A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue

Hallo, ich bin Amish Matan und komme aus dem Labor von Dr. Sha Mc Barian in der Psychiatrieabteilung der UMass Medical School. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur Chromatin-Immunpräzipitation an postmortalen menschlichen Hirngeweben. Obwohl das folgende Verfahren nicht sehr kompliziert ist.

Am aufregendsten ist, dass Ausdrucksstudien im menschlichen Gehirn bis vor Kurzem auf die einfache Quantifizierung von mRNA und Protein beschränkt waren. Diese spezielle Technik wird uns ein besseres Verständnis der mechanistischen Grundlagen der Genexpression sowohl im gesunden als auch im erkrankten menschlichen Gehirn vermitteln. Beginnen wir also mit der Immunpräzipitation von Chromatin.

Wir begannen mit zuvor präpariertem, in gefrorenem Zustand konserviertem postmortalem menschlichen Hirngewebe. Es ist wichtig, Schutzbrille zu tragen und in einem dafür vorgesehenen Bereich mit menschlichem Gewebe zu arbeiten. Bei der Aufbereitung dieser Proben wird das Hirngewebe mit dem Fünffachen des Gehirnvolumens an Down-Sink-Puffer versetzt.

Sobald das gesamte Gewebe in der Lösung homogen erscheint, kann es nach der Homogenisierung in eine 2-ml-Röhrchen überführt werden. Geben Sie fünf Einheiten pro ml Mikrokokken-Nuklease zur Probe hinzu und mischen Sie die Lösung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Anschließend auf Eis stellen.

Es ist wichtig, diesen Schritt schnell durchzuführen, da Mikrokokken-Nuklease bereits bei vier Grad Celsius aktiv sein kann. Sobald alle Proben mit Mikrokokken-Nuklease behandelt wurden, bringen wir sie umgehend in das 37-Grad-Celsius-Wasserbad und inkubieren die Proben sieben Minuten lang.

Nach der siebenminütigen Inkubation geben wir 0,5 M EDTA auf eine Endkonzentration von 10 Millimol hinzu, um die Mikrokokken-Nuklease-Aktivität zu stoppen. Nun sind wir bereit, mit dem Fragmentierungsschritt fortzufahren. Nach der Behandlung mit Mikrokokken-Nuklease beginnen unsere Proben, die die nukleosomale DNA enthalten, mit der Fragmentierung.

Nava nimmt ein 15-ml-Falcon-Röhrchen, in das wir 4,5 ml 0,2 Millimolar EDTA, 2,5 µl 0,2 M Benadin und 4,5 µl 0,1 M PMSF hinzufügen. Anschließend geben wir unsere Probe hinzu. Nun inkubieren wir die Probe eine Stunde lang auf Eis, wobei wir alle 10 Minuten vortexen.

Am Ende der einstündigen Inkubation geben wir 2,5 Mikroliter dreimolaren DTT hinzu. Die Probe wird erneut vortexiert und anschließend in einem Schwenkköpfenrotor bei 3.175 RCF für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand aufgeteilt, sodass 500 Mikroliter als Input-Kontrolle verwendet werden, die ausschließlich genomische DNA enthalten soll, und der Rest auf zwei Röhrchen aufgeteilt wird, die jeweils 1.600 Mikroliter Probe enthalten und unsere Chromatin-Immunpräzipitationsproben darstellen werden.

Die Eingangskontrolle wird über Nacht bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt, bis sie weiterverwendet wird. Anschließend geben wir 160 Mikroliter 10×FSB, das einem Zehntel des Volumens unserer Probe entspricht, hinzu. Zusätzlich werden vier Mikrogramm des Antikörpers zugegeben.

Vortexen Sie nun die Proben und drehen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Übernacht-Inkubation waschen wir die Protein-Giros, die zur Isolierung unserer nukleosomalen DNA verwendet werden. Da diese Agro-Perlen sehr empfindlich sind, ist es notwendig, die Spitzen der Pipettenspitzen abzuschneiden, wenn damit gearbeitet wird.

Dies stellt sicher, dass die Kügelchen beim Pipettieren mehr Platz haben. Geben Sie nun 1,6 mils einer XFS-Kügelchenlösung zu 245 Mikrolitern der Protein-Jaguare in ein zwei-mil-Mikrozentrifugenröhrchen. Dies sollte für vier Probenröhrchen ausreichen.

Als Nächstes teilen Sie die Perlenlösung auf zwei 2-µL-Röhrchen auf und füllen jedes mit 1× FSBA bis zu einem Gesamtvolumen von 1,6 µL auf. Rotieren Sie die Röhrchen 30 Sekunden bei Raumtemperatur auf einem Rotator und zentrifugieren Sie sie anschließend 30 Sekunden bei 0,1 × g. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das ATE mittels Vakuum.

Fügen Sie 1,6 ml eines XFSB hinzu. Drehen Sie die Proben erneut 30 Sekunden lang auf einem Rotator und zentrifugieren Sie sie anschließend erneut 30 Sekunden bei 0,1 RCF FS. Nach der Zentrifugation entfernen wir erneut den Überstand und kombinieren beide Röhrchen mit 1,5 ml eines XFSB.

Fügen Sie außerdem 15 Mikroliter Spermien-DNA hinzu. Drehen Sie nun 30 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie anschließend 30 Sekunden bei 0,1 × g. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 200 Mikroliter eines 1× FSB zu.

Geben Sie nun 90 Mikroliter Agro Speeds in jede Chromatinpräzipitationsprobe und rotieren Sie diese eine Stunde lang bei vier Grad. Als negativen Kontrollversuch geben Sie 1 Milliliter 1 XFSB zu den verbleibenden Agro Speeds hinzu und rotieren diese gemeinsam mit der Chromatin-Immunpräzipitationsprobe eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Während der einstündigen Inkubation können wir die Gelegenheit nutzen, frischen Lösungspuffer herzustellen.

Dies wird später im Experiment nach der einstündigen Inkubation verwendet. Zentrifugieren Sie die Proben und die negative Kontrolle bei 0,1 CFS für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand. Anschließend waschen wir die Kügelchen mit vier verschiedenen Waschlösungen: einem Puffer mit niedriger Salzkonzentration, einem Puffer mit hoher Salzkonzentration, einer Lithiumchloridlösung und abschließend mit TE-Puffer bei pH 8.

Für jeden Puffer mit Ausnahme der Lithiumchloridlösung werden wir die Proben drei Minuten bei Raumtemperatur rotieren lassen und anschließend 30 Sekunden bei 0,1 R Cs zentrifugieren. Für die Lithiumchlorid-Waschung rotieren Sie die Proben nur eine Minute bei Raumtemperatur. Nach jeder Waschung entsorgen Sie das Überstand und verwenden Sie ein Vakuum.

Jetzt sind wir bereit, mit der Elution unserer Proben fortzufahren. Um den Elutionsschritt zu beginnen, geben wir 250 µL frisch hergestellten Elupuffer zu jeder Probe hinzu. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren und zentrifugieren Sie anschließend eine Minute bei 0,4 ×g.

Speichern Sie nun das Überstand in einem 2-ml-Orangefarbenen Röhrchen. Geben Sie anschließend 250 µL Evolutionspuffer zu jeder Probe hinzu. Vortexen Sie alle erneut von Hand für einige Sekunden.

Dann die Proben nach 15-minütigem Vortexen weitere 15 Minuten vortexen und die Röhrchen in der Zentrifuge spinnen. Bei 16 RCF vier Minuten zentrifugieren und den Überstand in dem gleichen 2-Milliliter-Röhrchen aufbewahren. Um die Proteine in unseren Proben abzubauen, zunächst 10 Mikroliter 0,5 Molar A DTA, 25 Mikroliter 0,8 Molar Twist HCL L mit einem pH-Wert von 6,5 und 2,5 Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter Proteinase K zu jeder Chromatin-Immunpräzipitationsprobe hinzufügen.

Neben jede Eingangskontrolle 15 µL Lysepuffer und 2,5 µL Proteinase K (10 mg/mL) geben. Inkubieren Sie sowohl die Input- als auch die Chromatin-Immunpräzipitationsproben bei 52 °C für mindestens drei Stunden. Da die dreistündige Inkubation nun abgeschlossen ist, können wir fortfahren und mit der Phenyl-Chloroform-Extraktion beginnen.

Nach der dreistündigen Inkubation geben wir 500 µL Phenylchloroform zu jeder Probe hinzu. Dies erfolgt im Abzug, da Phenylchloroform eine organische Chemikalie ist, die sowohl bei Hautkontakt als auch bei Inhalation schädlich ist. Anschließend werden alle Proben mehrere Sekunden lang verwirbelt und nach der Zentrifugation fünf Minuten lang bei 13 ×g zentrifugiert.

Es sollten sich zwei Phasen in den Röhrchen befinden. Da wir an dem Inhalt der oberen Phase interessiert sind, entnehmen wir diese und geben sie in ein 2-µL-Mikrozentrifugenröhrchen. Anschließend wird jeder Probe eine Mischung aus zwei Mikrolitern Glykogen und 50 Mikrolitern dreimolarer Natriumacetatlösung sowie 1,375 mL hundertprozentigen Ethanol zugegeben.

Alle Proben werden gründlich verwirbelt und über Nacht bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Nach der Übernacht-Inkubation werden die Proben auf Eis gestellt, um sie aufzutauen. Anschließend werden sie bei vier Grad Celsius mit 15 RCF zehn Minuten lang dicht zentrifugiert.

Nach der Zentrifugation vorsichtig das Überstandsmilieu entfernen, ohne den Pellet am Boden des Röhrchens zu stören. Danach ein Milliliter kalten, 75%igen Ethanol zu jeder Probe hinzufügen und alle Röhrchen vier- bis sechsmal vorsichtig umstülpen. Die Röhrchen werden anschließend erneut bei 18 ×g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Das Überstand wird erneut entfernt und die Pellets dürfen an der Luft trocknen. Sobald die Pellets trocken sind, werden sie in 50 Mikrolitern vier Millimolarer Spuren-HCl mit einem pH-Wert von acht gelöst und bei minus 80 Grad Celsius gelagert, bis sie weiterverwendet werden. Nun, ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man Chromatin-Immunpräzipitationen an gefrorenem menschlichem postmortalem Hirngewebe durchführt.

Und denken Sie daran, bei dieser Prozedur alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen zu beachten, wenn mit menschlichem Hirngewebe umgegangen wird. Mit Chromatin-Immunpräzipitations-Assays kann ein zusätzlicher Erkenntniszuwachs über die Genexpression sowohl im gesunden als auch im erkrankten menschlichen Gehirn erzielt werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.