrchen sollten zwei Phasen vorhanden sein. Da wir uns für den Inhalt der oberen Phase interessieren, nehmen wir die obere Phase heraus und geben sie in ein zwei mil Mikro-Zentimeter-Röhrchen. Als nächstes wird jeder Probe eine Mischung aus zwei Mikrolitern Glykogen und 50 Mikrolitern drei molaren Natriumacetat zusammen mit 1,375 mil hundertprozentigem Ethanol zugesetzt.

Alle Proben werden kräftig vortex und über Nacht bei minus 80 Grad Celsius abgesetzt. Nach der Inkubation über Nacht werden die Proben zum Auftauen auf Eis gelegt. Sie sind dicht zentrifugiert bei 15 RCF für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig das SUP-Natin, ohne das Pellet am Boden des Röhrchens zu stören. Als nächstes fügen Sie jeder Probe eine mil kaltes, 75%iges Ethanol hinzu und invertieren Sie sie alle vier- bis sechsmal. Die Röhrchen werden dann wieder bei 18 RCF für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifiert.

Der Überstand wird wieder entfernt und die Pellets werden an der Luft trocknen gelassen. Sobald die Pellets getrocknet sind, werden sie in 50 Mikrolitern mit vier Millimolaren Spuren HCL von PH acht aufgelöst und bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Bis zur weiteren Verwendung, nun, ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man Chromatin-Immunfällungen an gefrorenem menschlichem postmortalem Hirngewebe durchführt.

Und denken Sie daran, dass es bei diesem Verfahren wichtig ist, alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, wenn Sie mit menschlichem Gehirngewebe, Chromatin und Immunpräzipitationsassays umgehen, um eine zusätzliche Ebene des Verständnisses der Genexpression sowohl im normalen als auch im kranken menschlichen Gehirn hinzuzufügen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.